Časť 1: Protizápalové, antioxidačné, zvlhčujúce a antimelanogenézne účinky kvercetínu 3-O- -D-glukuronidu v ľudských keratinocytoch a bunkách melanómu prostredníctvom aktivácie dráh NF-κB a AP-1
Mar 21, 2022
Pre viac informácií kontaktujtetina.xiang@wecistanche.com
Abstraktné: kvercetínUvádza sa, že 3-O- -D-glukuronid (Q-3-G), glukuronidový konjugát kvercetínuprotizápalovévlastnosti v makrofágoch stimulovaných lipopolysacharidmi, ako aj protirakovinové a antioxidačné vlastnosti. Na rozdiel od kvercetínu, o ktorom bolo rozsiahle opísané, že má širokú škálu farmakologických aktivít vrátane ochranných účinkov na kožu, farmakologické prínosy a mechanizmy Q-3-G v koži ešte neboli objasnené. Táto štúdia sa zamerala na charakterizáciu ochranných vlastností pokožky, vrátane protizápalových a antioxidačných vlastností, Q-3-proti oxidačnému stresu vyvolanému UVB alebo H2O2-, hydratačným účinkom aantimelanogenézaaktivity pomocou ľudských keratinocytov (HaCaT) a melanómových (B16F10) buniek. Q-3-G down-reguloval expresiu prozápalového génu a cytokínu, ako je cyklooxygenáza-2 (COX-2) a tumor nekrotizujúci faktor (TNF)- v H20 alebo UVB- ožiarené HaCaT bunky. Tiež sme ukázali, že O-3-Gexhibity majú antioxidačný účinok pomocou testov na zachytávanie voľných radikálov, prietokovej cytometrie a zvýšenej expresie nukleárneho faktora erytroidného 2- súvisiaceho faktora 2 (Nrf2). Q-3-G znížil produkciu melanínu v bunkách B16F10 indukovaných hormónom stimulujúcim melanocyty (-MSH). Hydratačné účinky a mechanizmy Q-3-G sa skúmali vyhodnotením génov súvisiacich so zvlhčujúcim faktorom, ako je transglutamináza-1(TGM-1), filagrín (FLG) a syntáza kyseliny hyalurónovej (MÁ)-1. Okrem toho Q-3-G zvýšil fosforyláciu c-Jun, Jun N-terminálnej kinázy (JNK), mitogénom aktivovanej proteínkinázy (MAPK) kinázy 4 (MKK4) a TAK1, ktoré sa podieľajú na MAPK/AP -1 dráhu a fosforyláciu IkB, IkB kinázy (IKK)-, Akt a Src, ktoré sa podieľajú na dráhe NF-kB. Celkovo sme preukázali, že Q-3-G má protizápalové, antioxidačné, zvlhčujúce a antimelanogenézne vlastnosti v ľudských keratinocytoch a melanómových bunkách prostredníctvom NF-kB a AP-1 dráh.
Kľúčové slová: kvercetín 3-O- -D-glukuronid; UV ochrana; zvlhčujúce; antimelanogenéza; AP-1; NF-kB
1. Úvod
Koža, najväčší orgán tela, ponúka bariéru, ktorá hrá hlavnú úlohu pri ochrane tela pred vonkajším prostredím a škodlivými faktormi, ako je ultrafialové žiarenie, infekčné mikróby a škodlivé chemikálie. Táto bariéra tiež reguluje telesnú rovnováhu elektrolytov a teplotu a zabraňuje strate vlhkosti [1,2]. Ľudská koža sa skladá z troch vrstiev: epidermis, dermis s príveskami a podkožného tkaniva [3]. Epidermálna vrstva hrá dôležitú úlohu pri udržiavaní telesnej teploty.
