Ochranné účinky wogonínu na lipopolysacharidmi indukované zápaly a apoptózu buniek pľúcneho epitelu a jeho možné mechanizmy

Kontakttina.xiang@wecistanche.com

Abstraktné

Pozadie: Wogonin (5,7-dihydroxy-8-metoxyflavón) je prírodný dihydroxyflavonoid extrahovaný z koreňa Scutellaria baicalensis Georgi. Tento dokument bol určený na skúmanie mechanizmu účinku wogonínu pri zmierňovanízápalaapoptózapri akútnom poškodení pľúc (ALI).

Materiály a metódy: Lipopolysacharid (LPS) sa použil na vytvorenie in vitro modelu ALl. Po ošetrení wogonínom sa merala životaschopnosť a apoptóza buniek A549 indukovaných LPS pomocou CCK-8, TUNELassays a duálneho farbenia akridínová oranž/etídiumbromid, zatiaľ čo obsahy zápalových cytokínov aoxidačný stresmarkery boli odhadnuté pomocou RT-qPCR, testu ELISA, analýzy western blot a komerčných súprav. Uskutočnil sa aj Western blot na vyhodnotenie expresie zahrnutých proteínov. Následne sa skúmal účinok wogonínu na deacetyláciu proteínu skupiny box 1 (HMGB1) sprostredkovanej sirtuínom 1 (SIRT1). Inhibítor SIRT1 EX527 sa použil na vyhodnotenie regulačných účinkov wogonínu na deacetyláciu HMGB1 sprostredkovanú SIRT1- v bunkách A549 pri stimulácii LPS.

Výsledky: LPS indukoval zápal, oxidačný stres a apoptózu buniek A549, ktorá bola zrušená wogonínom. Zistilo sa tiež, že wogonín podporoval deacetyláciu HMGB1 sprevádzanú upregulovanou expresiou SIRT1. Inhibítor SIRT1 EX527 však čiastočne zvrátil ochranné účinky wogonínu na zápal a apoptózu buniek A549 indukovaných LPS.

Záver: Wogonin zmiernil zápal a apoptózu v LPS-indukovaných bunkách A549 prostredníctvom SIRT1-sprostredkovanej deacetylácie HMGB1, čo by mohlo predstavovať identifikáciu nového mechanizmu, ktorým wogonín vykazuje ochranné účinky na ALI a poskytuje nápady na aplikáciu wogonínu na VŠETKO ošetrenie.

Kľúčové slová: Akútne poškodenie pľúc, Wogonin, Zápal, SIRT1, deacetylácia HMGB1

Kliknutím sem získate ďalšie informácie

Pozadie

Akútne poškodenie pľúc (AL) je klinicky zdokumentované ako výsledok patologických stavov vrátane sepsy, pneumónie, traumy a akútnej pankreatitídy [1]. Často sa vyskytuje u pacientov, ktorí sú prijatí na jednotky intenzívnej starostlivosti a vykazuje vysokú mortalitu [2]. Tí, ktorí prežili ALI, sú zvyčajne konfrontovaní s horšou kvalitou života [3]. Hoci sa dosiahli úspechy v porozumení patofyziológie AL, účinnosť liečby súčasných terapií zostáva obmedzená, čo nemôže naplniť očakávania pacientov a ich rodín [4]. Preto je veľmi naliehavé identifikovať nové terapie alebo ciele na liečbu ALL. Wogonín (5,7-dihydroxy-8-metoxyflavón), ktorého štruktúra je znázornená na Obr. 1A, je prírodný dihydroxylový flavonoid extrahovaný z koreňa Scutellaria baicalensis Georgi [5]. O jeho významných protizápalových vlastnostiach a jeho aplikácii pri liečbe zápalových ochorení informovalo veľké množstvo štúdií. Napríklad wogonín potenciálne zlepšil pľúcny edém u myší a chránil ich pred ALI vyvolanou lipopolysacharidmi (LPS) blokovaním p38 mitogénom aktivovanej proteínkinázy (MAPK) a c-Jun NH(2)-terminálnej kinázy (INK fosforylácia [6] Wogonín tiež znižoval LPS-indukovanú infiltráciu neutrofilov, produkciu prozápalových cytokínov, expresiu adhéznych molekúl a potláčal LPS-indukovanú AL u myší [7].Súčasné dôkazy naznačujú, že zápalová odpoveď a ALI indukované LPS by mohli byť oslabené ako výsledok liečby wogonínom prostredníctvom NF-KB dráhy sprostredkovanej peroxizómovým proliferátorom aktivovaným receptorom gama (PPARy) [8]. Vznikajúca štúdia ukázala, že wogonín redukoval podviazanie slepého čreva a punkciu (CLP) indukovaný vysokomobilný proteín skupiny box 1 (HMGB1) produkcia a zápal závislý od HMGB{29}} a znížená morbidita súvisiaca so sepsou a riziko poškodenia pľúc [9]. V modeli ALI in vitro a in vivo indukovanom LPS ďalšia správa preukázala, že inhibícia HMGB1 a iné mediátory zápalu prostredníctvom ulinastatínu evidentne zmierňovali prejavy ALI [10]. A predchádzajúce štúdie potvrdili, že LPS-indukované ľudské pľúcne epiteliálne bunky (A549) boli široko používané ako in vitro model pre ALI [11-13]. Predpokladá sa, že sirtuín 1 (SIRT1), downstream efektor adenozínmonofosfátom aktivovanej proteínkinázy (AMPK), zohráva významnú úlohu pri regulácii uvoľňovania adiponektínu [14]. Suplementácia wogonínu výrazne zvýšila fosforyláciu AMPK a expresiu SIRT1, zatiaľ čo inhibícia AMPK alebo SIRT1 znížila účinky wogonínu na produkciu alebo uvoľňovanie adiponektínu [14]. Už skôr bolo hlásené, že deacetylácia HMGB1 modulovaná SIRT{45}} inhibovala akútne poškodenie obličiek spôsobené sepsou [15].

