Melatonín zabraňuje infiltrácii T lymfocytov do obličiek hypertenzných potkanov, vyvolanej diétou s vysokým obsahom soli, tým, že bráni expresii chemokínov ligandu CXCR3
Mar 14, 2022
Ďalšie informácie:{0}}
Ariel Bier1, Rawan Khashab2, Yehonatan Sharabi1,2,3, Ehud Grossman1,2,3a Avshalom Leibowitz1,2,3,*
1Medicine D, The Chaim Sheba Medical Center, Tel-Hashomer 5262000, Izrael; arielbier@gmail.com (AB);Yehonatan.Sharabi@sheba.health.gov.il (YS); Ehud.Grossman@sheba.health.gov.il (EG)2 Hypertension Unit, the Chaim Sheba Medical Center, Tel-Hashomer 5262000, Israel;rawankhasbab@gmail.com3Sacklerova lekárska fakulta, Tel-Avivská univerzita, Tel-Aviv 6997801, Izrael*
Abstrakt: V predchádzajúcej štúdii sme to dokázalimelatonínzabraňujeobličkypoškodenie v modeli hypertenzie vyvolanej soľou znížením oxidačného stresu. Predpokladali sme, že tento účinok zahŕňa imunomodulačné vlastnosti melatonínu. Štúdia in vivo – Dahlovo krysy citlivé na soľ (DSS) dostávali normálne krmivo, diétu s vysokým obsahom soli (HSD) alebo HSD amelatonín(30 mg/kg/deň) vo vode počas 8 týždňov.Obličkyboli zozbierané na okamžitú izoláciu lymfocytov a ich charakterizáciu prietokovou cytometriou (CD3 plus CD4 plus a CD3 plus CD8 plus) a pre chemoatraktant lymfocytov (hlavne CXCLchemokíny) štúdie génovej expresie. In vitro štúdia na potkanoch, mezangiálne bunky (RMC) boli kultivované v médiu s vysokým obsahom soli bez a smelatonín. HSD bola spojená s významnou renálnou infiltráciou CD4 plus a CD8 plus T lymfocytov v porovnaní s kontrolou. Melatonín významne znížil infiltráciu obličkových lymfocytov. HSD významne zvýšilo expresiu mRNA CXCLchemokíny.Pridanie melatonínu k HSD tento efekt zrušilo. Ošetrenie buniek RMC soľou zvýšilo expresiu CXCL10 a CXCL11, ale nie CXCL9. Pridávaniemelatoníndo kultivačných médií zabránili tomuto nárastu. Liečba potkanov kŕmených HSD melatonínom znížila expresiu chemoatraktantu mRNA obličkových lymfocytov a je spojená s významným znížením infiltrácie obličkových T lymfocytov. Soľ môže mať priamy účinok na obličkové bunky produkujúce chemokíny, čo je otupené liečbou melatonínom.
Kľúčové slová:melatonín; soľ; T-lymfocyty; hypertenzia;obličky; CXCL 9; CXCL 10; CXCL 11
1. Úvod
Hypertenzia (HTN) je hlavným modifikovateľným kardiovaskulárnym rizikovým faktorom. V dôsledku starnutia populácie sa prevalencia HTN neustále zvyšuje, v pokročilom veku dosahuje až 30 percent [1]. Napriek rôznym liečebným možnostiam je celosvetová kontrola HTN slabá. Dôsledky nekontrolovanej HTN sú zničujúce a majú obrovský negatívny vplyv na verejné zdravie [2].
Na patogenéze HTN sa podieľajú rôzne behaviorálne, environmentálne a genetické faktory. Vysoký obsah soli v západnej strave sa považuje za hlavný prispievateľ k HTN a je spojený so zvýšenou chorobnosťou a úmrtnosťou. Usmernenia a verejné iniciatívy odporúčajú znížiť príjem soli pre bežnú populáciu. Nie každý jednotlivec však môže mať prospech z tohto obmedzenia, pretože patofyziológia spájajúca citlivosť na soľ s HTN nie je úplne pochopená a vyžaduje lepšie pochopenie mechanizmu [3]. Nové stratégie sú teda kľúčové pre lepšie pochopenie a kontrolu HTN, vďaka čomu sú nové výskumné paradigmy okamžite potrebné.
Zistilo sa, že zápal a oxidačný stres sa podieľajú na patogenéze esenciálnych HTN. Počas skúmania spúšťačov, ktoré iniciujú a pokračujú tieto procesy, mnohé experimentálne modely HTN naznačujú zapojenie adaptívnej imunitnej odpovede [4].
Kliknite naVýhody a vedľajšie účinky Cistanche na funkciu obličiek
Indície spájajúce adaptívnu imunitu s HTN existujú už od 60. rokov 20. storočia. Avšak až v poslednom čase, s lepším pochopením imunitného systému, bolo možné v tomto smere dosiahnuť pokrok. Priekopnícka štúdia Guzika a kol. preukázali, že HTN soľ angiotenzínu (Ang) II alebo deoxykortikosterónu (DOC) bola otupená u myší rag1-/-, ktoré majú nedostatok T a B lymfocytov, a adoptívny prenos T, ale nie B buniek, mohol obnoviť BP odpoveď [5]. Od tohto článku sa zistilo, že rôzne zložky adoptívnej imunity sú relevantné pre patogenézu HTN vo väčšine bežných zvieracích modelov. Úloha T buniek v modeli HTN indukovaného soľou bola tiež dôkladne študovaná. Štúdie in vitro ukazujú, že soľ môže tlačiť na diferenciáciu naivných T buniek na TH17 bunky [6]. Početné práce in vivo na modeloch HTN indukovaných diétou s vysokým obsahom soli (HSD), ako sú napríklad potkany Dhal citlivé na soľ (DSS), preukázali rozsiahlu infiltráciu obličkových T buniek [7–9].