Keratinocyty, hojná zložka v kožnej epiderme, navzájom tesne interagujú prostredníctvom desmozómov a tesných spojení, ktoré umožňujú účinnú fyzikálno-chemickú bariéru[4]. Hoci koža funguje ako ochranná bariéra, ultrafialové (UV) žiarenie má významný vplyv na väčšinu buniek, vrátane keratinocytov, vonkajšej vrstvy kože. UV žiarenie môže spôsobiť starnutie pokožky, poškodenie kože, vrásky a hyperpigmentáciu, ktorá sa považuje za jeden z najcenzornejších rizikových faktorov [5]. UV svetlo sa skladá z troch rozsahov vlnových dĺžok: UVA(320-400 nm), UVB (280-320 nm) a UVC (200-280 nm). Okrem peroxidu vodíka (H2O2), o ktorom je známe, že prispieva k oxidačnému stresu, môže UVB viesť k produkcii reaktívnych foriem kyslíka (ROS) prostredníctvom aktivácie enzýmov generujúcich ROS [6]. Bolo opísané, že nekontrolovaná akumulácia ROS v bunkách vrátane keratinocytov spôsobuje oxidačné modifikácie lipidov, proteínov, nukleových kyselín a iných intracelulárnych molekúl, ktoré následne vedú k rôznym typom poškodenia kože a procesom súvisiacim so starnutím, ako je bunková smrť, oxidačný stres, a zápal [7,8]. Okrem toho je známe, že reakcia na oxidačný stres ovplyvňuje poškodenie rôznych bunkových komponentov [9]. Poškodené kožné bunky môžu tiež viesť k zápalovým reakciám, ktoré vedú k chronicky poškodenej pokožke [10]. Jedným z typov UVB alebo H2O2-sprostredkovaného poškodenia kože prostredníctvom biologických procesov je expresia zápalových génov, ako sú cyklooxygenáza-2 (COX-2) a prozápalové cytokíny [11]. Preto je vývoj bezpečnejších, robustnejších a účinnejších ochranných účinkov na pokožku nevyhnutný na prevenciu a blokovanie chorôb spojených s poškodením kože spôsobeným UVB alebo H2O2.
Dôležitú úlohu pri udržiavaní jej normálnej funkcie zohráva aj hydratácia pokožky. Najmä stratum corneum (SC) má ochranný účinok proti strate vody [12]. Obsah vody v stratum corneum sa podieľa na deskvamácii kože a správnom dozrievaní, zatiaľ čo nedostatok vody v SC podporuje akumuláciu a dysfunkciu korneocytov [12,13]. V záverečných štádiách diferenciácie keratinocytov ich plazmatická membrána a bunkové organely zmiznú a potom influx vápnika indukuje transglutaminázu (TGM) na zosieťovanie s inými proteínmi. Nedostatok alebo strata TGM-1 vedie k chybnému zosieťovaniu bunkového obalu. Lamelová ichtyóza je príkladom ochorenia spôsobeného stratou TGM-1. Okrem toho filagrín (FLG), vytvorená keratínová matrica, hrá úlohu pri tvorbe SC, pretože pôsobí ako lešenie na viazanie proteínov a lipidov v zrohovatenej obálke[14] katalýzou sieťovacích reakcií g-glutamyllyzín, ATGM a membrány. -asociované enzýmy, ktoré poskytujú integritu SC [15]. Okrem toho je kyselina hyalurónová (HA) typom prirodzeného hydratačného faktora (NMF), ktorý sa podieľa na zadržiavaní vlhkosti v pokožke a vykazuje zreteľný profil pri starnutí pokožky, je prostriedkom na dodávanie liečiv a je dôležitou zložkou extracelulárnej matrice. [16,17]. HA hrá úlohu pri zvyšovaní vlhkosti pokožky reguláciou génov syntázy kyseliny hyalurónovej (HAS); okrem toho kyselina retinová (vitamín A) môže účinne regulovať HA v epidermis [17]. TGM-1, FLG a HAS-12,3 sú gény spojené s produkciou NMF [18]. Okrem toho sa aktivácia transkripčných faktorov, ako je aktivačný proteín-1(AP-1) a jadrový