V tejto štúdii sme sa zamerali na skúmanie mechanizmu účinku wogonínu pri zmierňovanízápalaapoptózaLPS-indukovaných ľudských pľúcnych epitelových buniek, čo by mohlo poskytnúť komplexnejší pohľad na liečbu ALI wogonínom.

Výsledky

Účinky wogonínu na životaschopnosť a apoptózu buniek A549 indukovaných LPS

Aby sme pozorovali účinok wogonínu na ALI, najprv sme špekulovali, či by životaschopnosť normálnych buniek A549 mohla byť poškodená wogonínom. Ako je znázornené na obr. 1B, wogonín nepoškodil bunky A549 bez akéhokoľvek ošetrenia, čo naznačuje bezpečnosť ošetrenia wogonínom v bunkách A549 v koncentráciách 0, 5, 10 a 20 uM. Po stimulácii LPS po dobu 24 hodín bola životaschopnosť buniek A549 výrazne poškodená, proti čomu pôsobil wogonín spôsobom závislým od koncentrácie (obr. 1C). Okrem toho výsledky z testu LDH ukázali, že významné zvýšenie aktivity LDH v bunkách A549 ošetrených LPS sa znížilo po podaní zvyšujúcich sa dávok wogonínu (obr. 1D). Ďalej sme testovali účinok wogonínu na apoptózu buniek A549 indukovaných LPS. Ako je znázornené na obr. 2A, farbenie TUNEL ukázalo, že expozícia LPS dramaticky zvýšila apoptózu buniek A549 v porovnaní s kontrolnou skupinou, ktorá bola znížená wogonínom spôsobom závislým od dávky. Okrem toho sa v skupine vystavenej LPS pozorovala zjavná downregulácia expresie Bcl{19}} a upregulácia expresie Bax, Cyto-C a štiepenej kaspázy 3 v porovnaní s kontrolnou skupinou, ktorá bola obnovená liečbou wogonínom (obr. 2B). Výsledky testov dvojitej fluorescencie AO/EB prezentované na obr. 3 konzistentne naznačujú, že LPS viedol k zvýšenej miere apoptózy buniek v porovnaní s kontrolnou skupinou, zatiaľ čo EB-pozitívne bunky boli po pridaní wogonínu v porovnaní s LPS výrazne znížené. skupina. Wogonín teda obnovuje životaschopnosť a znižuje apoptózu buniek A549 indukovanú LPS.

