Časť 1: Účinok akteozidu ako bunkového ochrancu na produkciu klonovaného psa

Ji Hye Lee1☯, Ju Lan Chun1☯, Keun Jung Kim1, Eun Young Kim1, Dong-hee Kim1, Bo Myeong Lee1, Kil Woo Han1, Kang-Sun Park1, Kyung-Bon Lee2, Min Kyu Kim1*

1 Division of Animal & Dairy Science, College of Agriculture and Life Science, Chungnam National University, Daejeon, Kórejská republika,

2 Katedra pedagogiky biológie, Vysoká škola pedagogická,Národná univerzita Chonnam, Gwangju, Kórejská republika

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

Pls kliknite sem pre časť 2

Abstraktné

Prenos jadra somatických buniek (SCNT) je dobre známa laboratórna technika. Princíp SCNT zahŕňa preprogramovanie somatického jadra injekciou somatickej bunky do oocytu príjemcu, ktorého jadro bolo odstránené. Preto sa bunky darcov jadra považujú za rozhodujúci faktor v SCNT. Synchronizácia bunkového cyklu buniek darcu jadra v štádiu G0/G1 môže byť vyvolaná kontaktnou inhibíciou alebo hladovaním v sére. V tejto štúdii,akteozid, fenylpropanoidová glykozidová zlúčenina, bola skúmaná s cieľom určiť, či je použiteľná na vyvolanie synchronizácie bunkového cyklu, cytoprotekcie a zlepšenia účinnosti SCNT vo fibroblastoch psieho plodu. Boli ošetrené primárne psie fetálne fibroblastyakteozid(10, 30, 50 μM) na rôzne časové obdobia (24, 48 a 72 hodín). Synchronizácia bunkového cyklu v štádiu G0/G1 sa významne nelíšila od spôsobu indukcie:akteozidliečbu, kontaktnú inhibíciu alebo hladovanie v sére. Avšak z týchto troch ošetrení malo sérové ​​hladovanie za následok významne zvýšenú hladinu reaktívnych foriem kyslíka (ROS) (99,5 ± 0,3 percent) a apoptózu. Odhalili to aj výsledkyakteozidznížené procesy ROS a apoptózy vrátane nekrózy vo fetálnych fibroblastoch psov a zlepšenie prežitia buniek. Psie fetálne fibroblasty ošetrenéakteozidboli úspešne zatknutí v štádiu G0/G1. Okrem toho rekonštruované embryá s použitím buniek darcu jadra ošetrených akteozidom produkovali zdravého klonovaného psa, ale nie embryá produkované pomocou buniek darcu jadra podrobených kontaktnej inhibícii. Na záver,akteozidindukovaná synchronizácia bunkového cyklu buniek darcu jadra by bola alternatívnou metódou na zlepšenie účinnosti psieho SCNT kvôli jeho cytoprotektívnym účinkom.

Akteozid Cistanche môže posilniť imunitu

Úvod

Technika SCNT sa používa na produkciu geneticky lepších alebo manipulovaných zvierat na poľnohospodárske účely a ako biomedicínske zdroje. S rastúcou potrebou zvieracích modelov chorôb, záchrany zvierat ohrozených vyhynutím, kmeňových buniek pre regeneratívnu medicínu, transplantácie orgánov atď. sa v poslednom čase zvyšuje záujem o klonovanie zvierat pomocou SCNT [1–5]. Aj keď bola produkcia klonovaných zvierat úspešná, účinnosť SCNT je stále veľmi nízka [6]. Medzi príčiny nízkej vývojovej kompetencie embrya SCNT patrí mnoho faktorov, ktoré súvisia s kvalitou oocytov príjemcu, kvalitou buniek darcu jadra a stavom náhradnej matky [7–10].