Medzi mnohými fyziologickými procesmimelatonínuzapojenie do regulácie krvného tlaku je do istej miery intuitívne. Cirkadiánny vzorec krvného tlaku podporuje rozsiahly výskum týkajúci sa melatonínu a HTN. Mnohé práce v minulosti na ľuďoch a na experimentálnych modeloch spájali nízke hladiny melatonínu s HTN [10]. Niektoré klinické údaje naznačujú, že suplementácia melatonínu môže liečiť HTN, najmä u pacientov s nočnou HTN [11]. Nekonzistentnosť týchto údajov však vyvoláva otázky, či sa necirkadiánne vlastnosti melatonínu podieľajú aj na regulácii krvného tlaku.
Protizápalové a antioxidačné vlastnosti melatonínu naznačujú, že melatonín interaguje s imunitným systémom. Nové údaje naznačujú úlohu melatonínovej signalizácie pri vývoji, aktivácii, diferenciácii a pamäti T buniek. Existuje dôkaz, žemelatonínmembránové a jadrové receptory sú prítomné na T bunkách [12,13].melatonínovplyvňuje produkciu mnohých cytokínov zapojených do imunitnej odpovede, ako je interferón (IFN) – ktorý je kľúčovým regulátorom Th1 odpovede [14].
Oxidačný stres a odpoveď T buniek podľa niektorých výskumníkov spoločne podporujú rozvoj HTN a hypertenzného poškodenia orgánov [15]. V našej predchádzajúcej práci sme to demonštrovalimelatonínznižuje lokálny (renálny) oxidačný stres a zabraňuje soľou indukovanej renálnej fibróze a proteinúrii v modeli HTN potkanov citlivých na soľ (model DSS) [16]. Pretože oxidačný stres má kľúčovú úlohu v adaptívnej imunitnej odpovedi spojenej s HTN, predpokladali sme, že imunomodulačné vlastnosti melatonínu sú zodpovedné za jeho ochrannú úlohu v HTN indukovanej HTN.
Cieľom tejto štúdie je zhodnotiť, čimelatonínznižuje soľ indukovanú reakciu T buniek a objasňuje mechanizmy zodpovedné za tento účinok.
2. Materiály a metódy
2.1. Zvieratá a protokol štúdie
Protokol štúdie bol schválený inštitucionálnym výborom pre etiku zvierat v medicínskom centre Sheba v Izraeli. Ich zdravotný stav sa monitoroval meraním telesnej hmotnosti a denným všeobecným pozorovaním pohybu a zdravotných podmienok každého zvieraťa. Samce potkanov Dahl citlivých na soľ, štyri týždne staré (RGD Cat# 1582190, RRID: RGD_1582190), boli umiestnené v zariadení pre zvieratá v bežných klietkach (dva potkany na klietku) pri 22 ◦C s cyklom 14 svetlo/10 h tma. Potkany boli udržiavané na normálnej slanej strave a dostávali vodu z vodovodu na pitie ad libitum po dobu piatich dní aklimatizácie. Potkany sa potom rozdelili do troch skupín (n=8) podľa stravy počas 8 týždňov. Podľa etickej komisie mali byť usmrtené zvieratá, ktoré vykazovali známky choroby a utrpenia.
Kontrolná skupina bola kŕmená štandardným krmivom pre potkany (2018 SC; Teklad Envigo, Madison, WI, USA) a vodou z vodovodu; skupina s vysokým obsahom soli (HSD) bola kŕmená prispôsobenou obohatenou slanou stravou (4 percentá) (TD.120485; Teklad Envigo, Madison, WI, USA) a vodou z vodovodu.melatonínskupina bola kŕmená rovnakou stravou obohatenou o soľ (4 percentá) s melatonínom (M5250; Sigma, Rehovot, Izrael) (30 mg/kg/deň) v pitnej vode. Pravidelne sa merala telesná hmotnosť a spotreba vody. Správne množstvo melatonínu bolo rozpustené v zodpovedajúcej potrebe vody na každú klietku, aby sa poskytla správna dávka pre každé zviera. Deň nula je definovaný ako deň začiatku spotreby HSD a melatonínu. Na konci štúdie boli potkany usmrtené hlbokou anestézou 3 percentami izofluranu (hĺbka anestézie potvrdená stlačením zadnej nohy) aobličkyboli zozbierané. Obe obličky boli odstránené a hemisované. Obličky sa odobrali na analýzu prietokovou cytometriou s výnimkou niekoľkých častí, ktoré sa rýchlo vybrali a rýchlo zmrazili v tekutom N2 a skladovali pri -80 °C. Na extrakciu RNA sa použili zmrazené tkanivá.
Symptómy ochorenia obličiek Cistanche
2.2. Kvantitatívna reverzná transkripčná PCR v reálnom čase
Hladiny expresie mRNA génov boli zistené vobličkytkaniva kvantitatívnou reverznou transkriptázou-PCR v reálnom čase (qRT-PCR). Celková RNA sa extrahovala z obličkového tkaniva pomocou súpravy NucleoSpin RNA Kit (MACHERY-NAGEL, Düren, Nemecko). Reverzná transkripcia sa uskutočnila pomocou súpravy Applied Biosystems High-Capacity cDNARreverse Transscription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Reakcie qRT-PCR sa uskutočnili pomocou Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, UK) a Applied Biosystems 7500 systému PCR v reálnom čase. Podmienky cyklovania boli: prvý jednotlivý krok 95 ◦C počas 0,20 min a potom 40 cyklov fázy tavenia počas 3 s pri 95 ◦C a predĺžená fáza 30 s pri 60 ◦C. Na konci 40 cyklov sa uskutočnila fáza krivky topenia. Ako vnútorná kontrola sa použila mRNA podjednotky PO (Rplp0) ribozomálneho proteínu. Priméry sú uvedené v tabuľke 1.
Tabuľka 1. Zoznam potkaních primérov použitých v tejto štúdii.