Účinky wogonínu na zápal a oxidačný stres buniek A549 indukovaných LPS

Na preskúmanie protizápalových a antioxidačných schopností wogonínu v ALI,zápalaoxidačný stresbolo detegovaných LPS-indukovaných buniek A549 ošetrených wogonínom. Ako je vidieť na obrázku 4A-C, hladiny mRNA zápalových cytokínov (TNF-, IL-6 a IL-1) merané pomocou RT-qPCR vzrástli po stimulácii LPS na výrazne vysoké hladiny, zatiaľ čo wogonín liečba viedla k zníženiu ich expresie. Výsledky ELISA v súlade s tým ukázali, že indukcia LPS viedla k významnému zvýšeniu obsahu TNF-, IL{9}} a IL{10}} v porovnaní s neliečenou skupinou, ktoré boli po liečbe wogonínom znížené v závislosti od dávky (obr. 4D-F). Dôležité je, že cyklooxygenáza-2(Cox{15}}) a fosfo-jadrový faktor (NF)-KB p65 (p-NF-KB p65), ktoré sú markermi súvisiacimi so zápalom, boli down-regulované LPS, zatiaľ čo upregulované wogonínom (obr. 4G). Okrem toho viedol LPS k zníženiu aktivít SOD a GSH-Px a zvýšeniu obsahu MDA a ROS, čo bolo zvrátené wogonínom (obr. 4H-K). Celkovo vzaté, wogonín zmierňuje zápal a oxidačný stres buniek A549 indukovaných LPS.

Regulácia wogonínu pri deacetylácii HMGB1 sprostredkovanej SIRT1-

Aby sme potvrdili našu špekuláciu, že wogonín má ochranné účinky na LPS-indukované poškodenie buniek A549 deacetyláciou HMGB1 sprostredkovanou SIRT1-, uskutočnili sme Western blot na detekciu hladín proteínov zúčastnených faktorov. Je zrejmé, že LPS potláčal expresiu SIRT1 a podporoval translokáciu HMGB1 z jadra do cytoplazmy spolu s acetyláciou HMGB1. Tento trend bol však zvrátený vystavením wogonínu bunkám A549 indukovaným LPS (obr. 5). Ošetrenie wogonínom teda reguluje deacetyláciu HMGB1 sprostredkovanú SIRT{10}} v bunkách A549 indukovaných LPS.

Regulácia inhibítora SIRT1 EX527 na bunkové správanie buniek A549 indukovaných LPS ošetrených wogonínom

Na overenie úlohy SIRT1 v základnom mechanizme, ktorým wogonín ovplyvnil zápal a apoptózu buniek A549 indukovaných LPS, sme použili EX527, inhibítor SIRT1, na liečbu buniek A549 indukovaných LPS počas 24 hodín. Ako je znázornené na obr. 6A, pridanie EX527 znížilo expresiu SIRT1, bránilo nukleo-cytoplazmatickému transportu HMGB1 a stimulovalo deacetyláciu HMGB1 v porovnaní so skupinou LPS plus Wogonin. Ďalšie testy CCK-8 a LDH ukázali, že EX527 poškodil regeneračný účinok wogonínu na životaschopnosť buniek A549 indukovaných LPS (obr. 6B). Okrem toho, účinky wogonínu na expresiu Bcl-2, Bax, Cyto-C a expresiu štiepenej kaspázy 3 boli čiastočne zmiernené EX527 v LPS-indukovaných bunkách A549 (obr. 6C). Nakoniec, trendy variácií zápalových faktorov (TNF-, IL-6 a IL-1), proteínov súvisiacich so zápalom (Cox-2 a p-NF-kB p65) a Markery oxidačného stresu (SOD, GSH-Px a MDA) v LPS-indukovaných bunkách A549 súčasne ošetrených wogonínom a EX527 preukázali, že EX527 poškodil inhibičné účinky wogonínu na zápal a oxidačný stres v bunkách A549 indukovaných LPS (obr. 7A-K). Preto inhibítor SIRT1 EX527 obracia ochranné účinky wogonínu na malígne fenotypy buniek A549 indukovaných LPS.

