Neuroprotektívne výhody cvičenia a MitoQ na funkciu pamäte, mitochondriálnu dynamiku, oxidačný stres a neurozápal u starnúcich potkanov vyvolaných D-galaktózou, časť 2

2.6. Príprava tkaniva

Po dokončení 8 týždňov TE a testov správania v pamäti boli všetky potkany usmrtené inhaláciou CO2 a mozgové tkanivá boli odobraté od 7 zvierat v každej liečenej skupine.

Test správania pamäte je účinný nástroj na hodnotenie pamäte. So zvyšujúcim sa sociálnym a pracovným tlakom sa pamäť ľudí stáva čoraz dôležitejšou. Preto nám test správania v pamäti môže pomôcť pochopiť úroveň našej pamäte a prijať účinné opatrenia na zlepšenie a udržanie pamäti podľa výsledkov testu.

Konkrétne, testy správania v pamäti dokážu vyhodnotiť schopnosť ľudí prijímať, spracovávať, ukladať a získavať informácie. Prostredníctvom testovania rôznych typov informácií, ako je jazyk, čísla, obrázky atď., je možné plne otestovať pamäť ľudí. Výsledky testov poskytnú rôzne skóre, ktoré nám pomôžu pochopiť naše slabé a silné stránky a ako posilniť našu pamäť.

V praxi mnohé testy pamäťového správania poskytujú aj odborné tipy a návrhy. Napríklad dobrý spánok, vyvážená strava, správne cvičenie a pravidelné mozgové cvičenia sú prospešné pre zlepšenie pamäti ľudí. Prostredníctvom týchto metód môžeme zvýšiť dobu uchovávania pamäte, schopnosť reprodukcie pamäte a ďalšie aspekty, aby sme sa lepšie prispôsobili potrebám každodenného života alebo práce.

Stručne povedané, test pamäťového správania je veľmi užitočný na pochopenie, vyhodnotenie a zlepšenie vlastnej pamäte. Mali by sme si tiež osvojiť vhodné metódy na posilnenie našej pamäte podľa našej aktuálnej situácie, aby sme položili pevný základ pre plnohodnotnejší a bohatší život. Je vidieť, že potrebujeme zlepšiť pamäť a Cistanche môže výrazne zlepšiť pamäť, pretože Cistanche je tradičný čínsky liečivý materiál s mnohými jedinečnými účinkami, jedným z nich je zlepšenie pamäte. Účinok Cistanche pochádza z rôznych aktívnych zložiek, ktoré obsahuje, vrátane kyseliny trieslovej, polysacharidov, flavonoidových glykozidov atď. Tieto zložky môžu podporovať zdravie mozgu rôznymi spôsobmi.

Kliknite na položku Poznať krátkodobú pamäť, ako sa zlepšiť

Po oddelení mozgovej kôry a hipokampu sa mozgové tkanivo bleskovo zmrazilo v tekutom dusíku a skladovalo pri teplote -80 ◦C až do analýzy. Zvyšných 5 zvierat sa použilo na imunohistochemickú (IHC) analýzu.

Po otvorení hrudnej dutiny 50 mM fosfátom pufrovaný fyziologický roztok (PBS) prechádzal ľavou komorou počas 10 minút a potom sa zviera perfundovalo 4 % paraformaldehydom (PFA) v 100 mM PBS.

Po perfúznej fixácii bol mozog odobratý, umiestnený do 4% PFA a fixovaný na 4 hodiny pri 4 °C. Fixované mozgové tkanivo bolo ponorené do 30% roztoku sacharózy na 2 dni a potom narezané na 40 µm hrubé plátky pomocou kryostatu ( Leica Microsystems, Nussloch, Nemecko).

2.7. Izolácia mitochondrií

Na izoláciu mitochondrií sme použili súpravu na extrakciu mitochondrií (IMGENEX Corporation, San Diego, CA, USA) podľa pokynov výrobcu. Na každých 100 mg hipokampálneho tkaniva sa pridal 1 ml homogenizačného pufra.

Po homogenizácii sa tkanivo centrifugovalo pri 900 x g počas 10 minút pri 4 °C a supernatant sa zhromaždil a znova centrifugoval pri 15,000 x g počas 30 minút pri 4 °C.

