Časť 1: Karbamylovaný sortilín spojený s kardiovaskulárnou kalcifikáciou u pacientov s chronickým ochorením obličiek

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Časť 1: Karbamylovaný sortilín spojený s kardiovaskulárnou kalcifikáciou u pacientov s chronickým ochorením obličiek

Kľúčové slová: chronické ochorenie obličiek, kardiovaskulárne, obličkové

Prekladové vyhlásenie

Pacienti schronické ochorenie obličieksú veľmi náchylné na vývojkardiovaskulárnechoroba.Chronické ochorenie obličiek-špecifickékardiovaskulárnerizikové faktory sú doteraz prevažne neznáme. Ukazujeme, že cirkulujúci sortilín je posttranslačne modifikovaný karbamyláciou u pacientov so zníženouobličkyfunkciu. Karbamylácia sorbilínu vedie k vyššej väzbovej afinite k interleukínu-6 a podporuje kalcifikáciu tepien ex vivo. Okrem toho je karbamylovaný sortilín rizikovým faktorom pre prítomnosť a progresiu kalcifikácie koronárnej artérie. Naše výsledky poukazujú na karbamylovaný sortilín ako potenciálny terapeutický cieľ brzdeniakardiovaskulárnekalcifikácia u pacientov schronické ochorenie obličiek.

Úvod

Sortilín, intracelulárny triediaci receptor, bol identifikovaný ako akardiovaskulárnerizikový faktor v bežnej populácii. Pacienti schronickýobličkychorobasú vysoko náchylné na rozvoj kardiovaskulárnych komplikácií, ako je kalcifikácia. Avšak, konkrétnechronickýobličkychoroba-indukované posttranslačné proteínové modifikácie sortilínu a ich väzba nakardiovaskulárnekalcifikácia zostáva neznáma. Aby sme to preskúmali, preskúmali sme dva nezávisléchronickýobličkychorobakohorty na karbamyláciu cirkulujúceho sortilínu a detekovali zvýšené karbamylované rezíduá lyzínu sortilín v extracelulárnej doméne sortilínu sobličkypokles funkcie pomocou cielenej hmotnostnej spektrometrie. Štrukturálna analýza predpovedala zmenenú väzbu ligandu karbamylovaným sortilínom, čo bolo overené väzbovými štúdiami s použitím merania povrchovej plazmónovej rezonancie, čo ukazuje zvýšenú afinitu interleukínu 6 k in vitro karbamylovanému sortilínu. Ďalej karbamylovaný sortilín zvýšil vaskulárnu kalcifikáciu in vitro a ex vivo, ktorá bola urýchlená interleukínom 6. Zobrazovanie hmotnostnou spektrometriou ľudských kalcifikovaných artérií odhalilo in situ karbamylovaný sortilín. U pacientov schronickýobličkychorobakarbamylácia sortilinu bola spojená s kalcifikáciou koronárnej artérie, nezávisle od veku aobličkyfunkciu. Okrem toho pacienti s karbamylovaným sortilínom vykazovali výrazne rýchlejšiu progresiu kalcifikácie koronárnej artérie ako pacienti bez karbamylácie sortilinu. Karbamylovaný sortilín teda môže byť rizikovým faktoromkardiovaskulárnekalcifikáciu a môže prispieť k zvýšenémukardiovaskulárnekomplikácie u pacientov schronickýobličkychoroba.

Cistanchemôže vyhnúťchronickýobličkychoroba.

Skúsenosti asi 1 z 10 ľudí na celom svetechronickýobličkychoroba.1 Poškodenéobličkyfunkcia je hlavným nezávislým rizikovým faktorom prekardiovaskulárnemorbiditu a mortalitu a mortalitu zo všetkých príčin.1,2 V skutočnosti pacienti schronickýobličkychorobaje oveľa pravdepodobnejšie, že zomrúkardiovaskulárnenež k rozvoju konečného štádia renálneho ochorenia Q14 vyžadujúceho dialýzu.3 Nadmerné ukladanie vápenatých minerálov vo vaskulárnom tkanive pozorované vchronickýobličkychorobapacientov prispieva najmä k zvýšenémukardiovaskulárneriziko.4chronickýobličkychorobauľahčuje posttranslačnú modifikáciu (PTM) proteínov.5 PTM sú zase spojené skardiovaskulárnekalcifikácia,6 čo naznačuje, že lepšie pochopenie PTM vchronickýobličkychoroba-indukované kalcifikačné procesy by mohli odhaliť nové terapeutické ciele. Avšak doteraz konkrétnechronickýobličkychoroba-súvisiace proteínové modifikácie spojené skardiovaskulárnekalcifikácia nie je známa.

