Telesný tréning inhibuje tvorbu fibrózy pri Alzheimerovej chorobe Obličky ovplyvňujúce signálne dráhy TGFB

edmund.chen@wecistanche.com

ÚVOD 

Alzheimerova choroba (AD) je najčastejšou formou demencie, ale o jej systémovom vzhľade sa začalo hovoriť až v posledných desaťročiach. Hoci sa vynaložilo veľké úsilie na vývoj liekov a terapií modifikujúcich ochorenie, dodnes nie sú k dispozícii žiadne liečebné postupy [1–3]. Tvorba amyloidných plakov a abnormálna funkcia amyloidných proteínových prekurzorov (APP) sa považujú za prvé príznaky ochorenia nielen v centrálnom nervovom systéme (CNS), ale aj na periférii [4]. Presvedčivé dôkazy podporujú kľúčovú úlohu amyloidu-B (AB) v patogenéze AD [5] poukazujúc na to, že znížený klírens AB je jedným z kľúčových procesov v patomechanizme. Pri AD je postihnutých niekoľko periférnych orgánov ako semenník [5], pankreas [6] aobličky[7], zdôrazňujúc vývoj komplexného systémového ochorenia s viacerými cieľmi [8]. Bolo dokázané, žeobličkysa podieľa na klírensu AB [9]. Okrem toho je sérová koncentrácia AB významne zvýšená u chronických pacientovochorenie obličiek (CKD) pacientov [10, 11]. Akumulácia AB bola preukázaná aj vobličky[12], čo vedie k poruche filtrácie. Správna filtrácia je čiastočne regulovaná transformujúcim rastovým faktorom B (TGFB), ktorý je hlavným cytokínom v patogenézeobličkovézápalu a fibrózy [13] a je tiež známy ako dôležitý faktor v patogenéze AD [14]. Pri AD hrá TGFB signalizácia úlohu v mikrogliálnej aktivácii a neuroprotekcii sprostredkovanej astrocytmi [15]. Okrem toho zmenená expresia TGFB ovplyvňuje aj zápal v CNS a periférnych tkanivách [13, 16].

CISTANCHE ZLEPŠÍ OCHORENIE OBLIČIEK/OBLIVÍN

TGFB má tri izoformy: TGFB1, TGFB2 a TGFB3 [17]. TGFB1 sa podieľa na niekoľkých procesoch, ako je vývoj plodu, kontrola bunkového rastu a diferenciácie, fibróza a tvorba jazvového tkaniva, rast nádoru a imunitná odpoveď [18]. Je dôležitým cytokínom pri tvorbe fibrózy v rôznych orgánoch, ako je pečeň aobličky[19]. TGFB1 tvorí diméry, ktoré sa najprv viažu na receptor TGFB typu II (TGFRII), potom aktivujú Ser/Thr kinázu receptora TGFB typu I (TGFRI), čím sa iniciuje tvorba intracelulárneho signálneho komplexu - tvorba transkripčných faktorov Smad. V kanonickej signálnej dráhe TGFB sú transkripčné faktory Smad2/3 fosforylované a po vytvorení komplexu so Smad4 sa translokujú do jadra [20]. Aktiváciou TGFB1 môže byť ovplyvnených niekoľko génov, pretože indukuje expresiu rôznych kolagénov, riadi bunkovú proliferáciu, ovplyvňuje apoptózu [20] a reguluje expresiu matrix metaloproteinázy (MMP) [21]. Nekanonická signálna dráha TGFB iniciuje aktiváciu MAPK fosforyláciou, ktorá zase môže indukovať ďalšiu expresiu TGFB [22]. JNK a p38 kinázy ako ciele TGFB sú identifikované vobličkovéfibrózy a regulujú apoptózu [23].

Ukázalo sa, že fyzická aktivita má u ľudských pacientov priaznivé účinky. Cvičenie môže regulovať a oddialiť manifestáciu AD [24, 25] a bola tiež hlásená redukcia biomarkerov AD, ako je tau a AB v plazme [25]. Zistilo sa, že fyzická aktivita znižuje výskyt AD, neuropatologickú záťaž spojenú s AD a kognitívny pokles [26]. Hoci boli publikované mnohé štúdie o výhodách fyzickej aktivity na vznik AD [27], vnútrobunkové mechanizmy podieľajúce sa na týchto pozitívnych účinkoch neboli podrobne prediskutované. Existuje niekoľko zvieracích modelov, kde boli počas fyzického cvičenia testované geneticky modifikované myši s nadmernou expresiou tau a AB. V týchto modeloch bolo dokázané, že zvýšená fyzická aktivita dokázala oddialiť manifestáciu AD [28, 29]. Ďalej sa preukázalo, že dlhodobý tréning týchto myší mal pozitívne účinky na dysfunkcie periférnych orgánov pri AD. Fyzická aktivita zmenila presluchy PACAP-BMP pri ADobličkyprostredníctvom normalizácie expresie kolagénu typu IV a akumulácie A [30]. Okrem toho bola publikovaná podrobná analýza ochrannej funkcie tréningu na expresiu Sox9 v semenníkoch AD [31]. Aktívny tréning tiež ovplyvňuje signalizáciu TGFB, pretože ju potláčaobličkovézápalu a následnej fibrózy [32]. Okrem toho je TGFB a jeho signalizácia dôležitá pre prestavbu kostí dospelých, ktorá je narušenáobličkyfibróza [33]. Následne našou hlavnou hypotézou bolo, že dlhodobý fyzický tréning má systémový účinok na signalizáciu TGFB, ktorú je možné regulovaťobličkyprodukcia matrice v AD. Zmeny týchto signálnych dráh môžu viesť k zníženiu obličkyfibrózy a normalizovať klírens AD. Naším cieľom bolo preto objasniť vzťah medzi signalizáciou TGFB a priaznivými účinkami fyzického tréningu naobličkyfibróza pri AD. V našich experimentoch uvádzame dôkaz, že dlhodobý tréning má priamy vplyv na signalizáciu TGFB vobličkyAD myší. Ďalej ukazujeme, že zvýšená fyzická aktivita klesáobličkyfibróza prostredníctvom normalizácie kanonickej a nekanonickej signalizácie TGFB.