Je známe, že reaktívne formy kyslíka (ROS) a apoptóza sa podieľajú na ženských reprodukčných procesoch vrátane vývoja oocytov in vivo a in vitro [11–14]. ROS prerušujú vývoj embryí indukciou cytoplazmatickej kondenzácie, poškodenia DNA a apoptózy v embryách. Podporné štúdie uvádzajú, že zníženie ROS zlepšuje kompetenciu vývoja embryí SCNT počas kultivácie in vitro [15–17]. Apoptóza je fyziologický proces, ku ktorému dochádza spontánne počas normálneho preimplantačného vývoja embrya, aby sa udržala bunková homeostáza odstránením poškodených/zle fungujúcich buniek DNA. ROS spôsobuje fragmentáciu DNA a zvyšuje apoptotické blastoméry, ktoré narúšajú vývoj embrya. Udalosť ROS a apoptózy sa pozoruje častejšie po SCNT ako po in vitro fertilizácii [18, 19]. Mnohé štúdie uvádzajú, že kompetencia vývoja embryí SCNT je zachránená znížením hladín ROS a apoptózy použitím antioxidantov, ako je selén [20], inzulín-transferín-selén [17, 21], melatonín [22] a glutatión [23].

Predchádzajúce štúdie uvádzali, že použitie darcovských buniek zadržaných v štádiu G{{0}}}/G1 zlepšilo účinnosť SCNT [7, 9, 24–28]. Chromatín v darcovských bunkách v štádiu G0/G1 sa považuje za najúčinnejší pre kompetenciu vývoja embryí SCNT. Na synchronizáciu bunkového cyklu darcu sa často používa kontaktná inhibícia, hladovanie v sére a chemické ošetrenie [7, 25, 29, 30]. Sérové ​​hladovanie však znížilo prežitie buniek a zvýšilo fragmentáciu DNA, čo vedie k apoptóze [31]. Chemická inhibícia je ďalšou stratégiou na zastavenie bunkového cyklu v štádiu G0/G1 pomocou inhibítorov, ako je roskovitín [29, 32], dimetylsulfoxid (DMSO) [33] a cykloheximid (CHX) [34]. Účinnosť metódy použitej na synchronizáciu je ovplyvnená typmi a druhmi darcovských buniek. Pre optimálnu synchronizáciu darcovských buniek je potrebné starostlivo vyhodnotiť rôzne aspekty použitých metód.

akteozid(tiež známy ako verbaskozid) [{{0}}(3, 4-dihydroxyfenyletyl)-1-OaL-ramnopyranozyl-(1/3)-bD-({{13} }O-kafeoyl)-glukopyranozid] sa izoluje z fialových kvetov Syringa vulgaris. Je známe, že rastliny obsahujúce akteozid majú antimikrobiálne a antifungálne účinky [35–37] a zabraňujú zápalu. Akteozid skutočne vykazuje rôzne biologické aktivity in vitro a in vivo, ako je antioxidačná aktivita, antiapoptotická aktivita, cytotoxicita proti rôznym nádorovým bunkám a synchronizácia bunkového cyklu v štádiu G0}/G1 ako cyklín-dependentný inhibítor kinázy (CDK) [38]. Napríklad Lee a kol.[38] uviedli, že liečba akteozidmi môže inhibovať proliferáciu ľudských promyelocytových HL-60 leukemických buniek indukciou zastavenia bunkového cyklu v štádiu G0/G1. Účinok darcovských buniek ošetrených akteozidmi na účinnosť psieho SCNT sa však ešte musí študovať.