Sortilín je všadeprítomne exprimovaný člen rodiny proteínov na triedenie vakuolových proteínov 10 vnútrobunkových triediacich receptorov.7 Je to jednopriechodový transmembránový proteín typu I s rôznymi úlohami pri triedení proteínov, prenose a bunkovej signalizácii. Ako receptor endocytózy môže sortilín spustiť internalizáciu ligandov z bunkového povrchu prostredníctvom endocytózy a triediť ligandy medzi intracelulárnymi kompartmentmi, ako je trans-Golgiho sieť, endozóm, lyzozóm a sekrečná dráha.8 Predklinické dôkazy in vivo naznačujú dôležitú úlohu sortilín v patogenéze vaskulárnych a metabolických porúch prostredníctvom prispievania k zápalu a kalcifikácii arteriálnej steny, dysregulovanému metabolizmu lipoproteínov a diabetes mellitus 2.kardiovaskulárnerisk factors.7 In human vascular smooth muscle cells (hSMCs), intracellular sortilin regulates the loading of the procalcific protein tissue nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) into extracellular vesicles, thereby conferring the calcification potential that contributes to microcalcification formation.9 The ectodomain of plasma membrane-bound sortilin can be shed and secreted into the circulation.7 In a community-dwelling cohort of men aged >50 rokov sme zaznamenali asociáciu vysokých hladín sortilínu v sére s kalcifikáciou aorty akardiovaskulárneudalosti, naznačujúce sortilín ako akardiovaskulárnerizikový faktor v bežnej populácii.10 Úloha sortilínu vchronickýobličkychoroba, populácia pacientov s výrazným nárastom vkardiovaskulárnekalcifikácie, naďalej vzdoruje objasneniu. Väčšina štúdií sa zamerala skôr na funkciu bunkového sortilínu než na skúmanie biologickej funkcie cirkulujúcej rozpustnej formy.7 Preto dosiahnutie lepšieho pochopenia mechanistického vzťahu medzi cirkulujúcim sortilínom a regulačným vplyvom PTM vchronickýobličkychorobarozšíri poznatky o sortiline vkardiovaskulárnekalcifikácie.

Táto štúdia spochybňuje hypotézu, že PTM cirkulujúceho sortilínu sa podieľa na vývojikardiovaskulárnekalcifikácia u pacientov schronickýobličkychoroba.

prínos Cistanche: liečba ochorení obličiek

METÓDY

Kardiovaskulárnea Renálny výsledok vchronickýobličkychoroba2–4 pacienti – kohorta štvrtého Homburgovho hodnotenia (CARE FOR HOME).

Štúdia CARE FOR HOMe už bola podrobne opísaná.11 Na analýzu sa použila podskupina 97 pacientov.

Dan-NICAD 1 kohorta

The study design of the Danish study of noninvasive testing in coronary artery disease (Dan-NICAD 1) trial has been described previously.12 For the analysis, we identified a subset of 97 enrolled patients with estimated glomerular filtration rate (eGFR) >60 ml/min a vykonala sa priraďovanie frekvencie na základe veku, pohlavia, indexu telesnej hmotnosti, fajčenia, diabetes mellitus akardiovaskulárnechoroba. Identifikácia sa uskutočnila naslepo pre hladiny sortilínu.KardiovaskulárneKohorta hĺbkového hodnotenia (CARVIDA) CARVIDA je podštúdia nemeckéhoChronickýObličkyChorobaštúdie.13 Boli použité iba vzorky pacientov s CARVIDA zaradených do štúdie v Aachene v Nemecku (n ¼ 78). Zobrazovanie počítačovou tomografiou sa uskutočnilo na CT skeneri s dvojitým zdrojom (SOMATOM Definition Flash alebo Force; Siemens), ako už bolo opísané.14 S priemernou dobou sledovania 4,4 roka 41 zo 78 pacientov súhlasilo alebo bolo dostupných pre druhú počítačovú tomografiu. skenovanie počas druhej návštevy CARVIDA v roku 2019/Q15 2020.

Štatistická analýza

Údaje z experimentálnej štúdie sú prezentované ako priemer SD; n označuje počet nezávislých experimentov alebo počet pacientov. Normalita bola testovaná pomocou Shapiro-Wilkovho testu a kvantilový graf a heterogenita rozptylu boli testované pomocou Brown-Forsythe testu. Na porovnanie 2 skupín sa vykonal párový alebo nepárový 2-tailový Studentov t-test s rovnakými alebo nerovnakými rozptylmi. Na porovnanie medzi 3 liečebnými skupinami sa vykonala 1- alebo 2-analýza rozptylu nasledovaná Tukeyho post hoc pre údaje s normálnym rozdelením a rovnakým rozptylom. Údaje so skreslenou distribúciou boli hodnotené Kruskal-Wallisovým testom, po ktorom nasledoval Dunn post hoc test. Údaje s nerovnakými rozptylmi boli testované Welchovou analýzou rozptylu, po ktorej nasledoval post hoc test Dunnett T3.

