Časť 1: Antifibrotický účinok 6-bróm-indirubínu-3 ′-oxímu (6-BIO) prostredníctvom regulácie aktivačného proteínu-1 (AP-1) a špecifickosť proteínu-1 (SP-1) transkripčné faktory v obličkových bunkách

Antifibrotický účinok 6-bróm-indirubínu-3 ′-oxímu (6-BIO) prostredníctvom regulácie aktivačného proteínu-1 (AP-1) a špecifického proteínu -1 (SP-1) transkripčné faktory v obličkových bunkách

Ďalšie informácie:{0}}

Kľúčové slová:obličky, fibróza,SMAD,Antifibrotické

ABSTRAKT

PAI-1 a CTGF sú nadmerne exprimované vobličkychorobya spôsobiťfibrózapľúc, pečene aobličky. Použili sme potkaní model jednostrannej ureterálnej obštrukcie (UUO), aby sme zistili, či6-BIO, inhibítor glykogénsyntázy kinázy-3, oslabenýfibrózain vivo inhibíciou PAI-1 a CTGF. Navyše TGF-indukované bunkovéfibrózabol pozorovaný in vitro s použitím človekaobličkyproximálne tubulárne epitelové bunky (HK{0}}) a intersticiálne fibroblasty potkanov (NRK49F). Vyjadreniefibrózapríbuzné proteíny a signálne molekuly ako PAI-1, CTGF, TGF, SMA,SMADa MAPK boli stanovené v bunkách HK-2 a NRK49F pomocou imunoblotingu. Na identifikáciu transkripčných faktorov, ktoré regulujú expresiu PAI-1 a CTGF, sa pomocou luciferázových testov analyzovali promótorové aktivity AP-1 a SP-1. Na pozorovanie spoločnej lokalizácie AP-1 a SP-1 na PAI-1 a CTGF sa použila konfokálna mikroskopia. Expresia PAI-1, CTGF, TGF a -SMA sa zvýšila v modeli UUO, ako aj v bunkách HK-2 a NRK49F ošetrených TGF. Okrem toho liečba UUO a TGF indukovala aktiváciu P-SMAD2/3, SMAD4, P-ERK 1/2, P-P38 a P-JNK MAPK signálne dráhy. Aktivita promótora PAI-1, CTGF, AP-1 a SP-1 sa zvýšila v reakcii na liečbu TGF. Avšak liečba s6-BIOznížila expresiu proteínov a signálnych dráh spojených sfibrózav modeli UUO, ako aj v bunkách HK-2 a NRK49F ošetrených TGF. Okrem toho 6-BIO liečba zoslabila expresiu PAI-1 a CTGF, ako aj promótorské aktivity AP-1 a SP-1, čím regulovalaSMADa MAPK signálne dráhy a následne namáhanieantifibrotickéúčinky naobličkybunky.

Kliknite na Cistanche herba na ochorenie obličiek

1. Úvod

Obličkyfibróza je spôsobená rôznymi faktormi, vrátane cukrovky, vysokého krvného tlaku, glomerulonefritídy a vekom podmienenej chronickejobličkyochorenie [1–3]. Glomeruli skleróza a tubulointersticiálnafibrózasú konečné patologické znakyobličkyochorenia [4,5]. Nadmerná produkcia a ukladanie proteínov extracelulárnej matrice (ECM) spôsobuje štrukturálne a funkčné poškodenieobličky, čo vedie k postupnej strate jeho funkcie, ktorá vyvrcholí v konečnej fázeobličkychoroba [5]. Theobličkymajú zložitú štruktúru, ktorá je rozdelená na glomeruly, tubulointersticiálne a vaskulatúrne; každý kompartment má iný typ extracelulárnej matrice a môže byť ovplyvnenýfibróza[6,7]. ECM intersticiálnych tubulárnych buniek obsahuje rôzne zložky vrátane kolagénu, glykozaminoglykánu, elastínu, laminínu a glykoproteínov. Aktivované proximálne tubulárne bunky môžu aktivovať tubulointersticiálnu [6–10]. Glykogén syntáza kináza (GSK3) podporujeobličkyfibrózaaktiváciou signalizácie TGF v proximálnych tubulárnych a tubulointersticiálnych bunkách [11]. V tejto štúdii sme sa zamerali na určenie účinkov inhibítora GSK3,6-BIOna proximálne tubulárne a intersticiálne fibroblastové bunky zacielením na inhibítor aktivátora plazminogénu-1 (PAI{1}}) a rastový faktor spojivového tkaniva (CTGF), ktoré zohrávajú kľúčovú úlohu v progresívnomobličkypoškodenie a tubulointersticiálnefibróza.