faktor (NF)-kB, podieľa na produkcii prozápalových látok, ktoré optimalizujú kožnú bariéru a hydratáciu pokožky. prostredníctvom dráh AP-1 a NF-kB[19]. Upstream signálne enzýmy v AP-1 dráhe zahŕňajú mitogénom aktivované proteínkinázy (MAPK), ako je c-Jun N-terminálna kináza (JNK), extracelulárna signálom regulovaná kináza (ERK) a p38, zatiaľ čo Src, Akt, IkB-kináza (IKKo/ ) a KBO(IkBa) patria do NF-KB dráhy [20. Koža tiež produkuje melanín v epidermálnej vrstve, najmä v melanocytoch – hlavnom zdroji melanínu – ktoré prispievajú k určeniu farby kože a melanogenéze [21]. UVB ožarovanie a hormón stimulujúci melanocyty (o-MSH) môžu stimulovať sekréciu melanínu, a tým spustiť melanogenézu [22. Počas melanogenézy -MSH aktivuje proteínkinázu A (PKA), transkripčný faktor súvisiaci s proteínovou mikroftalmiou (MITF) a väzbu prvku odpovede na cAMP (CREB)[23]. Za jednu z funkcií melanínu sa považuje prevencia poškodenia kože UV žiarením, vrátane slnečného žiarenia. Avšak nadmerná produkcia melanínu alebo absencia obsahu melanínu spôsobená starnutím, hormónom stimulujúcim melanocyty a vystavením UV žiareniu podporuje pehy, melazmu, senilné lentigíny a iné hyper/hypopigmentačné poruchy, ktoré by mohli mať negatívny vplyv na vzhľad a pokožku. zdravie [24]. Kontrola melanogenézy je teda tiež žiaduca na udržanie zdravotného aj kozmetického vzhľadu ľudského tela.
kvercetínje prevládajúci alokovaný flavonoid flavonolového typu prítomný v zelenine, ovocí, nápojoch a liečivých rastlinách [25]. V dôsledku toho bol kvercetín dôkladne študovaný, aby mal farmakologické výhody vrátane protizápalových, antiaterosklerotických,antioxidant, protirakovinové a ochranné vlastnosti pokožky a súvisí s melanogenézou [24,26-29]. Viaceré práce využívajúce citlivé a spoľahlivé metódy však preukázali, že kvercetín nebol detegovaný v plazme [30-33] a len ťažko sa nachádza v mozgu [34,35]. Kvercetín, ktorý sa vo všeobecnosti vyskytuje vo forme glykozidu, sa dobre vstrebáva a väčšinou sa hydrolyzuje a metabolizuje v tenkom čreve, hrubom čreve, pečeni a obličkách na konjugované metabolity [30,36-38]. V cirkulujúcej krvi sa detegujú iba konjugované metabolity, ako je glukuronid alebo sulfát (metylovaný alebo nemetylovaný, v danom poradí), a nie kvercetín aglykón alebo jeho glykozidy. 3/-metyl-kvercetín-3-glukuronid, kvercetín-3-glukuronid a kvercetín-3'-sulfát boli identifikované ako hlavné metabolity v plazme po 1,5 hodine od konzumácie smaženej cibule[30, 32]. Tieto metabolity kvercetínu sa tvoria v tenkom čreve a pečeni biotransformačnými enzýmami vrátane UDP-glukuronyltransferáz ako výsledok metabolizmu fázy II [29,39,40]. Bolo tiež hlásené, že konjugované metabolity kvercetínu sa akumulujú v ľudskej plazme v koncentračnom rozsahu 10-' až 10- stupeň M po periodickom požití cibule s jedlom počas 1 týždňa[41]. Polčas metabolitov kvercetínu je pomerne vysoký, približne 11 až 28 hodín [29]. Keďže tieto zlúčeniny boli pozorované ako hlavné formy konjugovaných metabolitov kvercetínu, štúdie zamerané na biologickú aktivitu flavonolov s použitím týchto konjugovaných metabolitov by boli nevyhnutné, čo nás podnietilo študovať biologickú aktivitu jedného z konjugovaných metabolitov kvercetínu. Jedným z najrozšírenejších glukuronidových metabolitov, ktoré