Inhibítor kinázy LRRK2 omladzuje bunkovú senescenciu v neurónových bunkách vyvolanú oxidačným stresom, časť 2

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

3. Výsledky

3.1. Rotenón upreguluje aktivitu kinázy LRRK2 a starnutie buniek v bunkách dSH.

Predchádzajúce štúdie uviedli, že rotenón upreguluje aktivitu kinázy LRRK2 upreguláciou expresie LRRK2 [16,19]. Miera apoptózy však bola v týchto štúdiách vyššia ako u iných fenotypov spojených so starnutím buniek v dôsledku použitia vysokej koncentrácie rotenónu. Preto boli bunky ošetrené nízkou koncentráciou rotenónu (1 uM) pre a

FrGURE 3: Senescence podporuje lyzozomálnu dysfunkciu upreguláciou aktivity LRRK2 kinázy u diferencovaného človekaneuroblastómbunkovej línie. (a, b) glykogénové (zelené) farbenie živých dSH buniek. Intenzita zafarbenia GlycoGREEN bola normalizovaná na intenzitu farbenia Hoechst 33342. Normalizovaná intenzita v liečenej skupine bola vyjadrená v percentách (percentách) v porovnaní s intenzitou v skupine liečenej vehikulom (dimetylsulfoxidom). n =4;počet buniek =15-40.(c, d)Aktívne lyzozómy, ktoré sú spojené s kyslými podmienkami, boli zafarbenéLysoSensorModré DND-167. Intenzita zafarbenia bola vyjadrená v percentách ( percentách ) v porovnaní s intenzitou v skupine liečenej vehikulom. n =4; počet buniek=17-38.（e, f Úrovne reaktívnychkyslíkdruhy v dSH bunkách ošetrených rotenónom （1 uM） a GSK-KI (1 uM) boli merané s použitím 2',7'-dichlórfluoresceín diacetátu (DCFDA). Intenzita DCFDA v liečených skupinách bola normalizovaná na intenzitu v skupinách liečených vehikulom. Odhadované intenzity DCFDA boli vyjadrené v percentách ( percent ).n =4; počet buniek=25-44.

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

predĺžené trvanie (48 hodín), ako bolo uvedené skôr [15]. Rote-none upreguloval hladiny LRRK2. Spoločná liečba rotenónom a GSK-KI však neviedla k zvýšeniu hladín LRRK2 (obrázky 1(a) a 1(b). Liečba GSK-KI zmiernila rotenónom indukovanú S1292 fosforyláciu LRRK2 (obrázky 1(a). -1(c)). Podobne liečba GSK-KI nevýznamne zmiernila rotenónom indukovanú upreguláciu hladín p53 (obrázky 1(a) a 1(d)).LRRK2

FicuRE 4: Inhibítor kinázy LRRK2 zmierňuje narušenú autofágiu vyvolanú rotenónom a zvyšuje akumuláciu a-synukleínu v diferencovanej bunkovej línii neuroblastómu, dSH bunkách ošetrených rotenónom, GSK-KI aa-svnukleínfibrily (70 nM) boli podrobené westernovému prenosu (a). Hustoty cieľových proteínov boli normalizované na hustoty -aktínu (bd a f). Hustota LC3B II bola normalizovaná na hustotu LC3BI(e). n=3.

Inhibícia kinázy FicuRE 5:LRRK2 zmierňuje rotenónom indukovanú starnutie buniek a podporuje autofagický klírens -synukleínu v primárnych kortikálnych neurónoch potkanov. Experimenty uskutočnené s použitím dSH ošetreného -synukleínovou fibrilou (70 nM), rotenónom (1 uM) a GSK-KI (1 uM) počas 48 hodín sa opakovali s potkaními primárnymi kortikálnymi neurónmi.Imunoreaktívnesignály vo westernovom prenose (a) boli vizualizované pomocou protilátok proti cieľovým proteínom. Hustoty všetkých proteínov, okrem LC3B II/I, boli normalizované na hustoty -aktínu (bi). (ji) Lyzáty (a) sa podrobili starnutiu súvisiacemu- galaktozidázatest aktivity.n= 3.