Kľúčové slová:Alzheimerova choroba, fibróza, fyzická aktivita, Smad, ochorenie obličiek; obličkové

CISTANCHE ZLEPŠÍ DIALÝZU OBLIČIEK/RENÁL

MATERIÁL A METÓDY

ZvieraNa sledovanie účinku AD sa použili samce Alzheimer-transgénnych (n=5) (B6C3-Tg (APPswe, PSEN1dE9)85Dbo/J) myší. Trojmesačný divoký typ (WT) (bez transgénnej modulácie a bez tréningu) (n=5), transgénne myši s Alzheimerovou chorobou (AD) (n=5) a trénované AD (TAD) (n=5) myši boli držané v cykloch svetlo/tma 12/12 hodín s potravou a vodou ad libitum. Pre cvičebnú a kombinovanú skupinu bol aplikovaný intervalový beh na páse. Predtým boli všetky cvičiace zvieratá zvyknuté na motorom poháňaný bežiaci pás (Columbus Inst., Columbus Ohio, USA) a rýchlosť behu počas 2 týždňov. Tréning prebiehal štyrikrát týždenne po 60 min. Každý tréning trval 10 cyklov, každý cyklus pozostával zo 4 minút vysokej intenzity a 2 minút behu nízkej intenzity. Rýchlosť behu s nízkou intenzitou bola počas experimentu trvalá, čo znamená rýchlosť 10 m/min. Zatiaľ čo rýchlosť behu s vysokou intenzitou začínala na 16 m/min a zvyšovala sa každý tretí týždeň o 1 m/min, kým sa nedosiahlo 20 m/min. Kontrolná a nutričná skupina si tiež zvykli na bežiaci pás a zostali tam 5 minút/deň na stojacom trenažéri [28]. Experimenty sa začali s 3-mesačnými zvieratami a skončili sa vo veku 10 mesiacov. Štúdia bola vykonaná v súlade s etickými pokynmi (číslo etického povolenia pre túto štúdiu: PEI/001/2105-6/2014, Univerzita Semmelweis, Maďarsko). Na genotypizáciu zvierat sa použila súprava Phire Animal Tissue Direct PCR Kit (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA) podľa pokynov výrobcu.

Morfológia svetelného mikroskopuPo dokončení všetkých kognitívnych testov boli {{0}}-mesačné myši anestetizované intraperitoneálnou injekciou ketamínu (Richter, koncentrácia: 100 mg/ml)/xylazínu (Produlab Pharma, koncentrácia: 20 mg/ ml) koktail v dávke 0,1 ml/10 g telesnej hmotnosti a transkardiálne perfundovaný heparinizovaným ľadovo vychladeným fyziologickým roztokom [28] aobličkyboli odstránené. Vzorky tkaniva sa trikrát premyli v PBS a fixovali sa v zmesi absolútneho etanolu a 40 percent formaldehydu v pomere 4:1, potom sa zaliali do parafínu. Pre Massonovo trichrómové farbenie (Sigma-Aldrich, MO, USA) sa urobili sériové rezy a vizualizovalo sa fibrotické tkanivo. Protokol farbenia sa uskutočnil podľa pokynov výrobcu. Na zhotovenie mikrofotografií bola použitá kamera DP74 (Olympus Corporation, Tokio, Japonsko) na mikroskope Olympus Bx53 (Olympus Corporation, Tokio, Japonsko).