6-BIOje bunkovo ​​priepustný derivát analógu indirubínu, 6-bro-indirubínu, ktorý je izolovaný z morských mäkkýšov a má vysokú špecifickosť a selektivitu pre GSK-3 [12,13].6-BIOje kompetitívny inhibítor ATP a vykazuje podobnosť s ATP väzbovou doménou cyklín-dependentnej proteínkinázy (CDK), ktorá reguluje protinádorovú aktivitu [14–16]. Abnormálna aktivita GSK3 je spojená s niekoľkými ľudskými ochoreniami, vrátane cukrovky, zápalu, neurodegeneratívnych ochorení a psychóz [17,18]. V predchádzajúcich štúdiách sa preukázalo, že inhibítory GSK3 môžu opraviť poškodené tubuly a znížiť zápalové reakcie, epitelovo-mezenchymálny prechod (EMT) spojený so signalizáciou TGF 1 a akumuláciu fibronektínu v kultivovaných glomerulárnych intermediárnych bunkách [11,19–21]. Navyše,6-BIOmôže mať potenciálne terapeutické účinky pri niekoľkých ochoreniach vrátane cukrovky, neurodegeneratívnych porúch a rakoviny reguláciou zápalu, oxidačného stresu, prežívania buniek, ako aj proliferácie a bunkovej smrti [22–24]. Avšak potenciálne terapeutické účinky6-BIOnaobličkyfibrózaspojené s proximálnym tubulárnym a tubulárnym intersticiálnym poškodením sú stále neznáme.

PAI-1, multifunkčný glykoproteín vobličky, je inhibítor serínovej proteázy, ktorý inhibuje aktivátor plazminogénu urokinázy (uPA) a aktivátor tkanivového plazminogénu (tPA), ktorý štiepi plazminogén na plazmín [25,26]. Nadmerná expresia PAI-1 inhibuje fibrinolýzu a degradáciu ECM, čím zvyšuje akumuláciu ECM [27]. Okrem toho PAI-1 upreguluje MAPK (mitogénom aktivované proteínkinázy),SMADa RhoA/ROCK (Rho-asociovaná proteínkináza) signálne dráhy pri cukrovke a chronickejobličkyochorenie [28–30]. Transkripčné faktory, ako napríklad AP-1, SP-1,SMAD3/4, USF2 (upstream transkripčný faktor 2) a CTF/NF (rodina miestne špecifickej väzby DNA

proteíny), sú tiež aktivované MAPK aSMADsignalizácia [30,31]. Kombinovaná aktivácia týchto signálnych dráh a transkripčných faktorov zvyšuje expresiu PAI-1 a vedie k akumulácii ECM. CTGF je proteín viažuci heparín súvisiaci s ECM a zahŕňa domény, ako je proteín viažuci rastový faktor podobný inzulínu (IGFBP), von Willebrandove opakovania typu C (VWC), opakovanie trombospondínu typu 1 (TSR) a C-koniec doména (CT) s motívom cysteínového uzla. Z týchto štyroch domén CT doména interaguje so superrodinou TGF, fibronektínom a perlekánom [32–34]. V dôsledku toho CTGF zvyšuje MAPK,SMAD, PI3K a YAP signalizácia indukciou TGF a tieto signálne dráhy aktivujú transkripčné faktory, ako sú AP-1, SP-1, NF-kB aSMAD2/3. Upregulácia CTGF teda indukuje migráciu, proliferáciu a zápal buniek, čím spôsobuje akumuláciu ECM [35–37].