Diskusia

V súčasnosti mnohí odborníci uznali wogonín ako účinný prostriedok na liečbu zápalových ochorení. Jeho účinnosť pri zmierňovaní zápalových reakcií sa údajne pripisuje supresii NF-kB a aktivácii signálnych dráh nukleárneho faktora erytroidného 2-faktora 2 (Nrf2) súvisiaceho s nukleárnym faktorom 2[16]. Je zaujímavé, že predchádzajúce správy spájali protizápalový účinok so sprostredkovaním expresie iNOS a Cox-2 alebo s aktiváciou signálnych dráh reaktívnych foriem kyslíka (ROS)/ERK/Nrf2 [5,17]. V súlade s predchádzajúcimi zisteniami, ktoré nevykazujú žiadny účinok wogonínu na životaschopnosť chondrocytov, sme nenašli prakticky žiadny významný cytotoxický účinok wogonínu na normálne bunky A549, čo podporuje naše ďalšie skúmanie základného mechanizmu, ktorým wogonín ovplyvnil in vitro bunkový model ALI [17]. Oxidačný stres a zápal sú dva hlavné znaky v patogenéze AL, a preto sme zistili zmeny indikátorov oxidačného stresu a zápalových cytokínov pri liečbe wogonínom [18]. Je zaujímavé, že zápal a oxidačný stres boli zmiernené expozíciou wogonínu v modeli buniek A549 ošetrených LPS, čo dokazuje blokáda uvoľňovania prozápalových faktorov a zvýšená produkcia SOD a GSH-Px, ako aj znížená produkcia MDA po liečba wogonínom HMGB1 sa objavuje ako vysoko konzervovaný proteín, ktorý bol prvýkrát identifikovaný ako modulátor sepsy na myšom modeli[19]. Zameranie na HMGB1 sa považovalo za potenciálnu terapeutickú možnosť na liečbu sepsy vzhľadom na skutočnosť, že pacienti, ktorí sa prejavovali ako dlhotrvajúce zápalové reakcie, často vykazovali pretrvávajúce vysoké hladiny HMGB1 [10]. Nedávne správy a prehľady venovali veľkú pozornosť terapeutickým účinkom HMGB1 na zápalové ochorenia, neobmedzujúce sa na sepsu. Napríklad sa už predtým preukázalo, že inhibícia HMGB1 ulinastatínom zlepšila LPS-indukované poškodenie ALI u myší [10,20]. Po uvoľnení z aktivovaných monocytov/makrofágov slúžil HMGB1 ako prozápalový faktor prostredníctvom rôznych stimulantov [20]. Zápalové signály ako LPS by mohli vyvolať translokáciu HMGB1 súvisiacu s acetyláciou z jadra do cytoplazmy [21]. Tu zistenie, že translokácia HMGB1 z jadra do cytoplazmy po stimulácii LPS bola ovplyvnená liečbou wogonínom, nepriamo objasnilo, že zápalu buniek A549 spúšťanému LPS silne bráni wogonín.

Predpokladá sa, že SIRT1 hrá významnú úlohu v rôznych biologických procesoch [22]. V závislosti od cieľov deacetylácie sa zmeny v aktivite SIRT1 podľa očakávania týkali oxidačného stresu a zápalu [23]. HMGB1 bol nedávno uznaný ako cieľ deacetylácie SIRT1 [20]. Podstatné dôkazy naznačujú, že SIRT1-modulovaná deacetylácia HMGB1 zmiernila zápal, obnovila funkciu obličiek a predĺžila dobu prežitia myší s akútnym poškodením obličiek súvisiacim so sepsou [15]. V experimentálnej štúdii traumatického poškodenia mozgu Omega-3 polynenasýtená mastná kyselina zmiernila zápal moduláciou polarizácie mikroglií prostredníctvom SIRT1-modulovanej deacetylácie dráhy HMGB1/NF-KB [24]. Kyselina oleanolová ďalej zabránila u potkanieho modelu subarachnoidnému krvácaniu pomocou SIRT1-modulovanej deacetylácie HMGB1 [25]. Inhibícia NLRP3/NF-kB aloínom prostredníctvom aktivácie SIRT1 zoslabila LPS-infikovanú ALI u myší [26]. Reguláciou signalizácie SIRT1/HMGB1/NF-KB zlepšil kaempferol poškodenie pľúc vyvolané ischémiou-reperfúziou prostredníctvom protizápalového a antioxidačného stresu 27I. NF-kB ako dôležitá molekula v smere od HMGB1 je hlavnou signálnou dráhou zapojenou do regulácie zápalových mediátorov aktiváciou génov prozápalových faktorov a uvoľňovaním veľkého počtu zápalových faktorov vrátane TNF-, IL-6 a TNF -a[28,29]. Okrem toho sa NF-KBcan tiež podieľa na procese oxidačného stresu prostredníctvom regulácie produkcie ROS a ovplyvňovania hladín SOD, MDA a GSH-Px [30]. znížená expresia p-NF-kB p65 bola pozorovaná po pridaní wogonínu, ktorý bol obnovený inhibítorom SIRT1, EX527. Okrem toho sme zistili, že deacetylovaný HMGB1 wogonínom bol sprevádzaný aktivovanou expresiou SIRT1, čo viedlo k našej špekulácii, že wogonín môže mať ochranné účinky na LPS-indukovaný zápal buniek A549 deacetyláciou HMGB1 sprostredkovanou SIRT1-. Použitie EX527 v nasledujúcich experimentoch ďalej demonštrovalo, že inhibícia SIRT1 zvrátila ochranné účinky wogonínu na zápal buniek A549 indukovaných LPS.