Imunohistochémiabola vykonaná dňaobličkyvzorky tkaniva od myší WT, AD a TAD na vizualizáciu lokalizácie Smad2, PCNA (jadrový antigén proliferujúcich buniek) a kolagénu typu I (stĺpec I) [30].Obličkyboli fixované v zmesi 4:1 absolútneho etanolu a 40 percent formaldehydu a premyté v 70 percentnom etanole. Po vložení sériových rezov nasledovala deparafinizácia, po ktorej nasledovalo opláchnutie v PBS (pH 7,4). Nešpecifické väzbové miesta boli blokované 1 percentom hovädzieho sérového albumínu rozpusteného v PBS (Amresco LLC, Solon, OH, USA). Rezy boli inkubované s polyklonálnym Smad2 (Sigma-Aldrich, MO, USA) v riedení 1:500, PCNA (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) v riedení 1:800 alebo Col. I (Sigma-Aldrich, MO, USA) protilátka v riedení 1:500 pri 4 °C cez noc. Primárne protilátky boli vizualizované pridaním anti-králičej Alexa Fluor 555 sekundárna protilátka (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA) bola použitá v riedení 1:1000. Vzorky boli namontované v montážnom médiu Vectashield (Vector Laboratories, Peterborough, Anglicko) obsahujúcom DAPI (4,6-diamidino-2-fenylindol dihydrochlorid) na farbenie jadrovej DNA. Anti-králičí Alexa Fluor 555 sa použil bez primárnych protilátok na negatívnu kontrolu. Mikrofotografie boli urobené pomocou fotoaparátu DP74 (Olympus Corporation, Tokio, Japonsko) na mikroskope Olympus Bx53 (Olympus Corporation, Tokio, Japonsko) na vizualizáciu Col. I. Obrázky boli získané pomocou softvéru cellSense Entry 1.5 (Olympus, Shinjuku, Tokio, Japonsko ) s konštantnými nastaveniami kamery, ktoré umožňujú porovnanie intenzity fluorescenčného signálu FL. Na detekciu Smad2 a PCNA sa použil konfokálny mikroskop Olympus FV3000 (Olympus Co. Tokyo, Japonsko) s objektívom s 60x olejovou imerziou (NA: 1,42). Na excitáciu boli použité laserové čiary 543 nm. Priemerný čas pixelov bol 4Bs. Série snímok Z s optickou hrúbkou 1 m boli zaznamenané v režime sekvenčného skenovania. Obrázky Alexa555 a DAPI boli prekryté pomocou softvéru Adobe Photoshop verzie 10.0. Kontrast obrázkov sa rovnako zvýšil bez zmeny konštantných nastavení.

RT-PCR analýzaObličkyWT (n=5), AD (n=5) a TAD (n=5) boli mechanicky rozomleté ​​a rozpustené v Trizole (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA ), po 30 minútach inkubácie pri 4 °C bola izolovaná celková RNA [30]. RNA sa zozbierala vo vode bez RNázy a skladovala sa pri -70 °C. Na reverznú transkripciu bola použitá súprava High Capacity RT (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Sekvencie aplikovaných párov primérov a podrobnosti o polymerázových reťazových reakciách sú uvedené v tabuľke 1. Amplifikácia sa uskutočnila v tepelnom cykléri (Labnet MultiGene™ 96-well Gradient Thermal Cycler; Labnet International, Edison, NJ, USA) ako nasleduje: 95◦C, 2 min, po ktorých nasleduje 35 cyklov (denaturácia, 94◦C, 30 s, žíhanie 45 s pri optimalizovaných teplotách, ako je uvedené v tabuľke 1; predĺženie, 72◦C, 90 s) a potom 72◦C ,

7 min. Aktín bol použitý ako vnútorná kontrola. Produkty PCR sa analyzovali s použitím 1,2 percentného agarózového gélu obsahujúceho etídium bromid a dokumentovali sa gélovým dokumentačným systémom FluorchemE (ProteinSimple, CA, USA). Optické hustoty signálov produktov PCR sa stanovili pomocou softvéru ImageJ 1,40 g freeware. Pred meraním optickej hustoty sme na každej mikrofotografii urobili individuálnu kalibráciu. Potom sme zvýšili zväčšenie fotografií, aby sme dosiahli veľkosť jednotlivých pixelov, a pomocou metódy voľnej ruky sme presne zakrúžkovali pruhy a zmerali integrovanú hustotu oblasti. Pixely boli merané v 5 nezávislých experimentoch 3 nezávislými operátormi. Signály sa najskôr porovnávali s aktínom WT na lepšie porovnanie rozdielov v expresii u myší s AD a TAD. Čísla pod pruhmi ukazujú štatistickú analýzu experimentov, kde každý samostatný experiment (aspoň 5) bol normalizovaný na svoj vlastný aktínový signál a potom boli vypočítané štatistické rozdiely.

Western blot analýza

ObličkyWT (n {{0}}), AD (n=5) a TAD myší (n=5) boli umyté vo fyziologickom roztoku N a uskladnené pri –7{{1 0}}◦C. Vzorky sa mechanicky rozomleli v kvapalnom dusíku a odobrali sa do 100 ml homogenizačného RIPA (Radio Immuno Precipitation Assay)-tlmivého roztoku (150 mM chlorid sodný; 1,0 percenta NP40, 0,5 percenta deoxycholátu sodného; 50 mMTris, pH 8,0) obsahujúceho inhibítory proteázy (inhibítory proteázy 10 g/ml), 5 mM benzamidínu, leupeptín (10 ug/ml), trypsínový inhibítor (10 g/ml), 1 mM PMSF, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA, 8 mM fluorid sodný, 1 mM ortovanadát sodný). Pelety boli sonikované pulzným impulzom počas 30 s pri 40 A (ColeParmer, IL, USA). Boli pripravené celkové bunkové lyzáty na analýzu Western blot [30]. 20 g proteínu bolo separovaných v 7,5% SDS-polyakrylamidových géloch na detekciu TGF-1, TGF R1, TGF-R2, Smad2, Smad3, ERK1/2, P-ERK1/2, p38, P-p38,