Na základe týchto výsledkov predchádzajúcich štúdií sme špekulovali, že MAPK aSMADsignalizácia, ako aj AP-1 a SP-1 transkripčné faktory, možno spoločné spojenie medzi PAI-1 a CTGF-indukovanou akumuláciou ECM v progresívnomobličkychoroba a tubulointersticiálnafibróza. Preto sme skúmali, či6-BIOmôže zabrániť chronickému progresívnemuobličkyreguláciou PAI-1 a CTGF.

2. Materiál a metódy

2.1. Protilátky a činidlá

Primárne použité protilátky boli anti-králičie protilátky proti PAI-1 (11907), TGF (3711), fosforylovanéSMAD2/3 (8828), SMAD4 (38454), fosforylovaný ERK (P-ERK) (9101), fosforylovaný P38 (P-P38) (4631), fosforylovaný JNK (P-JNK) (9251), fosforylovaný C-JUN (PC-JUN) (3270) fosforylovaný C-FOS (PC-FOS) (5348) a histón H3 (9715), pričom všetky boli získané od Cell Signaling Technology. CTGF (sc-365970), SP-1 (sc-17824),SMAD6 (sc{1}}) boli získané od Santa Cruz Biotechnology. Myšie -aktínové protilátky (a5316) a (2'Z,3'E)-6-bróm indirubín-3-oxím (6-BIO) (B1686) boli získané od Sigma-Aldrich.

2.2. Pokusy na zvieratách

Všetky pokusy na zvieratách sa uskutočňovali podľa príslušných smerníc a nariadení. Experimentálny protokol bol schválený Výborom pre predpisy o starostlivosti o zvieratá (ACR) Lekárskej fakulty národnej univerzity v Chonname (CNUH IACUC-18010, 19. apríla 2019). Experimenty sa uskutočnili na samcoch potkanov Sprague-Dawley (180–200 g, Samtako, Kórea) [38]. Potkany sa udržiavali pri kontrolovanej teplote (21 ± 2 ◦ C) v 12-hodinovom cykle svetlo-tma. Potkany boli rozdelené do troch skupín: kontrola (n=6), jednostranná ureterálna obštrukcia (UUO, n=6) a UUO s6-BIOliečba (n=6).6-BIO({{0}},2 mg/kg/deň) sa podával intraperitoneálne (ip) počas 6 dní. Aby sa vyvinul model obštrukčnej nefropatie u potkanov, operácia sa uskutočnila nasledovne: UUO sa vyvolalo podviazaním ľavého močovodu počas siedmich dní. Otvorila sa brušná dutina a do ľavého proximálneho močovodu sa umiestnila 2–0 hodvábna ligatúra. Kontrolná skupina dostávala rovnakú liečbu počas siedmich dní, s výnimkou ligatúry. Potkany mali voľný prístup k štandardnému krmivu pre potkany a vode z vodovodu a boli usmrtené v deň 7 po operácii. Theobličkyboli rýchlo odstránené a spracované na imunohistochémiu a western blotting.

2.3. Histológia

Obličkytkanivá boli fixované 4 percentami paraformaldehydu, zaliate do parafínu a narezané na 5 um hrubé rezy. Na vyhodnotenie histologickej morfológie sa uskutočnili postupy farbenia hematoxylínom a eozínom (H&E), kyselinou jodistou-Schiff (PAS), Siriusovou červeňou a Massonovým trichrómom (MT). Farbenie H&E, PAS, Sirius red sa uskutočnilo podľa pokynov výrobcu. Na farbenie MT po deparafinizácii xylénom boli rezy ošetrené Bouinovým roztokom pri 56 °C počas 30 minút a premývané pod tečúcou vodou z vodovodu, kým rezy neboli číre. Rezy boli následne zafarbené Weigertovým hematoxylínom (A: B=1:1), nasledovalo farbenie roztokom Biebrich Scarlet/Acid Fuchsin počas 10 minút a premytie destilovanou vodou. Rezy boli inkubované s roztokom kyseliny fosfowolfrámovej/kyseliny fosfomolybdénovej počas 10 minút a ošetrené roztokom anilínovej modrej počas 15 minút. Rezy boli následne inkubované s kyselinou octovou počas 1 minúty a dehydratované etanolom a xylénom. Kolagénové depozície, jadrá a svalové vlákna boli zafarbené modrou, čiernou a červenou farbou. Kvantitatívna analýza zafarbeného rezu sa uskutočnila pomocou softvéru ImageJ.