Cistanche môže zlepšiť imunitu

bolo hlásené, že fosforyluje p53 v mieste TXR [20]. Liečba rotenónom zvýšila jadrovú lokalizáciu p53, ktorá bola zmiernená po spoločnej liečbe s GSK-KI (obrázky 2(a)-2(e)). Okrem toho GSK-KI zmiernil rotenónom indukovanú upreguláciu p21 (obrázky 1 (a) a 1 (e)). Rotenón znižoval fosforyláciu Rb, ktorá sa podieľa na poslednom štádiu senescentnej dráhy p53-p21. Ošetrenie GSK-KI zmiernilo rotenónom indukovanú fosforyláciu Rb (obrázky 1(a) a 1(f)). Keďže dráha p53-p21 nie je jedinou signálnou dráhou sprostredkujúcou starnutie, skúmali sa hladiny mRNA p21 a pl6. Liečba GSK-KI zmiernila rotenónom indukovanú upreguláciu p21. Hladiny p16 mRNA sa významne nelíšili medzi skupinami liečenými rotenónom a skupinami liečenými rotenónom/GSK-KI (obrázok 2(f). Rotenón upreguloval aktivitu -gal, marker starnutia, ktorý bol zmiernený po spoločnej liečbe s GSK-KI ( Obrázky 1(a) a 1(g)). Okrem toho výsledky PLA pS1292 LRRK2 a celkového LRRK2 v dSH bunkách odhalili, že rotenón zvýšil hladiny -gal a aktivitu kinázy LRRK2 (obrázky 1(h){{39 Tieto výsledky naznačujú, že rotenón podporuje starnutie buniek prostredníctvom dráh p53, p21, Rb a -gal zvýšením regulácie hladín LRRK2 a jeho kinázovej aktivity, ktorá inhibíciu LRRK2 zmierňuje rotenónom indukovanú starnutie buniek v dSH bunkách.

3.2. Bunková senescencia zhoršuje -Syn degradáciu v dSH bunkách a potkaních primárnych kortikálnych neurónoch zvýšením regulácie expresie LRRK2 kinázy.

Bunková senescencia zhoršuje aktivitu autofágovo-lyzozomálnej dráhy [14, 21]. Preto sa lyzozomálna aktivita (LysoSensor) skúmala spolu s markermi starnutia, SA-gal aktivitou a hladinami ROS za rovnakých experimentálnych podmienok (obrázok 1). Rotenón zvýšil SA-gal aktivitu (obrázky 3(a) a 3(b)) a znížil lyzozomálnu aktivitu (obrázky 3(c) a 3(d)), ktoré boli zmiernené po spoločnej liečbe s GSK-KI. Okrem toho GSK-KI zmiernil rotenónom indukovanú upreguláciu hladín ROS, čo naznačuje, že rotenón podporuje starnutie indukciou oxidačného stresu (obrázky 3 (e) a 3 (f)). Predtým sme preukázali, že fosforylácia p53 sprostredkovaná LRRK, ako aj mutant LRRK2 G2019S, podporovali akumuláciu -syn [10]. Vplyv bunkovej starnutia na agregáciu -syn, ktorá zhoršuje progresiu PD, sa skúmal pomocou -syn fibríl. Rotenón upreguloval hladiny p62 a LC3BI/I, ktoré predstavujú suspenziu toku autofágie, agregáty -syn (obrázky 4 (a), 4 (d) a 4 (f) a aktivitu kinázy LRRK2 (obrázky 4 (a )-4(c))v dSH bunkách. Ošetrenie pomocou GSK-KI zmiernilo rotenónom indukovanú upreguláciu p62,LC3B I/l a agregátov -syn, ale neovplyvnilo hladiny LRRK2. GSK-KI zmiernil rotenónom indukovanú upreguláciu SA

OBRÁZOK 6: Rotenón podporuje starnutie buniek v strednom mozgu myši zvýšením regulácie expresie kinázy LRRK2. (a) Schéma experimentu s myšou. (b) Sú znázornené merania času pádu z rotarodu. Časy pádu každej myši v experimentálnej skupine (n =4) boli zaznamenané trikrát. Lyzáty stredného mozgu sa podrobili testu aktivity galaktozidázy spojenej so starnutím (c), western blotting (de) a imunosorbentu viazanému na enzým test na detekciu filamentózneho oligoméru -synukleínu (f), n =4. * označuje výsledky dvojcestnej analýzy rozptylu (ANOVA), po ktorej nasleduje Tukeyho post hoc test.# označuje výsledky jednosmernej ANOVA, po ktorej nasleduje Tukeyho post hoc test."*p<0.01 and="" p=""><0.001. β-gal="" and="" downregulation="" of="" lysosomal="" enzyme(cathepsin="" d)activities="" (supplementary="" figure="" 1).="" to="" determine="" the="" mechanism="" underlying="" rotenone-mediated="" lrrk2="" kinase="" activation="" and="" cellular="" senescence,="" the="" experiments="" performed="" with="" dsh="" cells="" were="" repeated="" using="" rat="" primary="" cortical="" neurons.="" rotenone="" and="" gsk-ki="" exerted="" similar="" effects="" on="" lrrk2="" kinase="" activity(figures="" 5(a)-5(c)),="" p53-p21="" pathway="" activation="" (figures="" 5(a),="" 5(d),="" and="" 5(e)),β-gal="" levels="" (figures="" 5(a)="" and="" 5(f)),="" autophagy(figures="" 5(a),5(g),="" and="" 5(h)),="" α-syn="" aggregation(figures="" 5(a)="" and="" 5(i)),and="">