2.3. Izolácia T buniek z obličiek
Po odstránení obličkovej kapsuly, dveobličkyboli rozdrvené a dráždené piestom 2 ml injekčnej striekačky cez 100 um bunkové sitko v RPMI 1640 obsahujúcom 2 mML-glutamínu, 10 percent FBS, 10 ug/ml DNázy 1 (Stem Cells technologies, Cambridge, MA , USA) a 0,1 percenta kolagenázy typu IV (CLS 4, Worthington Decatur, AL, USA). Roztok sa inkuboval 25 minút pri 37 °C. Premývací roztok (DPBS/2 percentá FBS/2 mM EDTA) sa potom pridal do obličkového homogenátu na objem 45 ml a prefiltroval sa cez 70 um bunkové sito. Roztok sa centrifugoval pri 400 x g/7 min. a peleta bola suspendovaná v 5 ml premývacieho roztoku a prefiltrovaná cez 40 um bunkové sitko a znovu odstredená pri 400 x g/7 min. Peleta bola resuspendovaná v 3 ml FBS (10 mM EDTA) a navrstvená na Histopaque-1083 (Sigma, Rehovot, Izrael) a centrifugovaná pri 20 °C pri 400 x g/30 min s vypnutou brzdou. Vrstva mononukleárnych buniek ležiaca nad Histopaque sa odstránila, premyla sa dvakrát premývacím roztokom a suspendovala sa v 5 ml premývacieho roztoku na prietokovú cytometrickú analýzu.
2.4. Prietoková cytometria
Z každej skupiny,obličkyanalyzovalo sa 5 až 7 potkanov. Pre každú vzorku sa odobralo 1 x 106 buniek. Izolované mononukleárne bunky boli inkubované s extracelulárnymi markermi: anti-CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat# 12-0030-82, RRID:AB_465493) a jeho izotypová kontrola (Thermo Fisher Scientific Cat# 12-4742-41, RRID :AB_10753770), anti-CD4 (Thermo FisherScientific Cat# 17-0040-80, RRID:AB_1210581) a jeho izotypová kontrola (Thermo Fisher Scientific Cat# 17-4724-81, RRID: AB_470188), anti-CD8 (Thermo Fisher Scientific Cat# 25-0084-82, RRID:AB_10548361) a jeho izotypová kontrola (Thermo Fisher Scientific Cat# 25-4714-80,RRID: AB_657914). Všetky bunky sa analyzovali prietokovou cytometriou (BD FACSCalibur Flow Cytometry System, RRID: SCR_000401) pomocou softvéru FlowJo (FlowJo, RRID: SCR-008520).
Cistanche-funkcia obličiek
2.5. Bunková kultúra
Bunková línia mezangiálnych potkanov, RMC (ATCC Cat# CRL{{0}}, RRID: CVCL_0506), bola získaná z ATCC®. Bunka bola kultivovaná v Dulbeccovom modifikovanom Eagle médiu (01-055-1A, biologický priemysel, Beit HaEmek, Izrael) s 4 mM L-glutamínom upraveným tak, aby obsahoval 1,5 g/l hydrogénuhličitanu sodného a 4,5 g/l glukózy a doplnený o 0,4 mg/mLG418 a 15 percent fetálneho hovädzieho séra. Melatonín bol získaný od Sigma (M5250 Rehovot, Izrael). A 250 mMmelatonínzásoba sa pripravila v etanole. Bunky boli kultivované v normálnych podmienkach alebo v podmienkach s vysokým obsahom soli (pridaním 80 mM NaCl do média) bez alebo s melatonínom (0,5 mM). Ošetrenie melatonínom bolo načasované 45 minút pred pridaním NaCl do média. Všetky experimenty sa uskutočňovali v 6-jamkových doštičkách s 3 x 105 bunkami na jamku a boli uskutočnené 6 nezávislými skúškami.
2.6. Štatistická analýza
Údaje sú prezentované ako priemer ± SEM. Štatistické analýzy sa uskutočnili pomocou IBMSPSS Statistics, RRID: SCR_019096. Jednosmerná analýza rozptylu (ANOVA) a posthoc Tukeyova metóda skúmali rozdiely medzi skupinami. Údaje qPCR v reálnom čase boli analyzované pomocou DataAssist, RRID: SCR_014969.
3. Výsledky
3.1. Melatonín chráni potkany konzumujúce HSD
Vek potkanov počas tejto štúdie bol 4–13 týždňov. V tomto veku je dobrý stav potkanov indikovaný prírastkom hmotnosti, ktorý vykazovala kontrolná skupina [17]. Skupina HSD však dosiahla plató na 30. deň a po pridanímelatonínna HSD zlepšil tento jav (obrázok 1A). Skupina HSD vykazovala vysokú mieru úmrtnosti, kde 50 percent potkanov zomrelo alebo malo klinický stav, ktorý si vyžadoval eutanáziu podľa pravidiel zvieracej etickej komisie počas experimentálneho obdobia. Doplnky melatonínu významne zabránili úmrtnosti potkanov, pričom iba jeden z ôsmich potkanov zomrel na 58. deň, na konci experimentálneho obdobia (obrázok 1B).
Postava 1.melatonínzlepšil krvný tlak a prežitie pri HSD. Potkany DSS boli liečené 9 týždňov HSD s melatonínom a bez melatonínu. Diéta s vysokým obsahom soli znížila telesnú hmotnosť od 36. dňa a melatonín zmiernil tento účinok (A). HSD zvýšila úmrtnosť od 4. dňa0. Liečba HSD-fedratov melatonínom zlepšuje ich prežitie. (B). (n=8) *-p Menšie alebo rovné 0,05 soľ a soľ plus melatonín oproti kontrole. #-p Menšie alebo rovné 0,05 soli oproti kontrole a soli plus melatonínu. HSD – diéta s vysokým obsahom soli.
3.2. Melatonín zabraňuje infiltrácii T-buniek v obličkách vyvolanej HSD
Izolovali sme bunky zobličkya priradil ich k T bunkovému markeru, CD3. Bunky CD3 plus boli priradené k CD4 a CD8. CD3 plus CD4 plus aj CD3 plus CD8 plus boli významne vyššie v HSD (5,18 ± 1,62 a 4,6 ± 0,75 percent, v uvedenom poradí) v porovnaní s kontrolou (0,16 ± {{18}). }.{{20}}2 a 0,95 ± 0,15 percenta) amelatonínsuplementácia k HSD znížila bunky CD3 plus CD4 plus a CD3 plus CD8 plus späť na kontrolné úrovne (0,68 ± 0,21 a 1,37 ± 0,45, v tomto poradí) (obrázok 2A – D).