V klinických štúdiách sú kontinuálne údaje prezentované ako priemer SD pri normálnej distribúcii alebo ako medián a interkvartilný rozsah pre premenné so skreslenou distribúciou. Kategorické údaje sú prezentované v percentách. Pearson/Fisher c2 test sa použil na štúdium asociácie medzi kategorickými premennými a nepárovým Studentovým t-testom alebo Mann-Whitney U testom pre spojité premenné. Rozdiely medzi týmito 3 skupinami boli porovnané pomocou 1-analýzy rozptylu, po ktorej nasledoval Sidak post hoc test. Najmenší štvorec znamená, že počet karbamylovaných zvyškov sortilínu upravený o mnoho premenných sa vypočítal pomocou zovšeobecnených lineárnych modelov, ako bolo opísané vyššie.

Objem kalcifikácie koronárnych artérií (CAC) sa log-transformoval (tj prirodzený logaritmus, ln; ln[CAC plus 1]), aby sa znížila šikmosť. Dvojrozmerná korelácia bola hodnotená pomocou Eta (1 nominálna premenná a 1 metrická premenná) alebo Pearsonových korelačných koeficientov (ak boli obe premenné metrické). Zmena objemu CAC za rok sa vypočítala takto: [(sledovanie CAC – východisková hodnota CAC) / doba sledovania v mesiacoch] * 12. Analýza rozptylu so zmenou objemu CAC ako závislej premennej a členu s fixným účinkom na karbamyláciu (áno vs. nie) sa použila na analýzu progresie CAC. Okrem toho bol tento model upravený použitím analýzy kovariancie pre kovarianty CAC na základnej línii Q18 a premenné. P < 0.05="" sa="" považovalo="" za="" štatisticky="" významné.="" štatistické="" analýzy="" sa="" uskutočnili="" pomocou="" graphpad="" prism="" (prism="" software="" inc.,="" verzia="" 9)="" alebo="" spss="" (verzia="">

Cistanchemôže zlepšiťobličkyfunkcie achronickýobličkychoroba.

VÝSLEDKY

Karbamylovaný sortilín sa zvyšuje sobličkypokles funkcie

Spočiatku sme hodnotili sérové ​​hladiny sortilínu u pacientov schronickýobličkychorobazo štúdie CARE FOR HOMe11 a zistili zvýšené hladiny sortilínu v porovnaní so zodpovedajúcou kontrolnou skupinou s normálomobličkyfunkcie zo štúdie Dan-NICAD 1 (tabuľka 1). Cirkulujúce proteíny sú náchylné na PTM u pacientov schronickýobličkychorobaQ20 .5 Preto sme vykonali podrobné mapovanie PTM zvyškov cirkulujúceho sortilínu u účastníkov štúdie CARE FOR HOMe a zdravých kontrolných subjektov (doplnková tabuľka S1) pomocou MALDI-TOF/TOF MS. V porovnaní s kontrolnými subjektmichronickýobličkychorobapacienti mali 8 z 30 lyzínových zvyškov, ktoré boli prevažne karbamylované v extracelulárnej doméne sortilínu (doplnková tabuľka S3 Q21 a doplnkový obrázok S1). Reprezentatívne MS spektrá od kontrolného subjektu a pacienta schronickýobličkychorobasú znázornené na obrázkoch la a b. Špecifickosť signálu bola podporovaná MALDI-TOF/TOF-MS/MS spektrami (doplnkový obrázok S2A). Kvantifikácia odhalila achronickýobličkychorobaod štádia závislé zvýšenie počtu karbamylovaných zvyškov (obrázok 1c) a intenzity karbamylovaných sortilínových peptidov (obrázok 1d). Lyzínový zvyšok 205 bol vo všetkých rovnako modifikovanýchronickýobličkychorobafázy, zatiaľ čo zvyšky 95, 260 a 294 boli častejšie modifikované v pokročilých štádiáchchronickýobličkychorobaetapy (obrázok 1e).