OBRÁZOK 7: Úloha inhibítora kinázy LRRK2 pri indukcii bunkovej starnutia počas progresie Parkinsonovej choroby. Schematické znázornenie zistení tejto štúdie. Inhibítor kinázy LRRK2 zmierňuje rotenónom indukovanú bunkovú senescenciu, zhoršenú autofágovo-lyzozomálnu dráhu a zvýšenú agregáciu -synukleínu v dopamínergných neurónoch.

-gal aktivitu (obrázok 5(j)) v potkaních primárnych kortikálnych neurónoch ako tie, ktoré sa pozorovali v dSH bunkách. Rotenónom indukovaná bunková senescencia teda podporuje upreguláciu kinázy LRRK2 a zhoršuje autofágovo-lyzozomálne aktivity, čo vedie k zvýšenej agregácii -syn.

3.3. Inhibícia kinázy LRRK2 zmierňuje rotenónom indukovanú bunkovú starnutie v strednom mozgu myši.

Na overenie zistení in vitro sa uskutočnil test in vivo. Myšiam boli raz za dva razy intraperitoneálne injikované rotenón (0,75 mg/kg telesnej hmotnosti) a MLi-2 (1 mg/kg telesnej hmotnosti), inhibítor kinázy LRRK2 priepustný cez hematoencefalickú bariéru dní počas dvoch týždňov (obrázok 6(a)). V experimentoch uskutočnených s použitím vysokých koncentrácií rotenónu bola apoptóza prevládajúcim fenotypom spojeným so starnutím buniek. Preto boli bunky dSH a primárne neuróny potkanov liečené nízkymi koncentráciami rotenónu počas predĺženého trvania. Rotenón nevýznamne znížil lokomotorickú aktivitu myší, o čom svedčí skrátený čas pádu z rotarodu (obrázok 6(b)). Rotenón však upreguloval aktivitu SA-gal v strednom mozgu, čo sa významne zmiernilo po spoločnej liečbe s MLi-2 (obrázok 6(c)). Okrem toho liečba MLi-2 nevýznamne zmiernila rotenónom indukovanú aktiváciu kinázy LRRK2 a p53-p21 dráhy v strednom mozgu (obrázky 6(d) a 6(e)). Okrem toho rotenón významne zvýšil hladiny -gal, čo sa zmiernilo po spoločnej liečbe s MLi-2. ELISA sa uskutočnila na meranie hladín fibrilárnych -syn oligomérov v lyzáte stredného mozgu[17]. Ošetrenie MLi-2 zmiernilo rotenónom indukovanú upreguláciu fibril-lar-syn oligomérov (obrázok 5(f)). Intraperitoneálne podávanie nízkej dávky rotenónu teda podporilo starnutie buniek v strednom mozgu myši, čo viedlo k agregácii -syn v strednom mozgu. Liečba inhibítorom kinázy LRRK2 zmiernila rotenónom indukovanú starnutie buniek v strednom mozgu.

4. Diskusia

Mechanizmus, ktorý je základom bunkovej starnutia v dopamínergných neurónoch, nebol objasnený. Starnutie je rizikovým faktorom PD. Preto je potrebné zvážiť koreláciu medzi starnutím a starnutím buniek. Nedávne štúdie naznačujú, že starnutie buniek spojené s PD súvisí so stratou bunkových funkcií [14, 22, 23), ako je strata funkcie LRRK2 v neurónoch v dôsledku deregulácie autofágovo-lyzozomálnej dráhy [24, 25]. . Predtým sme demonštrovali, že mutant G2019s LRRK2 narušil autofágiu v myšacej dopaminergnej bunkovej línii fosforyláciou leucín-tRNA syntetázy [26]. Poškodená autofágovo-lyzozomálna dráha podporuje agregáciu -syn [1l,27]. Aktivita LRRK2 teda môže sprostredkovať agregáciu -syn. Inhibícia alebo prevencia agregácie -syn pomocou anti{19}}syn protilátky je potenciálnou terapeutickou stratégiou pre PD [28-30]. Protilátka anti- -syn však nevykazovala výrazný terapeutický účinok na PD u ľudí. Môže to byť spôsobené neúplným odstránením agregátov -syn, vrátane fibríl, protofibríl a toxických oligomérov. Konformačne špecifické protilátky pre -syn oligoméry nemusia odstrániť všetky toxické oligoméry alebo oligoméry náchylné na LB v mozgu pacientov s PD. Inhibícia kinázy LRRK2 môže aktivovať autofágovo-lyzozomálnu dráhu a podporovať klírens a-syn. Preto spoločné podávanie inhibítora kinázy LRRK2 a anti- -syn protilátky má synergický terapeutický účinok na PD.