Obrázok 2. Melatonín zabraňuje infiltrácii T buniek doobličky. T bunky boli izolované z obličiek potkanov a boli kontrolované na CD3. CD3-pozitívne bunky boli kontrolované na CD4 a CD8. Melatonín (C) redukoval CD3 plus CD4 plus aj CD3 plus CD8 plus v porovnaní s HSD bez melatonínu (B) bez rozdielu od kontrolnej skupiny (A). Analýza pre všetky potkany je uvedená v (D) (n=7–8). HSD – diéta s vysokým obsahom soli. *-p Menšie alebo rovné 0.{15}}5 verzus kontrola. #-p Menšie alebo rovné 0,05 oproti soli plus melatonínu.
3.3. Melatonín redukuje určité obličkové chemokíny, ktoré boli upregulované pri HSD
Nábor T buniek do zápalových tkanív je regulovaný lokálnou expresiou chemokínov. Preto sme merali expresiu dvoch chemokínových rodín u potkanovobličky: rodina chemokínových (CXC motív) ligandov (CXCL) a chemokínových (C-Cmotif) ligandov (CCL).
Pre rodinu CXCL, CXCL 9, 10 a 11, ktoré priťahujú T bunky do ich cieľového tkaniva pomocou CXCR3 receptora na T bunkách, boli významne upregulované u HSD potkanov. Doplneniemelatonínk HSD znížili ich expresiu späť na kontrolné úrovne. Rovnaký vzor bol detegovaný pre CXCL 1 a 16. Avšak pre CXCL12 nebola v HSD detegovaná žiadna upregulácia (obrázok 3A).
Pre rodinu CCL CCL 2, 4, 12, 17, 19 a CX3CL1 nevykazovali žiadnu upreguláciu v HSD. CCL3 bol upregulovaný v HSD, ale nebola zistená žiadna významná zmena po pridaní melatonínu do stravy. Pre CCL7 významná upregulácia v HSD a významná downregulácia s pridanímmelatonínna HSD (obrázok 3B).
Obrázok 3. Upreguláciaobličiekchemokínypri HSD s melatonínom a bez melatonínu. Expresia chemokínového (CXC motív) ligandu (CXCL) rodiny (A), chemokínového (CC motív) ligandovej rodiny a CX3CL1 (B) bola stanovená u potkanov. (n=7–8) *-p Menšie alebo rovné 0.05 verzus kontrola. #-p Menšie alebo rovné 0,05 oproti soli plus melatonizácia. HSD – diéta s vysokým obsahom soli.
3.4. Priamy účinok melatonínu na mezangiálnu bunkovú líniu RMC
Potom sme sa zamerali na CXCL9, 10 a 11, ktoré priťahujú T bunky väzbou na receptor CXCR3. Určili sme ich výrazchemokínyv bunkách RMC, ktoré sú krysou mezangiálnou bunkovou líniou.
Bunky sme ošetrili 80 mM NaCl bez a s 0,5 mMmelatonín. Táto koncentrácia NaCl významne zvýšila expresiu CXCR10 2,4 ± 0.26-krát v porovnaní s kontrolou a pridanie 0,5 mM melatonínu významne znížilo tento výraz na 1,4 ± 0.{{10}}násobok v porovnaní s kontrolou (obrázok 4A). Pre CXCL11 80 mM NaCl signifikantne zvýšilo expresiu 3 ± 0.{16}}krát v porovnaní s kontrolou a pridanie 0,5 mM melatonínu výrazne znížilo túto expresiu na 1,8 ± 0.{22 }}násobok v porovnaní s kontrolou (obrázok 4B). CXCL9 sa nezistil v RMC bunkách.
Obrázok 4. Soľ upregulovala expresiu CXCL10 a CXCL11 v mezangiálnej bunkovej línii, kde liečba melatonom znížila jej expresiu. RMC (potkania mezangiálne bunkové línie) boli ošetrené soľou 80 mM s a bez 0,5 mM melatonínu. CXCL10 (A) a CXCL11 (B) boli upregulované úpravou soľou a pridanímmelatonínznížiť túto reguláciu. Grafy predstavujú 6 nezávislých pokusov. *-p Menšie alebo rovné 0.{5}}01 versus kontrola #-p Menšie alebo rovné 0.005 versus soľ 80 mM a melatonín 0,5 mM. $-p Menšie alebo rovné 0,05 oproti soli 80 mM a melatonínu 0,5 mM.
4. Diskusia
Priaznivý účinokmelatonínna HTN bol preukázaný v predchádzajúcich štúdiách a bol navrhnutý ako možný postup pre HTN rezistentnú na liečbu [18]. V našej prvej štúdii sme sa zamerali na oxidačný stres a odhalili sme, že melatonín znižuje oxidačný stres vyvolaný HSD. V tejto štúdii sme sa zamerali na adaptívny imunitný efekt a ukázali sme, že melatonín zlepšuje prežitie potkanov kŕmených HSD. Tento účinok je spojený so znížením počtu T buniek infiltrujúcich obličky a ich zníženímobličkyexpresia chemokínov.
Historické údaje ukazujú, že u potkanov DSS konzumujúcich HSD sa vyvinula ťažká HTN a vykazovali vyššiu mortalitu [19]. Dahl sám pri vytváraní modelu uviedol, že keď boli potkany DSS umiestnené na HSD (8 percent NaCl) pri odstavení (vo veku 21 až 23 dní), rýchlo sa u nich vyvinula HTN a všetky zomreli v 16. týždni kŕmenia soľou [20]. Lateron, po niektorých modifikáciách kmeňa, Rapp et al. uviedli, že všetky potkany boli mŕtve do ôsmich týždňov od HSD (8 percent NaCl) [21]. Potkany v našej štúdii mali vysokú mieru úmrtnosti, ale nedosiahli 100 percent, pravdepodobne kvôli nižšiemu percentu (4 percentá) soli v ich strave. Napriek tomu je zrejmé, žemelatonínsuplementácia významne zabránila úmrtnosti potkanov.