Odstredením cytozolickej frakcie sa cytosól oddelil a zvyšná peleta sa dôkladne premiešala v 1 ml suspenzného pufra pred centrifugáciou pri 15,000 x g počas 10 minút pri 4 °C.

Supernatant sa odstránil a pridal sa ďalší 1 ml suspenzného pufra pred dôkladným premiešaním a opätovným centrifugovaním pri 15,000 x g počas 10 minút pri 4 °C.

Supernatant sa odstránil a zvyšná peleta sa rozpustila v 1 ml pufra na kompletnú mitochondriálnu lýzu počas 30 minút pri 4 °C. Mitochondriálny extrakt sa potom centrifugoval pri 15, 000 x g počas 5 minút pri 4 °C a odobral sa supernatant (mitochondriálna frakcia).

2.8. Western blotting
Celkový proteín získaný izoláciou mitochondrií bol kvantifikovaný pomocou Bradfordovej metódy. Rovnaké množstvo mitochondriálnych proteínov (30 ug na dráhu) sa nanieslo na elektroforézu na dodecylsulfát-polyakrylamidovom géli (SDS-PAGE) (8 % alebo 12 %).

Po elektroforéze sa proteíny preniesli na polyvinylidénfluoridovú (PVDF)membránu (Millipore, Boston, MA, USA).

Blokovanie sa uskutočňovalo 1 hodinu pri teplote miestnosti s použitím 1 x Tris-pufrovaného fyziologického roztoku obsahujúceho Tween-20 (TBS-T) roztok s 5 % BSA a potom sa membrána nechala reagovať s primárnymi protilátkami cez noc pri 4 °C.

Boli použité tieto primárne protilátky: Mfn1, Mfn2, Opa1, Drp1, Fis1, p22 phox, p47 phox, gp91phox, SOD-2, kataláza a -aktín (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, riedenie:1 :1000); a TNF- (Abcam, Cambridge, UK, riedenie: 1:1000).

Membrány sa potom premyli premývacím tlmivým roztokom (PBS s 0,1 % Tween 20), potom sa inkubovali s kozou anti-králičou sekundárnou protilátkou proti králičím protilátkam pre p22 phox, gp91 phox a TNF konjugovanou s chrenovou peroxidázou (HRP). - (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA, riedenie: 1:5000).

Kozie anti-myšie sekundárne protilátky konjugované s HRP sa použili pre Mfn1, Mfn2, Opa1, Drpl, Fis1, p47 phox, SOD-2, katalázu a -aktín (Santa Cruz Biotechnology, riedenie: 1:5000).

Hladiny expresie proteínov sa detegovali pomocou detekčného systému ECL Western blotting (Santa Cruz Biotechnology). Hustoty vyvinutých proteínových pásov boli analyzované pomocou ChemiDoc XRS gélového zobrazovacieho systému (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

2.9. Imunohistochémia (IHC)
Na analýzu IHC sa použila metóda voľného pohybu pre vybrané tkanivo v každej liečebnej skupine. Po premytí tkaniva 3x po 10 min, každé v 0,01 M PBS, sa tkanivo inkubovalo pri 80 ◦C počas 60 min v kadičke obsahujúcej 0,01 M citrát sodný, nasledovalo blokovanie v 10 % normálne oslie sérum (Millipore Sigma, Burlington, MA, USA).

Vzorka tkaniva sa potom nechala reagovať s primárnymi protilátkami anti-p22 phox (Santa Cruz Biotechnology, riedenie: 1:50}0) a anti-Gliálnym fibrilárnym kyslým proteínom (GFAP) (Abcam, riedenie:1:500) počas 12 h pri 4 ◦C. Nasledujúci deň sa tkanivo premylo 3x počas 5 minút v 0,01 M PBS a potom reagovalo s HRP-konjugovanou kozou anti-myšou sekundárnou protilátkou (Santa Cruz Biotechnology, riedenie: 1:5000) pri teplote miestnosti počas 2 hodín.