JNK, PP2A, PP2B, p21, PCNA, štiepená kaspáza3, MMP9, kolagén typu I (stĺpec I) a aktín. Detekčná súprava PhosphoSer/Thr (Millipore, Billerica, MA, USA) sa použila na detekciu hladiny fosforylácie Ser/Thr aminokyselinových bočných reťazcov. Proteíny boli nanesené na nitrocelulózové membrány a vystavené primárnym protilátkam cez noc pri 4 °C v zriedení, ako je uvedené v tabuľke 2. Po inkubácii nasledovalo 30 minútové premývanie PBST, potom boli membrány pokryté sekundárnou protilátkou proti králičiemu IgG konjugovanou s peroxidázou v 1 :1500 (Bio-Rad Laboratories, CA, USA) alebo anti-myší IgG v 1:1500 (Bio-Rad Laboratories, CA, USA) zriedení. Na detekciu bola použitá zvýšená chemiluminiscencia (Advansta Inc., Menlo Park, CA, USA) podľa pokynov výrobcu. Aktín bol použitý ako vnútorná kontrola. Signály boli zachytené chladenou kamerou na gélovom dokumentačnom systéme (Fluorchem E, ProteinSimple, CA, USA). Optické hustoty signálov boli merané pomocou bezplatného softvéru ImageJ 1,40g. Pred meraním optickej hustoty sme na každej mikrofotografii urobili individuálnu kalibráciu. Potom sme zvýšili zväčšenie fotografií, aby sme dosiahli veľkosť jednotlivých pixelov, a pomocou metódy voľnej ruky sme presne zakrúžkovali pruhy a zmerali integrovanú hustotu oblasti. Pixely boli merané v 5 nezávislých experimentoch 3 nezávislými operátormi. Signály sa najprv porovnávali s aktínom WT na lepšie porovnanie rozdielov v expresii v AD a TAD. Čísla pod pruhmi ukazujú štatistickú analýzu experimentov, kde každý samostatný experiment (aspoň 5) bol normalizovaný na svoj vlastný aktínový signál a potom boli vypočítané štatistické rozdiely.

Štatistická analýzaVšetky údaje predstavujú aspoň päť nezávislých experimentov. Pre všetky obrázky boli pre lepšie porovnanie vybraté vzorky rovnakých zvierat WT, AD a TAD s ich vnútornou kontrolou. Na každom obrázku bola použitá iba jedna názorná fotografia z rovnakej skupiny zvierat. Štatistická analýza sa uskutočnila jednosmernou analýzou rozptylu (ANOVA), po ktorej nasledoval Tukeyho post-hoc test HSD. Prah pre štatisticky významné rozdiely v porovnaní s kontrolnými vzorkami bol nastavený na ∗p < 0.05="" a="" pre="" ad="" vzorky="" #p="">< 0,05.="" ∗="" označuje="" rozdiely="" wt="" v="" porovnaní="" s="" ad="" a="" tad,="" #="" označuje="" rozdiely="" ad="" v="" porovnaní="" s="">

VÝSLEDKY

Fyzická aktivita normalizovala kanonickú signálnu dráhu TGF v obličkách myší s ADExpresia prvkov kanonickej signálnej dráhy TGFB bola podrobne skúmaná. Expresia proteínu a mRNA TGFB1 nepreukázala žiadny významný rozdielobličkyWT a AD myší boli porovnané, ale zvýšená expresia bola zistená vo vzorkách TAD (obr. 1A, B). Expresia TGFRI sa pri AD znížila, ale fyzická aktivita ju normalizovala (obr. 1A, B), zatiaľ čo expresia TGFBRII sa zvýšila vobličkyAD myší, ale zmenšil sa po fyzickej aktivite (obr. 1A, B). V súlade s týmito pozorovaniami sa expresia Smad2 zvýšila vo vzorkách AD a po fyzickom vyšetrení sa normalizovalaaktivita (obr. 1A, B). Naopak, expresia Smad3 vykazovala mierny poklesobličkyAD myší, ktorá bola kompenzovaná vo vzorkách TAD (obr. 1A, B). Zvýšenie pozitívnych signálov Smad2 bolo pozorované v tubulárnom systéme kôry, ale nie v kôreobličkovékrviniek u AD myší. Toto zvýšenie bolo znížené v tubuloch TAD zvierat (obr. 1C).