Priberanie na váhe je ukazovateľom pohody potkanov vo veku 4 – 13 týždňov. DSS ratsoriginate zo Sprague Dawley, čo je dobre charakterizovaný kmeň. Predpokladá sa, že vo veku potkanov, ktoré sme použili v našich experimentoch, potkany neustále priberajú na váhe [22]. V mnohých štúdiách na zvieratách sa redukcia hmotnosti považuje za jeden z „koncových bodov“ experimentov [23]. Z niekoľkých štúdií je zrejmé, že HSD u DSS potkanov vedie k nižšej miere prírastku hmotnosti v porovnaní s kontrolami [24,25]. V súlade s týmito štúdiami sme pozorovali aj hmotnostné rozdiely medzi skupinami. Tu potkany nepribrali na váhe po štyroch týždňoch HSD. Melatonín tiež zastavil tento účinok HSD, pretože potkany, ktoré boli liečené melatonínom, pokračovali v priberaní na váhe, aj keď menej ako kontrolné.
Schopnosťmelatonínna zníženie krvného tlaku na zvieracích modeloch bol objavený koncom sedemdesiatych rokov 20. storočia [26–28]. Odvtedy to bolo hlásené v niekoľkých ďalších modeloch, ako napríklad, že diéta s vysokým obsahom fruktózy indukuje metabolický syndróm u spontánne hypertenzných potkanov [29,30]. Naše štúdie v tejto oblasti sú prvé, ktoré ukazujú, že melatonín hrá úlohu v soli indukovanej HTN tým, že zabraňuje poškodeniu orgánov a znižuje úmrtnosť.
V tejto štúdii sme ukázali, že HSD indukuje infiltráciu T lymfocytov doobličky, proces, ktorý bol opísaný u potkanov DSS hlavne Mattsonovou skupinou [31–33]. Kľúčovú úlohu tohto infiltračného procesu v modeli DSS preukázala súčasná štúdia, ktorá pozorovala, že potkany DSS s deficitom T-buniek sú chránené pred HTN indukovaná HSD a prenosom splenocytov exacerbuje HTN senzitívnu na soľ [34].
Melatonín môže ovplyvniť T bunky v rôznych aspektoch (prehľad pozri [35]). Táto štúdia to po prvýkrát ukázalamelatonínznižuje príťažlivosť CD4 plus aj CD8 plus T-buniek kobličkyv HSD. Tento účinok melatonínu môže byť mechanizmom zdôrazňujúcim jeho priaznivý účinok v tomto modeli.
Schopnosť melatonínu redukovať infiltráciu T buniek bola opísaná na myšom modeli experimentálnej autoimunitnej encefalomyelitídy (EAE). V EAE sa ukázalo, že melatonín znižuje infiltráciu CD4 plus T buniek a Th17 buniek do CNS [36,37].
Príťažlivosť T buniek k špecifickému tkanivu je regulovaná hlavne lokálnymi vysokými koncentráciamichemokínyčo sú chemotaktické cytokíny, ktoré riadia migračné vzorce a umiestnenie imunitných buniek. Dve veľké rodiny chemokínov, ktoré indukujú infiltráciu T buniek, sú rodiny chemokínov s motívom CXC (CXCL) a ligandom s motívom CC (CCL) [38].
Cistanche na zlepšenie dysfunkcie obličiek
V našej štúdii sme nenašli konštantný vzor v reakcii rodiny CCL na HSD a namelatonín. Z deviatichchemokínyv tejto rodine boli pozorované iba CCL7 a CLL21 na zvýšenie ich expresie v dôsledku HSD a suplementácia melatonínu ju znížila. HSD zvýšila expresiu CCL3, ale u potkanov liečených melatonínom sa nezistilo žiadne zníženie. Nedávna štúdia na rovnakom modeli ukázala, že HSD upreguluje CCL2 intheobličkypoužitím metódy RNA-Seq [39]. Táto štúdia však testovala hladiny v dňoch 3 a 21 po začatí diéty. V našej štúdii sme hladiny testovali po ôsmich týždňoch. Je možné, že expresia chemokínov sa počas obdobia HSD zmení.
Naopak, hladiny väčšiny CXCL rodiny, vrátane CXCL 1, 9, 10, 11 a 16, sa zvýšili u potkanov liečených HSD amelatonínsuplementácia tento prírastok zrušila. Iba CXCL12 nevykázalo žiadne zvýšenie odpovede na HSD.
CXCL9, CXCL10 a CXCL11, nazývané "interferónom indukovateľné ligandy CXC chemokínového receptora 3", sú indukované IFN- a sú ligandami CXC chemokínového receptora 3 (CXCR3). Štúdie in vivo preukázali ich význam pri aktivácii a nábore T lymfocytov do cieľového orgánu [40–42]. Youn a spol. ukázali u ľudských hypertenzných pacientov renálnu infiltráciu T buniek a zvýšené cirkulujúce hladiny všetkých troch CXCR3chemokíny, čo naznačuje, že CXCR3 a jeho ligandy sú relevantné pre T bunky zapojené do ľudskej HTN [43]. Ďalšia štúdia preukázala, že CXCL10 je zvýšený u pacientov s hypertenziou a jeho hladiny korelujú s ich hodnotami krvného tlaku [44].
Kvôli týmto štúdiám sme sa zamerali na CXCL9, CXCL10 a CXCL11. Kultivovali sme bunkovú líniu mezangiálnych potkanov a ošetrili sme ich 80 mM NaCl a 0,5 mM melatonínu. Zistili sme, že CXCL 10 a 11 sú v bunkách upregulované a melatonín toto zvýšenie ruší. Naše výsledky naznačujú, že účinok soli na zvýšenie CXCL 10 a 11 a opačný účinokmelatonín, boli obe priamo detegované v mezangiálnych bunkách. Naopak, CXCL9 sa v týchto bunkách nezistil.