Záver

Na záver sme demonštrovali, že wogonín zmiernil zápal, oxidačný stres a apoptózu bunkového modelu ALI indukovaného LPS. Zdá sa, že tento mechanizmus účinku je spôsobený reguláciou SIRT1-sprostredkovanej deacetylácie HMGB1 spúšťanej wogonínom. Tieto zistenia môžu identifikovať nový mechanizmus, ktorým wogonín vykazuje ochranné účinky na ALI a poskytnúť experimentálny základ pre aplikáciu wogonínu na klinickú liečbu ALI.

Materiály a metódy

Bunková kultúra a lieky

Human lung epithelial cells(A549) were purchased from the Cell Bank of Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology at the Chinese Academy of Sciences (Shanghai, China) and cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Gibco, Paisley, UK) containing 10% heat-inactivated fetal bovine serum(Gibco, Paisley, UK), 100 U/ml penicillin, and 100 g/ml streptomycin at 37 ℃ with 5% CO. The cells were collected after 10 μg/mL LPS（Sigma Chemical Co., St Louis, MO）stimulation for 24 h. Wogonin (purity>99 percent), izolovaných zo Scutellaria baicalensis Georgi, bolo zakúpených od Biotic Chemical (Taipei, Taiwan). Bol rozpustený v dimetylsulfoxide (DMSO), skladovaný pri -20 stupňoch C a zriedený DMEM. inhibítor SIRT1 EX527（10 uM; MedChemExpress, Shanghai, Čína) sa použil na ošetrenie buniek počas 24 hodín pred podaním podľa predchádzajúcej štúdie [31].

Test súpravy na počítanie buniek-8 (CCK{1}}).

Po stimulácii LPS počas 24 hodín a rôznych koncentráciách expozície wogonínu počas ďalších 4 hodín sa bunky naočkovali do 96-jamkovej platne a uskutočnil sa test životaschopnosti buniek pridaním 10 μl CCK-8 činidla（Dojindo , Kumamoto, Japonsko）do každej jamky pri 37 stupňoch počas 4 hodín. Absorbancia pri 450 nm sa monitorovala pomocou čítačky mikrodoštičiek (Bio-Rad Laboratories, Inc.).

Test uvoľňovania laktátdehydrogenázy (LDH).

Bunkový supernatant ošetrený wogonínom sa naočkoval na 96-jamkové kultivačné platne a inkuboval sa 24 hodín pri 37 stupňoch s 5 percentami CO, potom sa do každej pridalo 100 μl roztoku súpravy na detekciu cytotoxicity LDH (Roche Diagnostics, Francúzsko). o 15 minút neskôr sa bunkový supernatant zriedil, pričom hodnota optickej hustoty sa monitorovala pri 450 nm.

Terminálnou deoxynukleotidyltransferázou sprostredkované značenie nick end (TUNEL) farbenie Test TUNEL sa uskutočnil na vyhodnotenie apoptózy buniek A549 indukovaných LPS s alebo bez ošetrenia wogonínom pomocou súpravy Colorimetric TUNEL Apoptosis Assay Kit (Beyotime, Shanghai, Čína) na základe operácie usmernenia. Po dvojnásobnom premytí fosfátovým pufrom (PBS) a fixácii 4 percentami paraformaldehydu počas 0,5 hodiny,0,3 percentného peroxidu vodíka v PBS sa bunky inkubovali ďalších 20 minút pri teplote miestnosti. Bunky sa potom ošetrili diaminobenzénom (DAB) počas 10 minút a kontrastne sa farbili hematoxylínom (Solarbio, Peking, Čína) počas 30 sekúnd. Apoptoticky pozitívne bunky boli pozorované fluorescenčným mikroskopom (Olympus Corporation) a apoptotická rýchlosť bola kvalifikovaná softvérom Image-J (NIH, Bethesda, MD, USA).