V tejto štúdii účinkyakteozidna synchronizáciu bunkového cyklu, ROS aapoptózana psie fetálne fibroblasty. Analýza synchronizácie bunkového cyklu, ROS a apoptózy sa uskutočnila pomocou fluorescenčne aktivovaného triedenia buniek (FACS). Na preukázanie účinnosti darcovských buniek ošetrených akteozidom sa embryá SCNT kultivovali a preniesli do prijímajúceho psa a úspešne vyprodukovali zdravého klonovaného psa.

cistanchemôže liečiťobličkyochorenie zlepšiťobličkovéfunkciu

Materiály a metódy

Etické vyhlásenie

V tejto štúdii sa použilo 44 samíc zmiešaných psov (vo veku 1–6 rokov) ako darcovia oocytov a náhrady za prenos embryí a samica bígla (vo veku 2 roky) sa použila na vytvorenie fetálnych fibroblastových bunkových línií. Všetky pokusy na zvieratách boli schválené Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť a používanie zvierat (IACUC) Národnej univerzity v Chungname (číslo schválenia: CNU-00487) a boli vykonané podľa „Príručky pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat“ publikovanej IACUC z Chungnamskej národnej univerzity. Psy boli chované vo vnútri v oddelených klietkach so systémom riadenia teploty a ventilácie. Psy boli kŕmené komerčnou stravou raz denne a voda im bola poskytovaná ad libitum. Vo všetkých pokusoch na zvieratách boli psy na začiatku anestetizované 6 mg/kg ketamínu a xylazínu a udržiavané v stave anestézie 2 percentami izofluránu. Na konci operácie boli podané antibiotiká (prokaín penicilín G, benzatín penicilín G a dihydrostreptomycín sulfát), aby sa zabránilo akejkoľvek infekcii. Po chirurgickom zákroku boli psy premiestnené do ich vlastných individuálnych klietok so sladkou vodou, monitorované a bola im poskytnutá špeciálna starostlivosť zo strany zodpovedného veterinára, aby bolo možné vykonať potrebné ošetrenie, ak to zvieratá potrebovali.

Chemikálie

Všetky chemikálie boli zakúpené od Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA), pokiaľ nie je uvedené inak. Akteozid bol získaný od Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd. v Číne.

Izolácia psích fetálnych fibroblastov

Psie fetálne fibroblasty boli získané z {{0}}dňových plodov. Stručne povedané, samica bígla bola umelo inseminovaná spermiami samca bígla. Po 28 dňoch bola potvrdená gravidita u samice bígla a celiohysterektómiou bolo získaných 5 plodov. Plody sa trikrát premyli vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom (PBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, USA). Hlava, vnútorné orgány a končatiny plodov boli odstránené chirurgickou čepeľou a zvyšné časti tela boli rozomleté ​​v PBS. Kúsky plodov sa dvakrát premyli centrifugáciou pri 400 x počas 5 minút a kultivovali sa v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu (DMEM; Gibco) doplnenom 1 percentom penicilín-streptomycínu (produkt č. P4458) a 20 percentami fetálneho bovinného séra (FBS; Gibco) pri 39 stupňoch vo vlhkej atmosfére s 5 percentami CO2 a 95 percentami vzduchu. Keď bunky dosiahli konfluenciu po 5 až 7 dňoch, boli ošetrené 0, 25 percentami trypsín-EDTA (Gibco) počas 2 minút a zozbierané. Z dvoch individuálnych plodov sa vytvorili dve psie fetálne fibroblastové bunkové línie. Bunky boli zmrazené v 10 percentnom DMSO v FBS a skladované v tekutom dusíku pri -196 stupňoch, kým sa nepoužili.

Liečba buniek

Zmrazené psie fibroblasty sa rozmrazili a kultivovali až do 8{10} percent konfluencie. Bunky boli zozbierané a pasážované 4 až 7-krát pre nasledujúce experimenty. Bunky sa naočkovali v koncentrácii 106/ml do 60 mm kultivačných misiek. Bunky boli kultivované v (1) DMEM doplnenom 10 percentami FBS a 1 percentom penicilín-streptomycínu počas piatich dní (kontaktná inhibícia), (2) DMEM doplnenom 0,5 percentami FBS a 1 percentom penicilín-streptomycínu päť dní (hladovanie v sére) alebo (3) DMEM doplnený 10 percentami FBS a 1 percentami penicilín-streptomycínu obsahujúcim akteozid v koncentrácii 10 uM, 30 uM alebo 50 uM počas 24 hodín, 48 hodín a 72 hodín (liečba akteozidmi).