Naša štúdia má obmedzenia. V našich výsledkoch FACS bolo veľa CD3 plus dvojito negatívnych pre CD4 aj CD8. Rovnaké výsledky boli zaznamenané v Mattsonovej štúdii z roku 2010 [31]. V novších štúdiách Mattsonovej skupiny však bolo CD3 plus CD4-CD8-buniek veľmi málo [32,33,45,46]. Významný pokles v dvojito negatívnych CD3 bunkách by mohol byť výsledkom pridania CD45 markera a iba analýzou buniek, ktoré boli CD45 pozitívne, čo sa uskutočnilo v neskorších štúdiách Mattsona. Je možné, že veľká časť disku CD3 plus CD4-CD8- je artefakt. Pre bunkovú populáciu CD3 plus CD4 plus a CD3 plus CD8 plus však nie je známy žiadny artefakt.
5. Závery
Záverom možno povedať, že diéta s vysokým obsahom soli je spojená s infiltráciou T buniek doobličkyDSS potkanov. Soľ tiež zvýšila expresiu špecifických chemoatraktantov T buniek v obličkách. Liečba smelatonín(30 mg/kg/deň) odstránil tieto účinky (melatonínznižuje HSD-indukovanú infiltráciu T buniek do obličiek spolu so znížením expresie chemokínu ligandu CXCL3).
Naša štúdia in vitro ukazuje, že soľ a melatonín môžu priamo ovplyvňovať expresiu chemoatraktantovobličkybunky.
Autorské príspevky: Conceptualization, AL; formálna analýza, AB a RK; vyšetrovanie, RK;metodika, AB a AL; písanie – pôvodný návrh, AB a AL; písanie – recenzia a úprava, YSand EG Všetci autori si prečítali publikovanú verziu rukopisu a súhlasili s ňou.
Financovanie: Tento výskum nezískal žiadne externé financovanie.
Vyjadrenie inštitucionálneho revízneho výboru: Protokol štúdie bol schválený inštitucionálnym zvieracím etickým výborom v zdravotnom stredisku Sheba, protokol č. 1219/19/ANIM a protokol Ministerstva zdravotníctva č. 16418.
Vyhlásenie o informovanom súhlase: Neuplatňuje sa.
Vyhlásenie o dostupnosti údajov: Údaje uvedené v tejto štúdii sú k dispozícii na požiadanie od príslušného autora.
Poďakovanie: Autori ďakujú Zehave Shabtai za jej vynikajúcu technickú podporu a Michaelovi Kanovskému za jeho redakčné služby.
Konflikty záujmov: Autori nevyhlasujú žiadny konflikt záujmov.
Referencie
1. Olsen, MH; Angell, SY; Asma, S.; Boutouyrie, P.; Burger, D.; Chirinos, JA; Damasceno, A.; Delles, C.; Gimenez-Roqueplo, AP; Hering, D.; a kol. Výzva k akcii a stratégia životného cyklu na riešenie globálneho bremena zvýšeného krvného tlaku na súčasné a budúce generácie: The Lancet Commission on Hypertension. Lancet 2016, 388, 2665–2712. [CrossRef]
2. O'Brien, E. The Lancet Commission on Hypertension: Riešenie globálneho bremena zvýšeného krvného tlaku na súčasné a budúce generácie. J. Clin. Hypertens 2017, 19, 564–568. [CrossRef]
3. O'Donnell, M.; Mente, A.; Yusuf, S. Príjem sodíka a kardiovaskulárne zdravie. Circ. Res. 2015, 116, 1046–1057. [CrossRef]
4. Schiffrin, EL Mechanizmy remodelácie malých artérií, antihypertenzívna terapia a imunitný systém pri hypertenzii.Clin. Vyšetrovať. Med. 2015, 38, E394–E402. [CrossRef]
5. Guzik, TJ; Hoch, NE; hnedá, KA; McCann, LA; Rahman, A.; Dikalov, S.; Goronzy, J.; Weyand, C.; Harrison, GR Úloha T-buniek v genéze hypertenzie a vaskulárnej dysfunkcie indukovanej angiotenzínom II. J. Exp. Med. 2007, 204, 2449–2460. [CrossRef][PubMed]
6. Kleinewietfeld, M.; Manzel, A.; Titze, J.; Kvakan, H.; Yosef, N.; Linker, RA; Muller, DN; Hafler, DA Chlorid sodný poháňa autoimunitné ochorenie indukciou patogénnych buniek TH17. Príroda 2013, 496, 518–522. [CrossRef]
7. Mattson, DL; Lund, H.; Guo, C.; Rudemiller, N.; Geurts, AM; Jacob, H. Genetická mutácia génu 1 aktivujúceho rekombináciu u potkanov citlivých na soľ Dahl zmierňuje hypertenziu a poškodenie obličiek. Am. J. Physiol. Regul. Celé číslo. Comp. Physiol. 2013, 304, 407 – 414.[CrossRef]
8. Mattson, DL Infiltrácia imunitných buniek vobličkypri hypertenzii citlivej na soľ a poškodení obličiek. Am. J. Physiol. Ren. Physiol.2014, 307. [CrossRef] [PubMed]
9. Lu, X.; Crowley, SD zápal pri hypertenzii citlivej na soľ a poškodení obličiek. Curr. Hypertens Rep. 2018, 20. [CrossRef][PubMed]