Dvojité farbenie akridínová oranž/etidiumbromid

Na vyhodnotenie zmeny apoptózy buniek sa uskutočnili dvojité fluorescenčné testy akridínová oranž/etidium bromid (AO/EB). Stručne povedané, bunky A549 boli pestované na sklenených krycích sklíčkach v 24-jamkových platniach. Bunky sa predinkubovali počas 24 hodín s médiom bez séra a potom sa inkubovali s LPS a rôznymi koncentráciami wogonínu pri 37 °C. Bunky sa premyli PBS a dodali sa s 5 μl zmiešaného roztoku AO/EB (100 ug/ml AO a 100 ug/ml EB zmiešaného v PBS, Aladdin, Čína) v priebehu 3 minút. Bunky sa pozorovali a urobili fotografiu pri excitačnej vlnovej dĺžke 510 nm pod fluorescenčným mikroskopom (Olympus Corporation).

Western blot analýza

Proteíny boli extrahované z buniek A549 pomocou RIPA lyzačného pufra (Beyotime, Shanghai, Čína) a koncentrácie proteínov boli merané pomocou súpravy na stanovenie proteínov kyseliny bicinchonovej (BCA) (Thermo Fisher Scientific, USA). Potom sa uskutočnila elektroforéza na 10-percentnom dodecylsulfátovom polyakrylamidovom géli (SDS-PAGE) na oddelenie 40 ug proteínov a proteíny sa potom preniesli na polyvinylidéndifluoridové (PVDF) membrány. Tieto membrány boli potom blokované odtučneným mliekom a potom inkubované pri 4 °C cez noc s primárnymi protilátkami. Potom sa na inkubáciu membrán počas 1,5 hodiny pri teplote miestnosti použila sekundárna protilátka konjugovaná s HRP. Nakoniec boli pásy vizualizované vylepšenou chemiluminiscenčnou (ECL) súpravou (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK), zatiaľ čo intenzita pásov bola monitorovaná pomocou softvéru Image-J (NIH, Bethesda, MD, USA). GAPDH sa považovalo za internú referenciu.

Reverzná transkripčne-kvantitatívna PCR (RT-gPCR)

Bunky A549 sa lyžovali v 1 ml činidla TRIzol® (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) na extrakciu celkovej RNA. Po zbere celkovej RNA sa uskutočnila reverzná transkripcia na syntézu komplementárnej DNA (cDNA) pomocou reagenčnej súpravy PrimeScript RT (Takara Bio, Inc.). Podmienky boli nasledujúce: 50 °C 15 minút, 85 °C 5 s, a konzervácia pri 4 stupňoch. SYBR Premix Ex Taq TM (TaKaRa, Japonsko) sa použil na nastavenie reakčných podmienok PCR a reakčného systému na základe návrhov výrobcu. Na qPCR sa použil prístroj ABI 7500 (AB-4351107; Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Boli použité nasledujúce podmienky termocyklovania: počiatočná denaturácia pri 95 stupňoch počas 10 minút; nasleduje 40 cyklov denaturácie pri 95 °C počas 15 s a žíhanie pri 60 °C počas 1 minúty; a konečné predĺženie o 10 minút pri 72 °C. GAPDH bol akceptovaný ako normalizačná kontrola relatívnej génovej expresie. Výpočet relatívnej génovej expresie sa uskutočnil 2-metodou AAct.

Enzymovo viazaný imunosorbentový test (ELISA)

Bunkové hladiny interleukínu-6(IL-6), IL-1 a tumor nekrotizujúceho faktora- (TNF-) v bunkovom supernatante sa merali pomocou súpravy IL-6 ELISA Kit , súprava IL-1 ELISA a súprava TNF-ELISA na základe návrhov výrobcu (Shanghai Xi Tang Biotechnology, Shanghai, Čína).

Detekcia oxidačného stresu

Na detekciu oxidačného stresu boli aktivity markerov oxidačného stresu vrátane malondialdehydu (MDA), reaktívnych foriem kyslíka (ROS), glutatiónperoxidázy (GSH-Px) a superoxiddismutázy (SOD) detegované podľa pokynov výrobcu (Nanjing Jiancheng Biotechnology Inštitút, Čína).