2.4. Western blot analýza

Bunky sa zozbierali, dvakrát sa premyli ľadovo studeným fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (PBS), resuspendovali sa v lyzovacom pufri a krátko sonikovali. Proteínový extrakčný pufor pozostával z 50 mM Tris-HCl (pH 7,2), 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 % Nonidet P-40, 0,1 % SDS, koktail inhibítora proteázy (GenDEPOT, P3100– 001) a koktail inhibítorov fosfatázy

(GenDEPOT, P3200–001). Po odstredení sa supernatanty obsahujúce proteínové extrakty zhromaždili a koncentrácie proteínov sa merali pomocou súpravy Pierce® BCA Protein Assay Kit (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA). Proteíny sa oddelili na 12-percentnom dodecylsulfátovo-polyakrylamidovom géle a preniesli sa na nitrocelulózové membrány. Bloty sa blokovali pri teplote miestnosti počas 1 hodiny s 5 percentami odstredeného mlieka v PBS s obsahom 0,1 percenta Tween{8}} (PBST). Blot sa potom inkuboval cez noc s primárnou protilátkou (1;2000) pri 4 °C, nasledovala inkubácia so sekundárnou protilátkou (1:2500) a nakoniec s protilátkami proti králičej chrenovej peroxidáze konjugovanej skôr [39 ]. Špecifické proteínové pásy boli vizualizované pomocou vylepšeného chemiluminiscenčného systému. Kvantitatívna analýza

intenzita pásma bola vykonaná pomocou softvéru ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

2.5. knockdown siRNA

Na odstránenie SP-1 sa transfekovali SP-1 siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Inc., sc-29487) a kontrolná siRNA (Santa Cruz, sc{4}}) počas 24 hodín do buniek HK-2 a NRK49F pri 60-percentnej konfluencii s použitím transfekčného činidla Dhar-maFECT 1 (Dharmacon, T-2001-02) v konečnej koncentrácii 30 nM. Bunky boli inkubované v médiu bez séra jeden deň v 37^◦ C inkubátor pod zvlhčenou atmosférou 5 percent CO2, vopred ošetrený 6-BIO počas 1 hodiny a stimulovaný TGF- počas 24 hodín. Účinnosť knockdownu bola stanovená analýzou Western blot.

2.6. Prechodná transfekcia plazmidu a reportérového konštruktu

Bunky rástli až do 60–70 percent konfluencie, premyli sa médiom DMEM-F-12 (bunky HK-2) alebo DMEM (bunky NRK49F) a potom sa inkubovali 24 hodín v príslušnom médiu bez séra a antibiotík . Bunky sa potom transfekovali dominantne negatívnym konštruktom C-JUN, ako aj reportérom PAI-1, CTGF, AP-1 a SP{11}} nesúcim vektor pGL3 pomocou činidla FuGene HD. Koncentrácia reportérového plazmidu použitého pri prechodnej transfekcii bola 2 μg (1 μg/μl). Bunky transfekované reportérom boli vopred ošetrené 6-BIO počas 1 hodiny a inkubované s 10 ng/ml TGF počas 16 hodín.

2.7. Test promotorového reportéra

Reportérové ​​konštrukty PAI{0}} a CTGF vyrobila spoločnosť BIO FACT (Yuseong-gu, Daejeon, Kórejská republika). Reportérske konštrukty pGL3-AP-1 a pGL3-SP-1 láskavo poskytol profesor Young Do Jung (Chonnam National University). Transkripčná regulácia PAI-1, CTGF, AP-1 a SP-1 bola skúmaná prechodnou transfekciou ich príslušných pGL3 promótor-luciferázových reportérových konštruktov. Bunky HK-2 a NRK49F (5 × 10 5) boli nasadené a pestované, kým sa nedosiahlo 60–70 percent konfluencie. Potom sa promótorové konštrukty a pGL3-prázdne vektory transfekovali do buniek pomocou FuGene HD podľa protokolu výrobcu. Plazmid pRL-null kódujúci luciferázu Renilla bol zahrnutý do všetkých vzoriek na monitorovanie účinnosti transfekcie. 24 hodín po transfekcii sa merali hladiny luciferázovej aktivity svetlušiek a Renilla postupne z jednej vzorky pomocou testovacieho systému Dual-Glo Luciferase (Promega). Aktivita luciferázy svetlušiek bola normalizovaná na aktivitu Renilla a relatívne množstvo luciferázovej aktivity v neošetrených bunkách.