Nekanonické signálne dráhy boli modifikované v obličkách AD myší po fyzickej aktiviteMAPK-es, ako napríklad ERK, p38 a JNK, tvoria dôležitú súčasť nekanonickej signalizácie TGF [22]. Expresia mRNA ERK nebola zmenenáobličkyAD myší, ale vykazovali pokles vo vzorkách TAD (obr. 2A). Proteínová expresia tejto kinázy nebola v korelácii s expresiou mRNA a bola zistená silná redukcia vobličkyAD myší so strednou normalizáciou po zvýšenej fyzickej aktivite (obr. 2B). Aktívna, fosforylovaná forma bola zaujímavo zvýšená vo vzorkách AD a vykazovala podobný poklesobličkyTAD myší (obr. 2B). Expresia mRNA p38 nebola významne zmenená v žiadnej vzorke (obr. 2A). Proteínová expresia p38 sa silne zvýšila vobličkyAD myší, čo bolo čiastočne kompenzované fyzickou aktivitou (obr. 2B). Je zaujímavé, že aktívnejšia fosforylovaná forma vykazovala zníženie vo vzorkách AD, ktoré

bol normalizovaný u TAD zvierat (obr. 2B). Expresia mRNA JNK bola znížená vo vzorkách AD aj TAD (obr. 2A). Proteínová expresia 2 izoforiem JNK bola detegovaná analýzou Western blot. Boli odhalené neredundantné funkcie pre JNK1 a JNK2 [34] a vo vzorkách AD sa zistil významný pokles izoformy 57 kDa a izoformy 46 kDa (obr. 2B). 57 kDa a 46 kDa izoformy vykazovali zvýšenie po fyzickej aktivite vobličkyTAD myší (obr. 2B).

Zmenená expresia Ser/Thr fosfatáz a modifikovaná fosforylácia proteínov pri ADZmenená expresia a funkcia proteínovej fosfatázy špecifickej pre Ser/Thr bola preukázaná pri AD [35, 36]. Zistili sme zvýšenú expresiu PP2B vobličkyAD myší, ale bola znížená fyzickou aktivitou (obr. 2A, B). Naopak, expresia ďalšej hlavnej bunkovej Ser/Thr špecifickej fosfatázy, PP2A, sa objavila so silným zníženímobličkyAD myší (obr. 2A, B). Vo vzorkách TAD sa expresia mRNA a proteínu katalytickej podjednotky PP2A zvýšila (obr. 2A, B). Skúmanie fosforylácie proteínov na zvyškoch Ser/Thr ukázalo silný signál pri 55 kDa vobličkyAD myší, čo predstavuje molekulovú hmotnosť tau (obr. 2C). Ďalší zvýšený pás sa objavil pri 10 kDa, čo zodpovedá molekulovej hmotnosti odštiepeného C-konca APP (obr. 2C). Fosforylácia oboch týchto proteínov bola znížená pri cvičení (obr. 2C).

Signalizácia TGF ovplyvnila bunkový cyklus a apoptózuAko markery bunkovej proliferácie sa monitorovali hladiny expresie p21 a PCNA. Je známe, že aktivácia TGFB indukuje expresiu p21 [37]. Okrem toho má aktivácia TGFB1 za následok zmenenú bunkovú proliferáciu [38]. Preto sa skúmala expresia proliferujúceho bunkového jadrového antigénu (PCNA). Hladina proteínu p21 bola významne zvýšená pri AD, ale bola znížená vo vzorkách TAD (obr. 3A, B). PCNA reagovala odlišne: AD spôsobila zníženie expresie proteínu, zatiaľ čo proteín PCNA sa po cvičení zvýšil (obr. 3A, B). Imunohistochémia sa uskutočnila na identifikáciu PCNA pozitívnych buniek a viedla k zníženej imunoreaktivite v tubulárnych bunkách v obličkách AD myší. Je zaujímavé, že normalizovaná PCNA pozitivita sa ukázala v tubulárnych bunkách u TAD myší. Neboli detegované žiadne PCNA pozitívne bunkyobličkovékrviniek (obr. 3C). Keďže signalizácia TGF1 môže ovplyvniť apoptózu [39], skúmala sa aktívna forma proapoptickej kaspázy3. Aj keď sa vo vzorkách WT detegovala mierna mRNA expresia kaspázy 3, neukázala sa žiadna štiepená aktívna kapáza 3. Naopak, vo vzorkách AD sa objavila silná mRNA a štiepená kaspáza3, zatiaľ čo zvýšená fyzická aktivita znížila expresiu proapoptotického proteínu (obr. 3A, B).

Fibróza obličiek bola znížená fyzickou aktivitouPredchádzajúce výsledky naznačujú možnú fibrózu v obličkách zvierat s AD. Najprv sa skúmala expresia MMP9, ktorá môže byť regulovaná aktiváciou TGFB1 [21]. mRNA MMP9 bola exprimovaná vo všetkých vzorkách, ale vykazovala významné zvýšenie iba v obličkách TAD myší. Proteínová expresia matricovej metaloproteinázy bola na detekčnom limite vo vzorkách WT, ale vykazovala významné zvýšenie u zvierat s AD. Prekvapivo, aktívne fyzické cvičenie dramaticky zvýšilo expresiu MMP9 (obr. 4A, B). Ďalšou zložkou fibrotických procesov je zvýšené ukladanie kolagénu typu Iobličky[40]. Vo vzorkách WT bola detegovaná nízka mRNA a proteínová expresia kolagénu typu I, ale u zvierat s AD sa ukázal silný nárast. Aktívny fyzický pohyb normalizoval expresiu mRNA aj proteínu kolagénu typu I (obr. 4A, B). Kolagén typu I normálne obklopuje tubuly a je lokalizovaný aj v interstíciu. Pri rutinnom patohistologickom farbení Massonovho trichrómu modrá farba predstavuje prítomnosť akéhokoľvek typu kolagénu, ktorý bol viditeľný okolo tubulov,obličkovékrviniek a malé množstvo v interstíciu v obličkách WT. Vo vzorkách AD bola viditeľná silná akumulácia v interstíciu a v niektorých tubuloch. Po fyzickej aktivite sa množstvo kolagénu znížilo a nezistila sa žiadna akumulácia v interstíciu (obr. 4C). Bola vykonaná imunohistochémia kolagénu typu I na špecifikáciu nahromadeného kolagénu. Vo WTobličkyPodobne ako pri Massonovom farbení sa okolo tubulov objavili signály,obličkovéboli tiež viditeľné krvinky a slabý intersticiálny signál. Vo vzorkách od AD myší sa preukázala silná imunopozitivita v interstíciu a okolo tubulárneho systému. Prekvapivo bola viditeľná redukcia v intersticiálnom tkanive, ale významný signál sa objavil v apikálnej časti tubulárnych epitelových buniek u TAD zvierat (obr. 4D).