sa nachádzajú hlavne v plazme a tkanivách vrátane pečene, obličiek a mozgu, je kvercetín 3-O- -D-glukuronid (Q-3-G) (obrázok 1) [31,35,40,42,43], ktoré môžu vytvárať podobné, silnejšie alebo slabšie aktivity v porovnaní s materskými zlúčeninami v rôznych modeloch. Q-3-G je transportovaný do cieľových tkanív prostredníctvom plazmy, aby prejavil svoju biologickú aktivitu [39]. Ukázalo sa tiež, že O-3-G je účinný metabolit v plazme potkanov po perorálnom podaní kvercetínu [43]. V iných štúdiách sa zistilo, že metabolit obsahujúci Q-3-G sa nahromadil v aorte po podaní potravy bohatej na kvercetín a bol identifikovaný ako aktívna látka zistená v ľudskej krvi v rozsahu od 0.{{48} } μM【44】. Okrem toho Q-3-G možno nájsť vo víne [45] a v liečivých rastlinách, ako je Hypericum hirsutum, Nelumbo nucifera, Oenothera biennis a zelená fazuľa [46-49].Q-3-G bol opísaný ako protizápalová zložka za podmienok stimulovaných LPS a vykazoval antioxidačné vlastnosti v krvnej plazme [50-52]. Avšak v porovnaní s dlhou históriou aplikácie a rozsiahlym štúdiom kvercetínu zostáva štúdium Q-3-G ešte potrebné preskúmať. Preto bol Q-3-G vybraný ako zástupca metabolitov kvercetínu ako aktívny hráč in vivo kvercetínu. Okrem toho ešte nie je úplne objasnená úloha Q-3-G na ochranné účinky pokožky. V tejto štúdii sme pomocou rôznych hodnotení in vitro skúmali ochranné účinky Q-3-G na pokožku proti oxidatívnemu stresu a zápalu vyvolanému UVBor H2O2-, hydratáciu pokožky v HaCaT (bunková línia ľudských keratinocytov) bunky a antimelanogenéznu aktivitu v bunkách B16F10 (bunková línia myšieho melanómu).
2. Výsledok
2.1. Protizápalové a antioxidačné účinky Q-3-G proti UVB alebo H2O2-stimulovaným bunkám HaCaT
Kožné tkanivo môže byť poškodené UV žiarením. UV žiarenie aktivuje niekoľko škodlivých faktorov vrátane oxidačného stresu, apoptotickej bunkovej smrti, zápalu a starnutia pokožky. Aby sme určili UV ochranné aktivity Q-3-G, najprv sme vyhodnotili, či Q-3-G má nejaké účinky na bunkovú životaschopnosť ľudských keratinocytov. Pomocou testu 3-(4-5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyl-243 tetrazóliumbromidu (MTT) sme skúmali cytotoxické účinky O-3-G v HaCa bunkách. Ako je znázornené na obrázku 2a, pri koncentrácii 2.5-20 uM pomocou Q-3-G nedošlo k žiadnej významnej interferencii na životaschopnosti buniek, čo naznačuje, že O-3-G nevykazoval žiadnu cytotoxicitu až do 20 μM a nepoškodil keratinocyty, povrchovú vrstvu kožných buniek. Ďalej sme hodnotili ochranné účinky Q-3-G na pokožku v bunkách HaCaT vystavených UVB. Po UVB ožiarení pri 30 mJ/cm² Q-3-G významne chránil HaCaT bunky pred UVB-indukovanou bunkovou smrťou spôsobom závislým od koncentrácie (obrázok 2b). V súlade s testom MTT, pomocou kamery pripojenej k mikroskopu na zachytenie morfológie HaCaT buniek, Q-3-G chránil pred bunkovou smrťou v dôsledku UVB-ožiarených HaCaT buniek až do koncentrácie 10 μM (obrázok 2c） . Počet buniek HaCaT za každých podmienok bol 482 pre neošetrenú skupinu, 91 pre skupinu s UVB 30 mJ/cm, 276 pre skupinu s UVB 30 mJ/cm² plus 5 μM O-3-G a 320 pre skupinu s UVB 30 mJ/cm² plus 10 μM Q-3-G skupina (obrázok 2d). Tieto výsledky potvrdili, že Q-3-G inhibuje poškodenie HaCaT vyvolané UVB a zachraňuje ochranný účinok pokožky pred UVB žiarením.