2.8. Konfokálna laserová mikroskopia

Potkanobličkyvzorky boli fixované v 4 percentnom paraformaldehyde, zaliate do parafínu a narezané na rezy s hrúbkou 3- μm.Obličkyrezy boli zbavené parafínu a rehydratované, blokované, premyté PBS a inkubované s anti-PAI-1, anti-CTGF, anti-PC-JUN, anti-PC-FOS, anti-SP{10}} a anti-AQP1 protilátky zriedené v blokovacom pufri počas 24 hodín pri at

4 ^◦C. Po premytí boli rezy inkubované s Alexa Fluor 488 (zelená fluorescencia) kozím anti-králičím (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), Cy3 (červená fluorescencia) kozím anti-myším alebo kozím anti-králičím (Invitrogen , Oregon) protilátky počas 2 hodín. Bunky HK-2 a NRK49F (3 ×10 5 ) sa naočkovali do {{10}}jamkových komôr a inkubovali sa 24 hodín pri 37 ◦ C. Bunky sa vopred ošetrili 5 μM 6-BIO na 1 hodinu a potom vystavené 10 ng/ml TGF na 16 hodín. Po premytí 1X PBS boli bunky fixované 4 percentami paraformaldehydu pri teplote miestnosti počas 15 minút a blokované počas 2 hodín pri teplote miestnosti pomocou 1X PBS obsahujúceho 1 percento BSA a 0,2 percenta Triton X-100. Bunky sa potom inkubovali s králičími alebo myšacími monoklonálnymi protilátkami proti PAI-1, CTGF, PC-JUN, PC-FOS a SP-1 (zriedené 1:200 v blokovacom pufri) pri 4 stupňoch počas 24 h. Po premytí boli bunky inkubované s príslušnými sekundárnymi protilátkami (Cy3 kozie anti-králičie a anti-myšie protilátky, Alexa Fluor 488 kozie anti-králičie a anti-myšie protilátky, zriedené 1:200) počas 2 hodín pri teplote miestnosti. Po umytí boli krycie sklíčka pripevnené na mikrosklíčka s použitím ProLong Gold Antifade Reagent s DAPI (Life Technologies Corporation). Obrázky sa analyzovali pod konfokálnym laserovým skenovacím mikroskopom Leica TCS SP8 (Leica Microsystems, Mannheim, Nemecko).

2.9. Štatistická analýza

Výsledky boli vyjadrené ako priemer ± SEM. Viacnásobné porovnania medzi skupinami sa uskutočnili jednosmerným testom ANOVA a Tukeyho post hoc testom úprimne významný rozdiel (HSD). Výsledky s p < 0,05="" sa="" považovali="" za="" štatisticky="">

3. Výsledky

3.1. 6-BIO zmierňuje morfologické zmeny a expresiu markerov spojených s fibrózou v modeli potkanov UUO