10. Baker, J.; Kempinski, K. Role ofmelatonínpri regulácii krvného tlaku: Doplnkové antihypertenzívum. Clin. Exp. Pharm.Physiol. 2018, 45, 755–766. [CrossRef] [PubMed]
11. Grossman, E.; Laudon, M.; Zisapel, N. Účinok melatonínu na nočný krvný tlak: Metaanalýza randomizovaných kontrolovaných štúdií. Vasc. Health Risk Manag. 2011, 7, 577–584. [CrossRef] [PubMed]
12. Pozo, D.; Delgado, M.; Fernandez-Santos, JM; Calvo, JR; Gomariz, RP; Martin-Lacave, I.; Ortiz, GG; Guerrero, JM Expresia mRNA Mella-melatonínového receptora v podskupinách T a B lymfocytov z týmusu potkanov a sleziny. Faseb J. Off. Publ. Fed.Am. Soc. Exp. Biol. 1997, 11, 466-473. [CrossRef]
13. Guerrero, JM; Pozo, D.; García-Mauriño, S.; Osuna, C.; Molinero, P.; Calvo, JR Zapojenie jadrových receptorov do zvýšenej produkcie IL-2 melatonínom v bunkách Jurkat. Ann. NY Acad. Sci. 2000, 917, 397-403. [CrossRef] [PubMed]
14. Farez, MF; Mascanfroni, ID; Méndez-Huergo, SP; Yeste, A.; Murugaiyan, G.; Garo, LP; Balbuena Aguirre, ME; Patel, B.; Ysrraelit, MC; Zhu, C.; a kol.melatonínPrispieva k sezónnosti relapsov sklerózy multiplex. Cell 2015, 162, 1338–1352.[CrossRef] [PubMed]
15. Kirabo, A.; Fontána, V.; de Faria, APC; Loperena, R.; Galindo, CL; Wu, J.; Bikinejevová, AT; Dikalov, S.; Xiao, L.; Chen, W.; a kol. DC izoketálovo modifikované proteíny aktivujú T bunky a podporujú hypertenziu. J. Clin. Vyšetrovať. 2014, 124, 4642–4656. [CrossRef][PubMed]
16. Leibowitz, A.; Volkov, A.; Voloshin, K.; Shemesh, C.; Barshack, I.; Grossman, E. Melatonín zabraňujeobličkyzranenia v modeli hypertenzie vyvolanej vysokou slanou diétou znížením oxidačného stresu. J. Pineal Res. 2016, 60, 48–54. [CrossRef] [PubMed]
17. Hawkins, P.; Morton, DB; Burman, O.; Dennison, N.; Honess, P.; Jennings, M.; Lane, S.; Middleton, V.; Roughan, JV; Wells, S.; a kol. Návod na definovanie a implementáciu protokolov na hodnotenie dobrých životných podmienok laboratórnych zvierat: Jedenásta správa spoločnej pracovnej skupiny BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW pre zušľachťovanie. Lab. Anim. 2011, 45, 1–13. [CrossRef]
18. Šimko, F.; Reiter, RJ; Paulis, L.melatonínako racionálna alternatíva pri konzervatívnej liečbe rezistentnej hypertenzie.Hypertens Res. 2019, 42, 1828–1831. [CrossRef] [PubMed]
19. Potkany Rapp, JP Dahl citlivé na soľ a odolné voči soli. Hypertenzia 1982, 4, 753-763. [CrossRef]
20. Dahl, LK; Knudsen, KD; Heine, MA; Leitl, GJ Účinky chronického nadmerného príjmu soli. Modifikácia experimentálnej hypertenzie u potkanov zmenami v strave. Circ. Res. 1968, 22, 11–18. [CrossRef] [PubMed]
21. Rapp, JP; Dene, H. Vývoj a charakteristiky inbredných kmeňov potkanov Dahl citlivých na soľ a odolných voči soli. Hypertens 1985, 7, 340-349. [CrossRef]
22. Brower, M.; Grace, M.; Kotz, CM; Koya, V. Porovnávacia analýza rastových charakteristík potkanov Sprague Dawley získaných z rôznych zdrojov. Lab. Anim Res. 2015, 31, 166–173. [CrossRef]
23. Talbot, SR; Biernat, S.; Bleich, A.; van Dijk, RM; Ernst, L.; Häger, C.; Hilgers, SOA; Koegel, B.; Koska, I.; Kuhla, A.; et al. Definovanie redukcie telesnej hmotnosti ako humánneho koncového bodu: kritické hodnotenie. Lab. Anim 2020, 54, 99–110. [CrossRef] [PubMed]
24. Geschka, S.; Kretschmer, A.; Sharkovska, Y.; Evgenov, OV; Lawrenz, B.; Hucke, A.; Hocher, B.; Stasch, J.-P. Stimulácia rozpustnej guanylátcyklázy zabraňuje remodelácii fibrotického tkaniva a zlepšuje prežitie u potkanov Dahl citlivých na soľ. PLoS ONE 2011, 6,e21853. [CrossRef] [PubMed]
25. Wang, Y.; Mu, JJ; Liu, FQ; Ren, KY; Xiao, HY; Yang, Z.; Yuan, ZY Prechod epitelu na mezenchým vyvolaný soľou u potkanov citlivých na Dahlsalt závisí od zvýšeného krvného tlaku. Braz. J. Med. Biol. Res. Bras. Pesquisa Med. E Biol. 2014, 47, 223–230.[CrossRef]
26. Holmes, SW; Sugden, D. Proceedings: Vplyv melatonínu na hypertenziu vyvolanú pinealektómiou u potkanov. Br. J. Pharm. 1976, 56, 360P – 361P.