Nakoniec sa tkanivo inkubovalo pri teplote miestnosti s použitím roztoku Vectastain-Elite ABC kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) a výsledky sa vizualizovali pomocou súpravy DABperoxidase Substrate Kit (Vector Laboratories).

Každý plátok tkaniva bol pripevnený na sklíčko pomocou montážneho média (Vector Laboratories) a kontrolovaný pomocou svetelného mikroskopu (Leica Microsystems).

2.10. Štatistické analýzy

Údaje boli analyzované pomocou SPSS pre Windows verzie 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Všetky hodnoty sú vyjadrené ako priemer ± SEM. Štatistická významnosť bola stanovená pomocou jednosmernej ANOVA. Bonferroniho post hoc testy sa použili na viacnásobné porovnania. Rozdiely sa považovali za štatisticky významné pri p < 0,05.

3. Výsledky

3.1. Účinky cvičenia na bežiacom páse a MitoQ na expresiu proteínov súvisiacich s mitochondriálnou dynamikou v hippocampe starnúcich potkanov indukovaných D-Gal

Overili sme, že TE a MitoQ ovplyvnili faktory súvisiace s mitochondriálnou fúziou (Mfn1, Mfn2, Opa1) a faktory súvisiace so štiepením (Drp1, Fis1) v hipokampe starnúcich potkanov (obrázok 1).

Úrovne expresie faktorov súvisiacich s mitochondriálnou fúziou sa medzi liečebnými skupinami významne líšili (Mfn1, F4,34=134,750, p < 0,001; Mfn2, F4,34=80). 816, p < 0,001; Opa1, F4, 34=51,456, p=0,001).

Úrovne expresie faktorov súvisiacich s mitochondriálnym štiepením sa tiež medzi liečebnými skupinami významne líšili (Drp1, F4,34=53.448, p < 0.001; Fis1,F4,34=116 0,313, p < 0,001). Výsledky post hoc testu sú znázornené na obrázku 1.

V porovnaní so skupinou Y-CON sa expresia faktorov súvisiacich s mitochondriálnou fúziou znížila v skupine D-CON a vykazovala rastúce trendy v skupinách D-TE, D-MI a D-COMBI.

Na druhej strane, expresia faktora Drp1 súvisiaceho s mitochondriálnym štiepením sa zvýšila v skupine D-CON v porovnaní so skupinou Y-CON. Zatiaľ čo signály mitochondriálneho štiepenia boli znížené kombinovanou liečbou s TE, samotná liečba MitoQ nevyvolala významnú zmenu.

Ďalší faktor súvisiaci s mitochondriálnym štiepením, Fis1, vykazoval rovnaké klesajúce trendy ako Drp1, ale bol tiež znížený samotnou liečbou MitoQ.

Obrázok 1. Účinok cvičenia na bežiacom páse a mitochinónu (MitoQ) na expresiu proteínov súvisiacich s mitochondriálnou dynamikou v hipokampe starnúcich potkanov indukovaných D-galaktózou (D-gal). (A) Reprezentatívne Western bloty mitochondriálnej fúzie a proteínov súvisiacich so štiepením. (B–F) Denzitometrická analýza pásov Western blot normalizovaných na -aktín. Údaje uvedené vo Western blote sú priemery zo siedmich mozgov potkanov.

-Aktín bol testovaný ako vnútorná kontrola. Bonferroniho post hoc test bol použitý po ANOVA. Hodnoty sú priemery ± SEM.

a Označuje štatistický rozdiel od skupiny mladých kontrolných skupín (Y-CON). b Označuje štatistický rozdiel od skupiny D-galaktózovej skupiny (D-CON). c Označuje štatistický rozdiel od skupiny D-galaktóza plus cvičenie na bežeckom páse (D-TE).

d Označuje štatistický rozdiel od skupiny D-galaktóza plus MitoQ (D-MI) (p < 0,05). D-COMBI; D-galaktóza plus skupina TE a MitoQ.

3.2. Účinky cvičenia na bežiacom páse a MitoQ na expresiu podjednotiek NADPH oxidázy v mozgovej kôre a hipokampe starnúcich potkanov vyvolaných D-Gal

Pozorovali sme významné rozdiely medzi liečebnými skupinami v imunoreaktivite p22 phox v mozgovej kôre a hipokampe starnúcich potkanov (obrázok 2) (CA3, F4, 24=18.786, p < 0).{11 }}01, F4, 24=12 0,662, p < 0,001).