Štatistická analýza

Všetky údaje boli uvedené ako priemer ± štandardná odchýlka (SD) aspoň troch nezávislých experimentov. Na porovnanie medzi viacerými skupinami sa uskutočnila jednosmerná analýza rozptylu (ANOVA) s Tukeyho post hoc testom, zatiaľ čo analýzy medzi dvoma skupinami sa uskutočnili Studentovým t-testom. P<0.05 was="" deemed="" as="" statistically="">

Skratky

AL: Akútne poškodenie pľúc; LPS: lipopolysacharid; HMGB1: proteín skupiny box 1 s vysokou mobilitou; PPARy. receptor-gama aktivovaný peroxizómovým proliferátorom; MAPK: mitogénom aktivovaná proteínkináza; JNK: C-Jun NH(2)-koncová kináza; CLP: podviazanie a punkcia slepého čreva; DMEM: Dulbeccovo modifikované Eagle médium; DMSO: dimetylsulfoxid; CCK-8:Súprava na počítanie buniek-8; LDH: laktátdehydrogenáza; TUNEL: značenie nick-end sprostredkované terminálnou deoxynukleotidyltransferázou; PBS: fosfátový tlmivý fyziologický roztok; DAB: diaminobenzén; AO/EB: akridínová oranž/etidium bromid; BCA: kyselina bicinchoninová; SDS-PAGE: elektroforéza na polyakrylamidovom géli s dodecylsulfátom sodným; PVDF: polyvinylidéndifluorid; ECL: zvýšená chemiluminiscencia; cDNA: komplementárna DNA; ELSA: Enzyme-linked immunosorbent assay; IL: interleukín; TNF-a: tumor nekrotizujúci faktor-a; MDA: malondialdehyd; GSH-Px glutatiónperoxidáza; SOD: superoxiddismutáza; SD: štandardná odchýlka; ANOVA: Analýza rozptylu; Cox{21}}:cyklooxygenáza{22}}; Nrf2: erytroidný 2-faktor 2 súvisiaci s jadrovým faktorom; ROS: Reaktívne formy kyslíka.

Referencie

1. Mokrá D, Košútová P. Biomarkery pri akútnom poškodení pľúc. Respir Physiol Neurobiol. 2015;209:52–8.

2. Hayes M, Curley G, Ansari B, Laffey JG. Klinický prehľad: Terapia kmeňovými bunkami pre akútne poškodenie pľúc/syndróm akútnej respiračnej tiesne – nádej alebo humbuk? Crit Care. 2012;16(2):205.

3. Angus DC, Clermont G, Linde-Zwirble WT, Musthafa AA, Dremsizov TT, Lidicker J, et al. Náklady na zdravotnú starostlivosť a dlhodobé výsledky po syndróme akútnej respiračnej tiesne: Skúška fázy III inhalovaného oxidu dusnatého. Crit Care Med. 2006;34(12):2883–90.

4. Hu JT, Lai J, Zhou W, Chen XF, Zhang C, Pan YP a kol. Hypotermia zmiernila akútne poškodenie pľúc vyvolané LPS v modeloch potkanov prostredníctvom dráhy TLR2/MyD88. Exp Lung Res. 2018;44(8–9):397–404.

5. Chi YS, Lim H, Park H, Kim HP. Účinky wogonínu, rastlinného flavónu zo Scutellaria radix, na zápal kože: in vivo regulácia génovej expresie súvisiacej so zápalom. Biochem Pharmacol. 2003;66(7):1271–8.

6. Wei CY, Sun HL, Yang ML, Yang CP, Chen LY, Li YC a kol. Ochranný účinok wogonínu na akútne poškodenie pľúc vyvolané endotoxínom prostredníctvom zníženia fosforylácie p38 MAPK a JNK. Environ Toxicol. 2017;32(2):397–403.

7. Yeh YC, Yang CP, Lee SS, Horng CT, Chen HY, Cho TH a kol. Akútne poškodenie pľúc vyvolané lipopolysacharidom je u myší inhibované wogonínom prostredníctvom zníženia fosforylácie Akt a aktivácie RhoA. J Pharm Pharmacol.2016;68(2):257–63.