![i-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 μM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 μM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 μM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s or incubated with H2O2 (500 μM) with or without Q-3-G (5–10 μM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 μM) was reacted with 2,2-diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s with or without Q-3-G (5– 10 μM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted.](/Content/uploads/2022842169/2022032111072748381b7599e14e8e8a252699414e284f.png "i-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 μM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 μM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 μM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s or incubated with H2O2 (500 μM) with or without Q-3-G (5–10 μM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 μM) was reacted with 2,2-diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s with or without Q-3-G (5– 10 μM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted.")
Výskyt a exacerbácia zápalu v tele príležitostne aktivuje makrofágy a uvoľňuje niektoré cytokíny. Zápal je charakteristickým znakom oxidačného stresu. Skúmali sme protizápalový účinok Q-3-G proti zápalu vyvolanému UVB alebo HO2-. Je dobre známe, že UVB môže podporovať poškodenie DNA a zápal v kožných bunkách 【10】. Bunky HaCaT sme ožiarili UVB 30 mJ/cm² a bunky HaCaT sme inkubovali s H2O2 (500 uM). Použili sme test PCR v reálnom čase na kontrolu expresie mRNA zápalového enzýmu COX-2 a prozápalového cytokínu TNF-. Ako ukazujú výsledky na obrázku 2e,f, 10 μM koncentrácia O-3-G významne inhibovala expresiu mRNA COX-2 a TNF-. V dôsledku toho Q-3-G potlačil zápalové reakcie indukované v HaCaT bunkách po vystavení UVB žiareniu alebo H2O2.
Použili sme testy na zachytávanie radikálov 2,2'-azinobis-(3-etylbenzotiazolín-6-sulfónovej kyseliny) (ABTS) a 2,2-difenyl-lpikrylhydrazyl(DPPH) – široko používané modelové systémy skúmať zachytávacie aktivity prírodných zlúčenín in vitro – posúdiť antioxidačnú vlastnosť Q-3-G pri rôznych koncentráciách. HaCaT bunky boli ošetrené Q-3-G spôsobom závislým od koncentrácie od 2,{14}} μM v prítomnosti DPPH a výsledok ukázal významnú zachytávaciu aktivitu pri viac ako 2,5 uM (obrázok 2g) . Test ABTS tiež významne preukázal účinky Q-3-G na zachytávanie voľných radikálov spôsobom závislým od koncentrácie s hodnotou IC50 1,75 μM (obrázok 2h). Kyselina askorbová (AA) ako pozitívna kontrola vykazovala najväčšie antioxidačné účinky v testoch DPPH aj ABTS. Bolo hlásené, že erytroidný faktor 2 (Nrf2), jeden z génov závislých na prvku antioxidačnej odozvy (ARE), reguluje ochranné oxidoreduktázy a ich nukleofilné substráty, čím podporuje antioxidačné enzýmy na odstránenie poškodenia a opravy systémy [53]. Ďalej sme skúmali hladinu expresie Nrf2 v bunkách HaCaT ožiarených UVB. Posilnením vyššie uvedených zistení O-3-G významne zvýšil úroveň expresie Nrf2 po ožiarení UVB v porovnaní s kontrolou v závislosti od koncentrácie, až do 10 uM (obrázok 2i), čo znamená, že Q-3- G má antioxidačný účinok chemicky aj biologicky s vlastnosťou zachytávať voľné radikály a zvyšuje ochranný účinok signalizácie ARE závislej od Nrf2-, resp. Ďalej sme tiež vykonali prietokovú cytometriu ROS s použitím dichlórdihydrofluoresceín diacetátu (DCFDA) v UV podmienkach. Je všeobecne známe, že antioxidant potláča bunkové stresory inhibíciou produkcie ROS [54]. Výsledok ukázal, že ošetrenie Q-3-G v koncentráciách 5 a 10 μM znížilo hladinu ROS indukovaného UVB (obrázok 2j). Súhrnne tieto údaje naznačujú, že Q-3-Ge má ochranné vlastnosti pokožky, ako sú protizápalové a antioxidačné účinky proti H2O alebo oxidačný stres a zápal vyvolaný UVB v bunkách HaCaT.