CISTANCHE ZLEPŠÍ BOLESŤ OBLIČIEK/OBLIVÍN

DISKUSIA

Hoci proces tvorby AD je v CNS široko diskutovaný, zmeny a možné periférne sprievodné patológie nie sú podrobne skúmané. Naša hlavná hypotéza bola takáobličkyfibróza je možný proces, ktorý ovplyvňuje manifestáciu AD a akumuláciu A. Na druhej strane, dlhodobý fyzický tréning má pozitívny vplyv na AD, čo môže mať koreláciu so systémovou zmenou signálnej dráhy TGFB. Ukázalo sa, že periférne orgány sa podieľajú na patogenéze AD, okrem iného bola u pacientov s AD zistená zmenená aktivita metabolických enzýmov [41] a akumulácia bola preukázaná v pankrease [42] a vobličky[30]. Toto systémové ochorenie postihujúce rôzne orgány sťažuje včasnú diagnostiku a liečiteľnosť AD. Klírens AD z CNS je čiastočne regulovaný astrocytmi a mikrogliami, ale určitá časť môže byť po prechode hematoencefalickou bariérou odstránená na periférii [43]. Tento periférny klírens sa považuje za jeden z možných cieľov liečiva na zníženie koncentrácie AD v plazme [44]. Sekrécia malých molekúl proximálnymi tubulmi obličiek predstavuje životne dôležitú homeostatickú funkciu a môže sa podieľať na sekrécii toxínov alebo bielkovín do moču [45]. Bolo preukázané, že AD sa vylučuje močom a môže byť diagnostickým znakom demencie [46]; okrem toho môže dysfunkcia obličiek u starších ľudí zvýšiť riziko demencie [47] a zistilo sa, že sérové ​​hladiny AD boli signifikantne vyššie u pacientov s CKD [10]. Tieto údaje naznačujú možnú funkciuobličkypri AD klírens na periférii. Ukázalo sa, že fyzické cvičenie má pozitívny vplyv na funkciu obličiek, pretože zachováva správnu glomerulárnu morfológiu a chráni tubulárnu sekréciu [48]. Ukázalo sa, že zvýšená fyzická aktivita znižuje signalizáciu TGFB v obličkách a fyzické cvičenie môže byť dobrou antifibrotickou stratégiou [32]. Celkovo môže mať aktivácia TGF priamu súvislosť so signalizáciou súvisiacou s fyzickou aktivitou, ktorá môže udržiavať klírens AD na periférii. Preto sme skúmali signálnu dráhu TGFB u WT, AD a dlhodobo trénovaných AD myší.

V súčasnej štúdii sa preukázalo, že expresia TGFFRII bola zvýšená v obličkách myší s AD a čiastočne normalizovaná vo vzorkách TAD. Zvýšený TGFBRII indikuje zvýšenú aktiváciu TGFB signálnej dráhy pri AD [49]. Znížená expresia TGF RI ukázala, že pri AD je pravdepodobné, že sa TGF viaže s vyššou afinitou k TGFBRII a tvorbou homodimérov [50]. Podobne ako tieto výsledky sa tvorba homodiméru TGFFRII ukázala v makrofágoch vobličkovéfibróza [51]. Na druhej strane, dlhodobý tréning vyrovnal expresiu TGFB receptorov, čo naznačuje tvorbu heterodimérneho receptorového komplexu, ktorý môže byť stabilizovaný zvýšenou expresiou TGFB1 [50]. Navyše expresia Smad2 a Smad3 bola pri AD kontroverzne zmenená. Je známe, že Smad2 je klasicky aktivovaný receptormi TGF a translokovaný do jadra, zatiaľ čo Smad3 má odlišnú funkciu [52]. Bolo publikované, že down-regulácia Smad3 ovplyvňuje fibrózu [53]. Normalizovaná expresia Smad transkripčných faktorov vo vzorkách TAD ukazuje