27. Zanoboni, A.; Zanoboni-Muciaccia, W. Experimentálna hypertenzia u pinealektomizovaných potkanov. Life Sci. 1967, 6, 2327–2331. [CrossRef]
28. Zanoboni, A.; Forni, A.; Zanoboni-Muciaccia, W.; Zanussi, C. Vplyv pinealektómie na arteriálny krvný tlak a príjem potravy a vody u potkanov. J. Endocrinol. Vyšetrovať. 1978, 1, 125–130. [CrossRef] [PubMed]
29. Pechánová, O.; Zicha, J.; Paulis, L.; Zenebe, W.; Dobesová, Z.; Kojsová, S.; Jendeková, L.; Sládková, M.; Dovinová, I.; Šimko, F.; a kol. Účinok N-acetylcysteínu a melatonínu u dospelých spontánne hypertenzných potkanov s preukázanou hypertenziou. Eur. J.Pharmcol. 2007, 561, 129–136. [CrossRef] [PubMed]
30. Leibowitz, A.; Peleg, E.; Sharabi, Y.; Shabtai, Z.; Shamiss, A.; Grossman, E. Úlohamelatonínv patogenéze hypertenzie u potkanov s metabolickým syndrómom. Am. J. Hypertens 2008, 21. [CrossRef] [PubMed]
31. De Miguel, C.; Das, S.; Lund, H.; Mattson, DL T lymfocyty sprostredkovávajú hypertenziu aobličkypoškodenie u Dahlových potkanov citlivých na soľ. Am. J. Physiol. Regul. Celé číslo. Comp. Physiol. 2010, 298, R1136 – R1142. [CrossRef] [PubMed]
32. Evans, LC; Petrová, G.; Kurth, T.; Yang, C.; Bukowy, JD; Mattson, DL; Cowley, AW Pohon zvýšeného perfúzneho tlaku Infiltrácia T-buniek u Dahlovho potkana citlivého na soľ. Hypertenzia 2017, 70, 543–551. [CrossRef]
33. Abais-Battad, JM; Alsheikh, AJ; Pan, X.; Fehrenbach, DJ; Dasinger, JH; Lund, H.; Roberts, ML; Kriegel, AJ; Cowley, AWJ; Kidambi, S.; a kol. Dietetické účinky na hypertenziu citlivú na Dahlovu soľ, poškodenie obličiek a transkriptóm T lymfocytov. Hypertens 2019, 74, 854–863. [CrossRef] [PubMed]
34. Fehrenbach, DJ; Dasinger, JH; Lund, H.; Zmaj, J.; Mattson, DL Prenos splenocytov zhoršuje hypertenziu u potkanov citlivých na soľ. Exp. Physiol. 2020, 105, 864–875. [CrossRef] [PubMed]
35. Ren, W.; Liu, G.; Chen, S.; Yin, J.; Wang, J.; Tan, B.; Wu, G.; Bazer, FW; Peng, Y.; Li, T.; a kol. Melatonínová signalizácia v T bunkách: Funkcie a aplikácie. J. Pineal Res. 2017, 62. [CrossRef]
36. Álvarez-Sánchez, N.; Cruz-Chamorro, I.; López-González, A.; Utrilla, JC; Fernández-Santos, JM; Martínez-López, A.; Lardone, PJ; Guerrero, JM; Carrillo-Vico, A. Melatonín kontroluje experimentálnu autoimunitnú encefalomyelitídu zmenou T efektorovej/regulačnej rovnováhy. Správanie mozgu. Immun. 2015, 50, 101–114. [CrossRef]
37. Chen, S.-J.; Huang, S.-H.; Chen, J.-W.; Wang, K.-C.; Yang, Y.-R.; Liu, P.-F.; Lin, G.-J.; Sytwu, H.-K.melatonínzvyšuje expresiu interleukínu 10 a potláča chemotaxiu na inhibíciu zápalu in situ a znižuje závažnosť experimentálnej autoimunitnej encefalomyelitídy. Int. Immunopharmacol. 2016, 31, 169–177. [CrossRef] [PubMed]
38. Griffith, JW; Sokol, CL; Luster, ADChemokínya chemokínové receptory: polohovacie bunky pre obranu a imunitu hostiteľa.Annu. Rev. Immunol. 2014, 32, 659–702. [CrossRef] [PubMed]
39. Alsheikh, AJ; Dasinger, JH; Abais-Battad, JM; Fehrenbach, DJ; Yang, C.; Cowley, AWJ; Mattson, DL CCL2 sprostredkuje skorú infiltráciu leukocytov v obličkách počas hypertenzie citlivej na soľ. Am. J. Physiol. Ren. Physiol. 2020, 318, F982 – F993. [CrossRef][PubMed]
40. Liu, L.; Callahan, MK; Huang, D.; Ransohoff, RM Chemokínový receptor CXCR3: Neočakávaná záhada. Curr. Hore. Dev. Biol. 2005, 68, 149-181. [CrossRef] [PubMed]
41. Groom, JR; Lesk, AD CXCR3 ligandy: redundantné, kolaboratívne a antagonistické funkcie. Immunol. Cell Biol. 2011, 89,207-215. [CrossRef] [PubMed]
42. Van Raemdonck, K.; Van den Steen, PE; Liekens, S.; Van Damme, J.; Struyf, S. Ligandy CXCR3 pri chorobe a terapii. Cytokínový rastový faktor Rev. 2015, 26, 311–327. [CrossRef] [PubMed]
43. Youn, J.-C.; Yu, HT; Lim, BJ; Koh, MJ; Lee, J.; Chang, D.-Y.; Choi, YS; Lee, S.-H.; Kang, S.-M.; Jang, Y.; a kol. Imunosenescentné CD8 plus T bunky a CXC chemokínový receptor typu 3chemokínysú zvýšené pri hypertenzii u ľudí. Hypertens 2013, 62, 126–133.[CrossRef] [PubMed]
44. Stumpf, C.; Auer, C.; Yilmaz, A.; Lewczuk, P.; Klinghammer, L.; Schneider, M.; Daniel, WG; Schmieder, RE; Garlichs, CDSérové hladiny Th1 chemoatraktantu interferón-gama-indukovateľného proteínu (IP) 10 sú zvýšené u pacientov s esenciálnou hypertenziou. Hypertens Res. 2011, 34, 484–488. [CrossRef] [PubMed]
45. Rudemiller, NP; Lund, H.; Priestley, JRC; Endres, BT; Prokop, JW; Jacob, HJ; Geurts, AM; Cohen, EP; Mattson, mutácia DL SH2B3 (LNK), kandidát na celogenómovú asociačnú štúdiu pre hypertenziu, zmierňuje hypertenziu citlivú na Dahlovu soľ prostredníctvom zápalovej modulácie. Hypertens 2015, 65, 1111–1117. [CrossRef] [PubMed]
46. Wade, B.; Petrová, G.; Mattson, DL Úloha imunitných faktorov pri hypertenzii indukovanej angiotenzínom II a poškodení obličiek u potkanov citlivých na Dahlsalt. Am. J. Physiol. Regul. Celé číslo. Comp. Physiol. 2018, 314, R323 – R333. [CrossRef] [PubMed]