![A level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s or incubated with H2O2 (500 µM) with or without Q-3-G (5–10 µM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 µM) was reacted with 2,2- diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s with or without Q-3-G (5–10 µM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) and Q-3-G (0-10 µM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2 , DPPH, or ABTS)](/Content/uploads/2022842169/202203211108455bff4d0223ef483dbe3172e2d3349d71.png "A level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s or incubated with H2O2 (500 µM) with or without Q-3-G (5–10 µM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 µM) was reacted with 2,2- diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s with or without Q-3-G (5–10 µM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) and Q-3-G (0-10 µM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2 , DPPH, or ABTS)")
2.2. Antitimelanogenézny účinok v B16F10 a zvlhčujúci účinok v HaCaT bunkách Q-3-G
Aby sa preskúmali účinky O-3-G na melanogenézu, bunky melanómu sa ošetrili s -MSH počas 48 hodín, aby sa vylučoval melanín v bunkách B16F10. Použitím testov MTT sme najprv potvrdili, že Q-3-G nemal žiadnu cytotoxicitu v bunkách B16F10 pri koncentráciách až do 20 uM počas 48 hodín (obrázok 3a). Tento výsledok pre ďalšie hodnotenia ukázal, že účinky O-3-G v B16F10 neboli spôsobené bunkovou smrťou. Ďalej sme hodnotili B16F10 pomocou Q-3-Gand -MSH počas 48 hodín, aby sme určili účinky Q-3-G na melanogenézu. Ako je znázornené na obrázku 3b, Q-3-G významne inhiboval sekréciu melanínu. Pozitívna kontrola arbutín tiež významne znížil sekréciu melanínu.
Molekula súvisiaca s vlhkosťou pokožky je kyselina hyalurónová (HA). Ako už bolo spomenuté, HA, distribuovaná v epidermis a dermis, je NMF, ktorý zvyšuje hydratáciu pokožky [55]. Použili sme test reverznej transkripcie PCR (RT-PCR) na preskúmanie úrovne transkripcie HAS-1 po 12 hodinách s koncentráciou Q-3-G do 30 uM. HAS podporuje akumuláciu HA strednej veľkosti v keratinocytoch [12]. Ako je znázornené na obrázku 3c, expresia HAS-1 sa zvýšila pôsobením Q-3-G až na 10 μM. Okrem zvlhčujúceho faktora sme skúmali aj expresiu FLG a TGM{{ 13}}. Ako pozitívnu kontrolnú skupinu sme použili retinol. Hladiny transkripcie FLG a TGM-1 sa výrazne zvýšili po liečbe Q-3-G v koncentráciách do 10 μM (obrázok 3d). Tieto zistenia naznačujú, že Q-3-G má hydratačnú aktivitu pokožky v bunkách HaCaT. Okrem toho sme pomocou SB203580 (inhibítor p38), SP600125 (inhibítor JNK), UO126 (inhibítor ERK) a Bay11-7082 (inhibítor NF-kB) skúmali zapojenie signálnych dráh MAPK a NF-kB do zvlhčovania faktor HaCaT buniek ošetrených Q-3-G. Na základe génovej expresie indukovanej O-3-G sa hladiny TGM-1 aj FLG znížili liečbou SP600125, inhibítorom JNK (obrázok 3e), čo naznačuje, že na zvýšenie expresie je potrebný JNK TGM-1 a FLG z hľadiska hydratačného účinku O-3-G. Okrem toho expresiu FLG znížil aj Bay11-7082, inhibítor IKK a IkB , čo naznačuje, že farmaceutický mechanizmus Q-3-G by tiež mohol patriť do signálnej dráhy NF-kB.