že fyzická aktivita znovu vyrovnala signalizáciu TGFB a znížila jej patobiochemickú aktiváciu. Rodina mitogénom aktivovaných proteínkináz (MAPK) obsahujúca p38MAPK, JNK a ERK interaguje so signalizáciou TGF [54]. Zvýšená expresia p38 bola preukázaná v tubulárnych epiteliálnych bunkách indukujúcich fibrózu obličiek a jej blokovanie môže byť dobrým cieľom liečby fibrózy [55]. U AD myší sa zistila zvýšená expresia proteínu p38, čo ďalej podporuje tvorbu fibrózy. Naopak, fosforylácia p38 bola znížená v obličkách s AD, čo naznačuje aktiváciu p38 MAPK závislú od štádia fibrózy [56]. Na druhej strane zvýšená fyzická aktivita čiastočne normalizovala p38 aj fosforylovanú formu prítomnú v obličkách, čo naznačuje vyrovnávaciu funkciu tréningu pri tvorbe fibrózy sprostredkovanej p38-. Podobne ako v prípade kinázy p38 môže inhibícia JNK potlačiť tvorbu fibrózy [57]. Aktivácia JNK má rôzne funkcie v rôznych častiach obličiek, ako je glomerulárna filtrácia a intersticiálne fibrotické procesy [58]. Proteínový extrakt v našich experimentoch odvodený z celkového obličkového lyzátu naznačuje, že počas vývoja AD má JNK pravdepodobne odlišnú funkciu v tubulárnych a glomerulárnych častiach s bunkovo ​​špecifickou aktiváciou izotypu v obličkách postihnutých AD. Aktivácia MMP indukovaná TGFB1 bola hlásená v závislosti od funkcie p38 [59], zatiaľ čo inhibícia aktivity ERK redukovala intersticiálnu fibrózu [60]. Tieto údaje silne podporujú odlišné funkcie členov rodiny MAPK v patogenéze fibrózy obličiek pri AD. Zistili sme nízku expresiu ERK v obličkách AD myší, zatiaľ čo množstvo jeho fosforylovanej aktívnej formy sa výrazne zvýšilo. V experimentálnej skupine myší zúčastňujúcich sa dlhodobého telesného tréningu sme zistili normalizovanú expresiu ERK a fosfo-ERK a priaznivý vplyv nafunkcie obličiek.Tieto pozorovania podporujú príspevok ERK vo fibrotickej transformácii obličiek pri AD a demonštrujú prekvapivo zrejmý pozitívny vplyv fyzického tréningu na morfológiu obličiek a funkciu AD myší. Nedávno naše laboratórium dokázalo zapojenie ERK do mechanotransdukcie vyvíjajúcich sa buniek chrupavky [61].

K fosforylácii TGFBRII, Smad, JNK, p38 a ERK dochádza na zvyškoch Ser [62], čo naznačuje možnú aktiváciu fosfatáz Ser/Thr. Dysregulácia PP2B bola preukázaná pri AD [35, 63]. Na druhej strane PP2B významne nereguluje fosforyláciu tau v mozgu, aj keď je schopný ho defosforylovať na niekoľkých miestach fosforylácie [35]. Ďalšia hlavná bunková Ser/Thr fosfatáza, PP2A, tiež defosforyluje proteíny na zvyškoch Ser a jej aktivita je znížená pri AD a je schopná regulovať fosforyláciu tau s vyššou afinitou ako PP2B [64]. Bola preukázaná znížená expresia PP2A, ale zvýšená expresia PP2B v obličkách myší s AD, podobne ako v CNS. Zvýšená fosforylácia na zvyškoch Ser, ako výsledok zníženia expresie PP2A, môže indukovať hyperfosforyláciu tau proteínu alebo APP, ako sa predpokladalo v obličkách AD myší. Defosforylácia JNK a p38 môže byť priamo regulovaná PP2B [65], preto znížená aktivácia týchto kináz pri AD môže byť dôsledkom zvýšenej expresie PP2B. Na druhej strane, k defosforylácii ERK kinázy môže dôjsť dominantne prostredníctvom aktivácie PP2A [66], následne znížená expresia PP2A môže viesť k zvýšenej fosforylácii ERK pri AD. Dlhodobý tréning AD myší pôsobil smerom k normalizácii expresie PP2B a PP2A, čo následne zrejme posunulo hladinu fosforylácie Ser/Thr enzýmov MAPK bližšie k normálu. Mechanická záťaž mala vyrovnávací účinok na reverzibilnú fosforyláciu prostredníctvom zapojenia PP2B a PP2A aj do diferenciácie chondrocytov [61].

Aktivácia nekanonickej signálnej dráhy TGFB reguluje bunkovú proliferáciu a apoptózu. Podobne ako v našich výsledkoch, bunky pozitívne na p21 boli preukázané v tubulárnom systéme obličky [67] a preukázali sme aj ich zvýšenú expresiu pri AD. Toto zvýšenie naznačuje zastavenie bunkového cyklu pri AD sprostredkované aktiváciou MAPK, zatiaľ čo p21 interaguje s PCNA a blokuje bunky v S-fáze bunkového cyklu [68]. Zistili sme aktiváciu p21 a pravdepodobne následné silné zníženie PCNA v tubulárnom systéme myší s AD. Podobne ako v našich predchádzajúcich zisteniach zvýšená fyzická aktivita normalizovala bunkový cyklus v bunkách tubulárneho systému. Na druhej strane, p21 má tiež spojenie s aktiváciou kaspázy a JNK, zatiaľ čo ERK tiež indukuje štiepenie kaspázy3 [69, 70]. Zistilo sa, že aktivácia kaspázy 3 hrá dôležitú úlohu v patogenéze AD prostredníctvom akumulácie A a kaspázou sprostredkovaných synoptických porúch vyvolaných štiepením ABPP [71]. V obličkách AD myší sme detegovali vysoké expresie štiepenej kaspázy 3, čo naznačuje zvýšenú apoptózu a stratu funkcie tubulárnych a glomerulárnych buniek. Tieto procesy môžu podporovať akumuláciu AD v obličkovom interstíciu, ako sme už ukázali [30].