Ďalej sme hodnotili asociácie medzi karbamyláciou sortilínu a základnými charakteristikami (doplnková tabuľka S2) v štúdii CARE FOR HOMe. Pozorovali sme vekovo závislý nárast rezíduí karbamylácie sortilínu (tabuľka 2). Nižšia funkcia obličiek na základe eGFR na základe sérového cystatínu c a kreatinínu (oblasť eGFRcys) a vyššie hladiny močoviny a N-terminálneho pro-mozgového natriuretického peptidu (NT-proBNP) boli spojené s vyššími karbamylovanými zvyškami sortilínu (tabuľka 2). Asociácie zostali významné po úprave podľa veku a pohlavia (tabuľka 2).chronickýobličkychorobapacienti liečení antagonistami aldosterónu Q22 vykazovali zníženú karbamyláciu sortilínu (tabuľka 2), zatiaľ čo v oblasti eGFRcys nebol žiadny rozdiel (nie, 50.6 23.2 ml/min na 1,73 m2; áno, 43.{{10}},9 ml/min na 1,73 m2; P ¼ 0,236) a močovina (nie, 68.6 40,1 mg/dl; áno, 72.{21 }},9 mg/dl; P ¼ 0,729) medzi pacientmi s alebo bez antagonistov aldosterónu. Okrem močoviny môže myeloperoxidáza sprostredkovať karbamyláciu proteínovkardiovaskulárneNezistili sme však žiadnu súvislosť medzi celkovými hladinami a aktivitou myeloperoxidázy a sortilínovej karbamylácie (doplnkové obrázky S3A a B).

liečba ochorení obličiek:Cistanche

Ďalej sme pomocou zobrazovania MS hodnotili prítomnosť karbamylovaného sortilínu v ľudských femorálnych artériách. Karbamylovaný peptid SEDYGK*NFK* (m/z 1172) bol vysoko prítomný v kalcifikovaných femorálnych artériách z r.chronickýobličkychorobapacientov a chýba v nekalcifikovaných femorálnych artériách (obrázok 1f). MS/MS spektrá podporovali identifikáciu SEDYGK*NFK* (doplnkový obrázok S2B). SEDYGK*NFK* sa nachádza v blízkosti kalcifikovaných oblastí v tunica media (obrázok 1g). Na rozdiel od toho intenzita hmotnostného signálu neposttranslačne modifikovaného peptidu SEDYGKNFK (m/z 1086) bola vyššia v kontrolných artériách (obrázok 1f).

Vzaté spolu v porovnaní s kontrolami s normálnou hodnotouobličkyfunkcie, pacienti schronickýobličkychorobamajú vyššie hladiny sortilínu v sére a vykazujú posttranslačný karbamylovaný sortilín v obehu, ktorý je možné detegovať aj vo vaskulatúre.

Karbamylovaný sortilín podporuje kalcifikáciu buniek hladkého svalstva Vzhľadom na naše zistenie, že karbamylovaný sortilín je lokalizovaný v kalcifikovaných oblastiach, sme ďalej hodnotili účinok karbamylácie sortilínu na vaskulárnu kalcifikáciu in vitro a ex vivo. Aby sme určili funkčnú relevanciu karbamylácie sortilínu, indukovali sme in vitro karbamyláciu rekombinantného sortilínu (SortCarb) močovinou a detegovali sme podobný vzor karbamyl-lyzínových zvyškov, aký sa detegoval u ľudí in vivo (doplnkový obrázok S4A a doplnková tabuľka S4). In vitro karbamylácia nezmenila integritu proteínu SortCarb v porovnaní s kontrolnou falošnou modifikáciou (SortCo), ako bolo hodnotené gélovou elektroforézou a Western blotom (doplnkový obrázok S4B a C). Ani SortCo, ani SortCarb nevykazovali cytotoxické účinky na hSMC (doplnkový obrázok S5A). SortCo a SortCarb boli rovnako prijaté hSMC (doplnkový obrázok S5B). Pri kalcifikácii hSMC SortCarb indukoval proosteogénne transkripty ALPL (þ56 percent; P ¼ 0.039) a RUNX2 Q23 (þ25 percent; P ¼ 0,014; obrázok 2a a b ), ako aj tkanivovo nešpecifická aktivita alkalickej fosfatázy (þ46 percent; P ¼ 0,007; obrázok 2c), v porovnaní so SortCo. Na funkčnej úrovni SortCarb významne zvýšil kalcifikáciu matrice (obrázok 2d a e). Nakoniec, v modeli orgánovej kultúry ex vivo, SortCarb zvýšil kalcifikáciu v kruhoch aorty potkanov (obrázok 2f a g).

prínos Cistanche: liečba ochorení obličiek

Ak chcete pokračovať, kliknitetupre časť 2.