Analýza bunkového cyklu prietokovou cytometriou

Na analýzu štádií bunkového cyklu sa bunky zozbierali s použitím {{0}},25 % trypsínu-EDTA a premyli sa 3-krát PBS centrifugáciou. Po poslednom premytí sa supernatanty odstránili a bunky sa resuspendovali v 0,3 ml PBS. Na fixáciu sa k bunkovej suspenzii po kvapkách pridalo {{10}},7 ml studeného absolútneho etanolu, premiešalo sa jemným vortexovaním a skladovalo sa cez noc pri 4 stupňoch. Fixované bunky sa odstredili a dvakrát premyli studeným PBS. Bunky sa resuspendovali v 0,25 ml PBS doplnenom 5 ul 10 mg/ml RNázy a inkubovali sa 1 hodinu pri 37 stupňoch. Potom sa pridalo 10 ul 1 mg/ml propídiumjodidu (PI). Bunkový cyklus sa analyzoval kvantifikáciou obsahu DNA v bunkových populáciách vo fázach G0/G1 (2n), S (medzi 2n a 4n) a G2/M (4n) pomocou prietokového cytometra FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA , USA).

Detekcia ROS prietokovou cytometriou

ROS v živých bunkách bola hodnotená pomocou Image-iT™ Live Green Reactive Oxygen Species Detection Kit (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). V stručnosti, bunky sa po odstránení kultivačného média premyli v PBS a pridali sa 2 ml 100 uM pracovného roztoku terc-butylhydroperoxidu (TBHP). Po inkubácii pri 37 stupňoch počas 1 hodiny sa pracovný roztok TBHP odstránil a bunky sa jemne premyli 3-krát v teplom Dulbeccovom fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom (DPBS; Gibco). Bunky sa potom inkubovali v 25 μM 5-(a{10}})-karboxy-2,7-dichlórdihydro-fluoresceín diacetátu (karboxy-H2DCFDA) pracovnom roztoku pri 37 stupňoch počas 30 minút v tme . Keď je oxidovaný, karboxy-H2DCFDA vyžaruje zelenú fluorescenciu, čo uľahčuje hodnotenie ROS prietokovou cytometriou. Ako pozitívna kontrola sa použil TBHP, ktorý je induktorom produkcie ROS. Jadrá buniek boli zafarbené pomocou Hoechst 33342. Po 3-násobnom premytí PBS boli bunky zozbierané trypsinizáciou, suspendované v PBS a použité na detekciu ROS pomocou prietokového cytometra FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA ). Rýchlosť tvorby ROS sa vypočítala vydelením počtu ROS pozitívnych buniek celkovým počtom buniek a prevedením hodnôt na percentá.

Analýza apoptózy prietokovou cytometriou

Analýza apoptózy sa uskutočnila pomocou súpravy Vybran1 Apoptosis Assay Kit #2 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). V stručnosti, bunky boli zozbierané trypsinizáciou a premyté 2-krát studeným PBS. Potom sa k bunkám pridalo 100 ul 1 x tlmivého roztoku viažuceho anexín, 5 ul Alexa Fluor 488 anexínu V a 1 ul PI. Po inkubácii počas 15 minút pri teplote miestnosti sa pridalo 400 ul 1 x tlmivého roztoku viažuceho anexín a bunková suspenzia sa jemne premiešala. Annexin V, čo je Ca2 plus-dependentný proteín viažuci fosfolipidy, má vysokú afinitu k fosfatidylserínu (PS). V živých bunkách sa PS nachádza na vnútornej cytoplazmatickej membráne a translokuje sa na vonkajšiu cytoplazmatickú membránu v apoptotických bunkách. Apoptotické bunky sa vyznačujú Annexínom V značeným Alexa Fluor 488 viažucim sa na PS na vonkajšej membráne. Okrem toho PI, čo je farbivo viažuce nukleovú kyselinu, farbí nekrotické bunky červenou fluorescenciou. Preto sa apoptotické bunky so zelenou fluorescenciou, nekrotické bunky s červenou fluorescenciou a živé bunky s malou alebo žiadnou fluorescenciou v bunkách analyzovali pomocou prietokového cytometra FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Rýchlosti sa vypočítali vydelením počtu buniek živých, nekrotických alebo apoptotických buniek celkovým počtom buniek a prevedením vypočítaných hodnôt na percentá.