Hodnotili sme účinky 6-BIO nafibrózavobličkymodelu potkana UUO. Ako je znázornené na obr. 1A, model UUO sa výrazne zvýšilobličkytubulointersticiálne poškodenie, glomerulárna skleróza, intersticiálna infiltrácia mononukleárnych buniek, ukladanie intersticiálneho kolagénu afibrózav porovnaní s kontrolami, ako bolo určené farbením H&E, PAS, Sirius Red a MT. Okrem toho proteíny súvisiace s EMT, ktoré indukujúobličkyfibrózaako aj kolagén I a -IV, ktoré zvyšujú akumuláciu ECM, boli zvýšené v UUO v porovnaní s kontrolami (obr. S1A a C). Tieto zmeny však boli zmiernené 6-BIO liečbou. Obr. 1B ukazuje, že po 7 dňoch obštrukcie sa expresia proteínov PAI-1, CTGF, -SMA a TGF zvýšila v obličkách modelových potkanov UUO v porovnaní s expresiou u kontrol a toto zvýšenie bolo oslabené ošetrenie pomocou 6-BIO. Vyjadreniefibrotickýmarkery sa výrazne zvýšili v UUO v porovnaní s kontrolami, proti čomu pôsobila6-BIOošetrenia (obr. 1C). Imunofluorescenčné farbenie (obr. 1D) odhalilo, že expresia PAI-1 a CTGF (červená fluorescencia) sa zvýšila v obštrukciáchobličkyv deň-7 v porovnaní s kontrolami. Avšak expresia PAI-1 a CTGF sa po 6-BIO liečbe znížila (obr. 1D). Súhrnne tieto zistenia naznačujú, že 6-BIO zmierňuje tubulointersticiálne poškodenie inhibíciou expresie PAI-1 a CTGF.

3.2. 6-BIO tlmí expresiu PC-JUN, PC-FOS, SP-1 a inhibuje signálne dráhy spojené s fibrózou v modeli potkanov UUO

Ďalej sme zisťovali, či6-BIOovplyvňuje signálne dráhy súvisiace sobličkyfibróza. Najprv sme to potvrdili6-BIO, ktorý je známym inhibítorom GSK3, inhibuje fosforyláciu GSK3. Obr. S1A a B znázorňujú zníženie GSK3 pomocou 6-BIO. Obr. 2A znázorňuje TGF/SMADsignálna dráha. Analýza Western blot ukázala, že expresia fosforylovanýchSMAD2/3 aSMAD4 proteíny zvýšené v UUOobličky, ktorý bol oslabený 6-BIO úpravou (obr. 2A). všakSMAD6, ktorý inhibuje fosforyláciu SMAD 2 a aktivituSMAD4 [40], mali opačné výsledky. Okrem toho hrá kľúčovú úlohu signalizácia MAPKobličkyfibróza [41,42]. Vykonali sme analýzu Western blot, aby sme zistili, či 6-BIO ovplyvňuje signalizáciu MAPK. Hladiny fosforylovanej ERK, JNK a P38 sa zvýšili v UUOobličkyv porovnaní s kontrolnýmiobličky(obr. 2B). Expresia fosforylovaných ERK a JNK bola významne znížená 6-BIO ošetrením, zatiaľ čo pokles hladiny fosforylovaného p38 bol zanedbateľný (obr. 2B).SMADa MAPK signálne dráhy boli upregulované v skupine UUO, čo bolo zvrátené6-BIOošetrenie (obr. 2C). Zúčastňuje sa na ňom veľa transkripčných faktorovobličkyfibrózaa hrajú kľúčovú úlohu pri regulácii expresie downstream génu. Obr. 2D ukazuje, že po 7 dňoch obštrukcie sa expresia PC-JUN, PC-FOS a SP-1 proteínov zvýšila vobličkypotkanov s UUO v porovnaní s kontrolnými zvieratami a tento nárast bol oslabený 6-BIO liečbou. Podobne aj expresia AP-1 a SP-1, dôležitých transkripčných faktorov regulujúcichobličkygénov súvisiacich s fibrózou, bol výrazne zvýšený vobličkypotkanov s UUO, ale bol oslabený po liečbe 6-BIO (obr. 2E). Obr. 2F ukazuje imunofluorescenčné farbenie PC-JUN, PC-FOS. a SP-1. Červená fluorescencia farbenia PC-JUN, PC-FOS a SP{12}} bola významne zvýšená v obštrukciáchobličkyv porovnaní s kontrolami a bola znížená 6-BIO liečbou. Tieto výsledky potvrdzujú, že AP-1 a SP-1 sú dôležité transkripčné faktoryobličkyfibróza a6-BIOsa môže znížiťobličkyfibrózy oslabením ich transkripčnej aktivity.

Pre časť 2 kliknitetu.