2.3. Signalizačné dráhy Q-3-G súvisiace s zvlhčovaním prostredníctvom aktivácie AP-1 a NF-kB
Na základe predchádzajúcich výsledkov mRNA sme predpokladali, že zapojenie signalizácie AP-1 a NF-kB na hydratačný účinok Q-3-G sa môže vyskytnúť aj v hladinách proteínov. Pomocou testu Western blot sme skúmali fosforyláciu upstream molekúl AP-1 a NF-kB. Po prvé, v dráhe AP-1 sa fosforylácia c-Jun zvýšila po inkubácii buniek HaCaT s Q-3-G počas 24 hodín (obrázok 4a). Hladina p-INK sa tiež zvýšila po liečbe Q-3-G v koncentráciách 2,5, 5 a 10 μM. Celková forma JNK zostala nezmenená (obrázok 4b). Ďalej sme skúmali fosforyláciu MKK4 a TAK-1, čo sú upstream regulátory JNK. Ako je znázornené na obrázku 3c, po ošetrení buniek HaCaT pomocou O-3-G boli tiež zvýšené hladiny proteínov p-MKK4 a p-TAK1.
Okrem signalizácie NF-kB, Q-3-G zvýšil fosforyláciu p50 a p65, podjednotky NF-kB (obrázok 4c). Okrem toho sme hodnotili aktiváciu IKK a IkBa, ktoré boli tiež zvýšené o Q-3-G až na 10 uM v porovnaní s kontrolnou skupinou (obrázok 4d). Nakoniec sme určili aktiváciu upstream molekúl zapojených do signálnej dráhy NF-kB. Fosforylácia Src a Akt (Ser473) bola zvýšená pôsobením O-3-G (obrázok 4e). Celkovo tieto údaje naznačujú, že účinky ochrany kože Q-3-G sa zameriavajú na aktiváciu TAK1 a Src zvýšením hladiny proteínu, čím sa zvýši aktivita AP-1 a NF-kB, v danom poradí.
2.4. Účinky Q-3-G na transkripčnú aktiváciu AP-1 a NF-kB
Skúmali sme bunkovú cytotoxicitu Q-3-G v bunkách ľudskej embryonálnej obličkovej bunkovej línie HEK293T pomocou MTT testu (obrázok 4f). Životaschopnosť buniek HEK293T nebola významne ovplyvnená po ošetrení s Q-3-G（2.5-20μM） v porovnaní s neošetrenými bunkami.
Použili sme luciferázový test, aby sme určili, či Q-3-G môže modulovať testy NF-kB a AP-1 promótora. Potvrdili sme, že O-3-G zvýšil luciferázovú aktivitu sprostredkovanú AP{4}} (obrázok 4g) a luciferázovú aktivitu sprostredkovanú NF-kB (obrázok 4h) spôsobom závislým od koncentrácie. Tieto výsledky potvrdzujú, že aktivácia AP{10}} a aktivácia NF-KB sú dôležitými farmakologickými cieľmi Q-3-G.
Kliknutím na odkaz získate ďalšie informácie:https://www.xjcistanche.com/news/part-2-protizápalový-antioxidant-moistu-55118278.html