Odber in vivo zrelých oocytov

Na detekciu ovulácie u každého psa sa merala koncentrácia progesterónu (P4) v sére pomocou súpravy DSL-3900ACTIVE progesterone Coated-tube Radioimmunoassay Kit (Diagnostic Systems Laboratories, Inc., TX, USA). Ako už bolo opísané [39, 40], deň, keď koncentrácia P4 prekročila 4 ng/ml, sa považoval za deň ovulácie. 72 hodín po ovulácii boli oocyty získané laparotómiou s použitím aseptických chirurgických postupov. Fimbria vajcovodu sa priblížila cez bursálnu štrbinu a kanylovala sa s použitím oceľovej ihly s obrátenou prírubou (18 gauge, 7,5 cm). 24 gauge intravenózny (IV) katéter (Angiocath™ Plus, Becton Dickison Korea Inc., Soul, Kórea) bol vložený do isthmu vajcovodu blízko uterotubálneho spojenia a médium 199 (Gibco) doplnené 1 percentom penicilínu-streptomycínu a 5 % FBS sa zaviedlo do vajcovodu cez IV katéter. Oocyty boli okamžite prevezené do laboratória. Celkovo bolo odobraných 316 oocytov od 31 psov.

Transfer jadra somatických buniek a prenos embryí SCNT sa uskutočnili tak, ako už bolo opísané [39]. V stručnosti, na odstránenie buniek cumulus z in vivo zrelých oocytov sa komplexy cumulus-oocyte (COC) opakovane pipetovali v 0,1% hyaluronidáze. Prvé polárne telo a chromozómy metafázy II boli odstránené aspiráciou. Enukleácia bola potvrdená farbením s Hoechst 33342 (bisbenzimid). Psie fetálne fibroblasty boli ošetrené 30 μM akteozidom počas 48 hodín a potom zozbierané 0,25% trypsínom-EDTA. Jedna bunka, ktorá má hladkú bunkovú membránu, bola prenesená do perivitelínového priestoru každého enukleovaného oocytu. Dvojčatá boli ekvilibrované infúzne médium, ktorým je 0,26 M manitolové médium obsahujúce 0,1 mM HEPES, 0,5 mM MgS04 a 0,05 percent BSA, a fúzované dvoma impulzmi jednosmerného prúdu (69–75 V počas 15 μs) z prístroja Electro-Cell Fusion (NEPA gene Co., Chiba, Japonsko). Tieto páry sa inkubovali v médiu 199 doplnenom 10 percentami FBS počas 1 hodiny 30 minút. Fúzované embryá SCNT boli skontrolované a chemická aktivácia bola indukovaná ich inkubáciou v 10 μM vápenatom ionofore (produkt č. C7522, Sigma) počas 4 minút. Embryá SCNT boli premyté a potom umiestnené do modifikovaného syntetického vajcovodného tekutého média (mSOF) [41] obsahujúceho 1,9 mM 6-dimetylaminopurínu (6-DMAP) na 3 h 30 min. Upravené embryá boli chirurgicky prenesené do vajcovodov náhradných zvierat synchronizovaných s estrusom do 4 hodín po SCNT. Tehotenstvo bolo potvrdené ultrasonografiou 26. deň (najskôr) po prenose embrya.

aktívna ingredienciaakteozidvcistanche

In vitro kultúra klonovaných embryí

Po SCNT boli klonované embryá kultivované v 40 μl mikrokvapkách modifikovaného syntetického vajcovodného tekutého média (mSOF) (10 klonovaných embryí na mikrokvapku) prekryté minerálnym olejom pri 38,5 stupňoch v 5 percentách CO2 a 95 percentách vzduchu. Vývoj embryí SCNT sa pozoroval od 2. do 8. dňa.