V kortexe skupiny D-CON vykazovali zvýšenú imunoreaktivitu p22 phox v porovnaní so skupinou Y-CON, ktorá sa významne znížila v skupinách D-TE, D-MI a D-COMBI.

V CA3 bola zvýšená imunoreaktivita p22 phox znížená v skupinách D-TE a D-COMBI v porovnaní s D-CON. Hladiny proteínovej expresie podjednotiek NOX p22 phox, gp91 phox a p47phox sa medzi skupinami výrazne líšili (p22 phox, F4, {{10}}}.513, p < 0.{{24} }01 phox, F4, 34=57 0,282, p < 0,001;

Výsledky post hoctestu ukázali významný nárast hladín podjednotiek NOX v D-CON v porovnaní s Y-CON. Hladiny podjednotiek NOX však boli nižšie vo všetkých intervenčných skupinách v porovnaní so skupinou D-CON.

Najmä expresia p22 phox a gq91 phox bola významne znížená v D-TE v porovnaní so skupinou D-MI. Tieto zistenia naznačujú, že cvičenie a MitoQ jednotlivo zabraňujú oxidačnému stresu v mozgu vyvolanému starnutím, ale ich kombinácia nevedie k žiadnym ďalším účinkom.

Obrázok 2. Účinky cvičenia na bežeckom páse a MitoQ na expresiu podjednotiek NADPH oxidázy v mozgovej kôre a hipokampe starnúcich potkanov vyvolaných D-gal. (A1) Mikrofotografie ukazujúce imunoreaktivitu NAPDH p22 phox v mozgovej kôre a hipokampe starnúcich potkanov indukovaných D-gal v každej skupine. Čierne obdĺžniky v A1 označujú časť obrázkov, ako je znázornené na f–i ap–t. (A2, A3) Kvantifikácia optickej hustoty farbenia NADPH p22 phox v mozgovej kôre a hipokampe.

Bonferroni post hoc test po ANOVA. Hodnoty sú uvedené ako priemer ± SEM. (n=5 zvierat). (a–e a k–o) Mierka=100 µm, (f–j a p–t) Mierka=50 µm. (B) Reprezentatívne obrazy Western blot pre podjednotky NADPH oxidázy v hipokampe.

(C – E) Kvantifikácia podjednotiek NADPH oxidázy v hipokampe. Údaje uvedené vo Western blote boli priemery zo siedmich mozgov potkanov. -Aktín bol testovaný ako vnútorná kontrola. Bonferroniho post hoc test sa použil po ANOVA. Hodnoty sú priemery ± SEM.

a Označuje štatistický rozdiel od skupiny Y-CON. b Označuje štatistický rozdiel od skupiny D-CON. c Označuje štatistický rozdiel od skupiny D-TE. (p < 0.05).

3.3. Účinok cvičenia na bežiacom páse a MitoQ na expresiu GFAP v mozgovej kôre a hippocampal Dentate Gyrus u starnúcich potkanov vyvolaných D-Gal

Pozorovali sme signifikantné rozdiely medzi liečebnými skupinami v imunoreaktivite GFAP v mozgovej kôre a hippocampal dentate gyrus (DG) starnúcich potkanov (obrázok 3) (Cortex, F4, 24=13.524, p < 0.001 ; DG, F4,24=30.364).

Výsledky post hoc testu ukázali, že liečba D-gal významne zvýšila imunoreaktivitu GFAP v kortexe aj DG.

V porovnaní so skupinou D-CON boli hladiny GFAP v kortexe znížené vo všetkých intervenčných skupinách a hladiny GFAP v DG boli znížené v skupinách D-TE a D-COMBI, zatiaľ čo skupina D-MI vykazovala rozdiely iba v imunoreaktivite GFAP v oblasti kôry.

Aj keď liečba TE alebo MitoQ znížila neurozápal v kôre vyvolaný D-gal, pozitívne účinky v DG vyvolala iba intervencia TE.

For more information:1950477648nn@gmail.com