Dráha p53-p21 sa podieľa na niekoľkých bunkových procesoch vrátane apoptózy a starnutia [31]. Fosforylácia Rb je vstupným krokom bunkovej signálnej dráhy starnutia [32]. Okrem toho aktivácia expresie p16 sprostredkuje starnutie buniek [33]. Hladiny expresie p16 a p21 sú upregulované v neurónoch dorzálnych koreňových ganglií myší s injekciou cisplatiny [34]. Okrem toho postmortálna analýza pacientov s amyotrofickou laterálnou sklerózou / ochorením motorických neurónov odhalila, že expresia p16 a p21 bola upregulovaná v astrocytoch frontálneho asociovaného kortexu. Neuróny však vykazovali upreguláciu p21 s nedetegovateľnými hladinami p1635]. Zistenia tejto štúdie ukázali, že starnutie buniek bolo sprostredkované hlavne cestou p53-p21, a nie upregulovaným pl6 (obrázky 1, 2 a 4). Zápalové reakcie sú tiež spojené so starnutím. Astrocyty sa podieľajú na neurozápale v mozgu [36]. Starnutie astrocytov prispieva k progresii kognitívnych abnormalít [37]. Neurozápal teda môže súvisieť so starnutím v astrocytoch. Budúce štúdie musia preskúmať koreláciu medzi neurozápalom a bunkovým starnutím a jeho odlišnými signálnymi dráhami.

V tejto štúdii rotenón upreguloval aktivitu kinázy LRRK2. Táto štúdia však nepreukázala účinok inhibítora kinázy LRRK2 na mutant G2019S. Bunková senescencia sa skúmala po transfekcii mutantu G2019SLRRK2 v dSH bunkách a potkaních primárnych neurónoch. Predĺžená expresia G2019S LRRK2 v dSH bunkách a potkaních primárnych neurónoch významne zvýšila hladiny -gal a aktivitu SA-gal. Ošetrenie buniek transfekovaných G2019S LRRK2-inhibítorom kinázy LRRK2 alebo expresia D1994A LRRK2 nezvyšovalo hladiny -gal a aktivitu SA-gal (doplnkový obrázok 2). Predtým sme uviedli, že hladiny agregátov -gal a -syn v mozgovom lyzáte 24-týždňových myší exprimujúcich G2019S boli vyššie ako hladiny u vekovo zodpovedajúcich súrodencov [10]. Liečba inhibítorom LRRK2 výrazne nezmiernila starnutie buniek indukované nízkou dávkou rotenónu u myší. Farmakologické pokroky však môžu zvýšiť terapeutický účinok inhibítorov kinázy LRRK2 u myší (obrázok 6). Budúce štúdie sa musia zamerať na zlepšenie farmakologických účinkov a bezpečnostného profilu inhibítorov kinázy LRRK2. Podávanie inhibítora kinázy LRRK2 môže slúžiť ako uskutočniteľná terapeutická stratégia pre PD s vysokou aktivitou kinázy LRRK2, pretože môže zmierniť oxidačný stres alebo toxické účinky mutantov LRRK2 (obrázok 7). Aktivita kinázy LRRK2 v ľudských biofluidoch, ako napr. sérum, cerebrospinálny mok a moč môžu slúžiť ako prognostický biomarker na určenie optimálnej liečby pre pacientov s PD vykazujúcich zvýšenú aktivitu kinázy LRRK2.

5. Závery

Zistenia tejto štúdie naznačujú, že liečba inhibítormi kinázy LRRK2 zmierňuje starnutie buniek vyvolané miernym a dlhodobým dávkovaním rotenónu. Táto štúdia demonštrovala kritickú úlohu LRRK2 v dráhe p53-p21, ktorá sprostredkováva bunkovú starnutie, a poskytla nový pohľad na vývoj terapie PD pomocou inhibítorov kinázy LRRK2.

Tento článok je prevzatý zo zväzku Hindawi Oxidative Medicine and Cellular Longevity Volume 2021, ID článku 9969842, 16 strán https://doi.org/10.1155/2021/9969842