Mikrosatelitná a mitochondriálna analýza DNA klonovaného psa

Celková DNA bola extrahovaná z jadrových darcovských buniek a kože psov darcov oocytov, náhradných psov a klonovaných psov pomocou súpravy na extrakciu genómovej DNA G-spin™ (iNtRON BIOTECHNOLOGY, Seongnam, Kórea) podľa pokynov výrobcu, a potom sa eluoval v 10}0 ul TE pufra (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0). Množstvo DNA sa meralo BioSpec-nano spektrofotometrom (Shimadzu Corp., Japonsko).

Na genotypizáciu mikrosatelitov sa vybralo nasledujúcich 7 špecifických génov: PEZ1, PEZ3, PEZ8, PEZ12, FH2010, FH2054 a FH2079. PCR sa uskutočnilo s počiatočnou denaturáciou počas 10 minút pri 95 stupňoch, 20 cyklov pozostávajúcich z denaturácie počas 30 sekúnd pri 95 stupňoch, 30 sekúnd žíhania pri 58 stupňoch (-0.1 stupeň/cyklus), 1 min predĺženia pri 72 stupňov a 15 ďalších cyklov zahŕňajúcich denaturáciu počas 30 sekúnd pri 95 stupňoch, 30 sekúnd žíhania pri 56 stupňoch, 1 minútu predĺženia pri 72 stupňoch a konečné predĺženie pri 72 stupňoch počas 10 minút.

Na sekvenovanie mitochondriálnej DNA, s použitím kompletných nukleotidových sekvencií psej mtDNA (prírastkové číslo GenBank: U96639), boli syntetizované nasledujúce oligonukleotidové priméry: Cytochróm b oblasť (L14,252 –L14,631) F: ACTCATTCATTGACCTCCCAGCGGATATAGGCCTG; AGATAGGAGTT; Cytochróm c oxidáza podjednotka II (L7,0}54-L7,465) F: ATGGCGTACCCATTTCAACT,R: GGATGGTTATTTCTATTGG; 16S rRNA (L2,033 –L2,472) F: GCAAAGGTAGCATAATCAT,R: AGGACTTTAATCGTTGAAC; Oblasť D-slučky (L15,622 – L16,030) F: CATAGGACATATTAACTCAATC,R: AAGTCCAGCTACAAGTTATTTG [42]. Cykly PCR pre túto analýzu zahŕňali: 95 stupňovú počiatočnú denaturáciu počas 5 minút, 5 cyklov denaturácie počas 30 sekúnd pri 95 stupňoch, 40 sekúnd žíhania pri 60 stupňoch (-1 stupeň/cyklus), 1 minútu predĺženia pri 72 stupňov a ďalších 30 cyklov denaturácie počas 30 sekúnd pri 95 stupňoch, 40 sekúnd žíhania pri 55 stupňoch, 1 minúta predlžovania pri 72 stupňoch a konečné predlžovanie pri 72 stupňoch 10 minút. Fragmenty PCR z rôznych experimentov sa analyzovali pomocou genetického analyzátora ABI Prism 3100 (Applied Biosystems Inc., USA). Zostavenie sekvencií, viacnásobné zarovnania a orezanie zarovnania pre kontrolné oblasti sa uskutočnili pomocou softvéru BioEdit (v.7.0.5.3).

akteozidvcistanchemôže posilniť imunitný systém