CISTANCHE ZLEPŠÍ INFEKCIU OBLIČIEK/OBLIVÍN

Ukázalo sa, že signalizácia sprostredkovaná TGFB zvyšuje expresiu a akumuláciu kolagénu v interstíciu [40]. Podľa týchto výsledkov v obličkách myší s AD sme preukázali výrazne zvýšenú expresiu kolagénu typu I nahromadeného v interstíciu. Tieto údaje silne naznačujú, že zmenená kanonická a nekanonická signalizácia TGFB pri AD hrá kľúčovú úlohu pri fibróze obličiek [18, 72]. Naopak, dlhodobý tréning znížil lokalizáciu intersticiálneho kolagénu typu I aspoň čiastočne prostredníctvom opätovného vyváženia signalizácie TGFB. Znížená fibróza môže vyvolať klírens AD a znížiť jejobličkovéakumuláciu, ako sme už predtým preukázali [30]. Táto hypotéza bola podporená našimi zisteniami, pretože fyzický tréning viedol k akumulácii kolagénu typu I v tubulárnych epitelových bunkách, čo bolo preukázané v obličkách TAD myší, čo naznačuje proces degradácie kolagénu. MMP9 môže byť aktivovaný TGFB signalizáciou v obličkách [73] a vedie k degradácii matricových fibríl. Hoci MMP majú pri fibróze inhibičnú aj stimulačnú úlohu, MMP9 sa považuje za profibrotické činidlo sprostredkované aktiváciou TGFB [74]. Naopak, bolo preukázané, že MMP9 môže hrať regulačnú úlohu pri degradácii kolagénu typu I v obličkách [75]. V obličkách myší s AD sme ukázali zvýšenú expresiu MMP9, čo naznačuje jej funkciu vo fibrotickom procese riadenom signálnou kaskádou TGFB. Na druhej strane, ďalšie zvýšenie bolo namerané po dlhodobom tréningu, čo môže byť príčinou silného zníženia expresie a tubulárneho vzhľadu kolagénu typu I. Pri mechanickom stimule naše laboratórium ukázalo, že expresia MMP9 bola zvýšená v primárnych chondrogénnych kultúrach [76] a podobné výsledky boli publikované pri tvorbe tkaniva jazvy, kde mechanická kompresia zvýšila expresiu MMP9 [77]. Pri akútnom poškodení obličiek má zvýšenie MMP9 antiapoptotickú funkciu a chráni S3 časť proximálnych tubulov [78]. Okrem toho sa v pľúcach zistila aj signálna dráha TGFB aktivovaná šmykovým stresom a znížená tvorba fibrózy [79]. Okrem toho mechanický stres v pľúcnych epitelových bunkách indukoval remodeláciu ECM prostredníctvom aktivácie MMP9 a zmenil expresiu kolagénu [80]. Preto môžeme konštatovať, že zvýšená fyzická aktivita indukuje remodeláciu produkcie matrice prostredníctvom modulácie signalizácie TGFB nielen lokálne, ale aj systémovo. Obmedzenia našej práce spočívajú v tom, že transgénne myši môžu mať rýchlejšiu tvorbu AD a funkcia obličiek nie je podrobne skúmaná. Je potrebné ďalej skúmať, že vo fibrotických obličkách myší s AD je zmenená iba produkcia matrice indukovaná TGFB alebo regulácia rovnováhy sodíka a draslíka a klírens AD sa tiež podieľa na dlhodobom tréningu. Okrem toho možno ďalej sledovať akumuláciu kolagénu typu I v moči, aby sa zlepšilo, že dlhodobý fyzický tréning pri AD vedie k zníženiu fibrózy obličiek. Na druhej strane sme in vivo dokázali, že dlhodobý fyzický tréning má systémový vplyv na kanonickú a nekanonickú signalizáciu TGFB. In vivo sme preukázali, že telesný tréning znižuje tvorbu fibrózy obličiek pri AD, čo má pozitívny vplyv na prejavy ochorenia. Na záver, naše údaje naznačujú, že aktivácia signálnych dráh TGFB hrá príčinnú úlohu vo fibrotickej transformácii obličiek myší s AD. Ako veľmi jednoduchý prístup k dosiahnutiu pozitívnych zmien v tomto stave odporúčame dlhodobý fyzický tréning, ktorý dokázal normalizovať expresiu a fosforyláciu členov kanonických a nekanonických signálnych dráh TGFB a viedol k zlepšeniu fibrózy obličiek. Okrem toho fyzické cvičenie inhibujúce fibrózu môže obnoviť rovnováhu funkcie obličiek a môže vyvolať zvýšený klírens systémovej AD pri AD.