pre viac informácií:{0}}

Pls kliknite sem pre časť 2

Yasaman Alaghbanda,b,c, Janine L. Kwapisa,b,d, Alberto J. Lópeza,b,c, André O. Whitea,b,c,3, Osasumwen V. Aimiuwua,b,c,1, Amni Al- Kachaka,b,c,2, Kasuni K. Bodinayakea,b,c,

Nicole C. Oparaugoa,b,c, Richard Danga,b,d, Mariam Astarabadia,b,c,4, Dina P. Matheosa,b, a Marcelo A. Wooda,b,c,d

a301 Qureshey Research Lab, Oddelenie neurobiológie a správania, Centrum pre

Neurobiológia učenia aPamäť, University of California, Irvine, Irvine, California, 92697 centier pre neurobiológiu učenia aPamäť(CNLM), Irvine, Kalifornia, 92697 c

Irvine Center for Addiction Neuroscience (ICAN), University of California, Irvine, California, 92697d Inštitút prePamäťPoruchy a neurologické poruchy, Kalifornská univerzita, Irvine,

Kliknite naVýhody a vedľajšie účinky Cistanche tubulosa na zlepšenie pamäti

Abstraktné

Históndeacetylázy (HDAC) sú enzýmy modifikujúce chromatín, ktoré sa považujú za silné negatívne regulátoryPamäťprocesy. Ukázalo sa, že HDAC3 hrá kľúčovú úlohu v dlhodobej pamäti na umiestnenie objektu, ako aj na vyhynutie kokaínom.Pamäť, ale nie je jasné, či táto funkcia závisí od deacetylázovej domény HDAC3. Tu sme testovali, či má deacetylázová doména HDAC3 úlohu v umiestnení objektuPamäťvzniku, ako aj vzniku a zániku spomienok spojených s kokaínom. Použitím mutantu HDAC3 v mŕtvom bode deacetylázy sme zistili, že selektívne blokovanie aktivity deacetylázy HDAC3 v dorzálnom hipokampe zlepšilo dlhodobú pamäť na umiestnenie objektu, ale nemalo žiadny vplyv na tvorbu pamäte spojenej s kokaínom. Keď bol tento rovnaký bodový mutantný vírus HDAC3 infúzne podaný do prelimbickej kôry, neovplyvnil súvisiace s kokaínomPamäťtvorenie. Čo sa týka extinkcie, poškodenie HDAC3 deacetylázovej domény v infralimbickej kôre nemalo žiadny vplyv na extinkciu, ale bol pozorovaný uľahčený extinkčný efekt, keď bol bodový mutantný vírus dodaný do dorzálneho hipokampu. Tieto výsledky naznačujú, že deacetylázová doména HDAC3 hrá selektívnu úlohu v špecifických oblastiach mozgu, ktoré sú dlhodobo základomPamäťvytváranie polohy objektu, ako aj súvisiace s kokaínomPamäťvznik a zánik.

Kľúčové slová

dlhodobá pamäť; epigenetika; chromatín; umiestnenie objektu; podmienená preferencia miesta; dorzálny hipokampus

Úvod

Acetylácia histónov je dobre preštudovaný mechanizmus modifikujúci chromatín, ktorý sa podieľa na regulácii génovej expresie potrebnej naPamäť. Početné štúdie ukázali, že acetylácia histónov sa podieľa na dlhodobom horizontePamäťformácia (pozri napríklad Levenson a Sweatt, 2006; McQuown a Wood, 2011; Gräffand Tsai, 2013; Peixoto a Abel, 2013; Penney a Tsai 2014). Acetyláciu histónu vykonávajú histónacetyltransferázy a históndeacetylázy (HDAC), ktoré vo všeobecnosti uľahčujú a potláčajú génovú expresiu (Jenuwein a Allis 2001; Kouzarides, 2007). Histónová deacetyláza 3 (HDAC3) je najviac exprimovaný HDAC triedy I v mozgu a tento špecifický HDAC je silným negatívnym regulátorom procesov učenia a pamäte (Kwapis a kol., 2017; Malvaez a kol., 2013; McQuown a kol. ., 2011; Rogge a kol., 2013). Naše laboratórium ukázalo, že HDAC3 hrá rozhodujúcu úlohu pri umiestňovaní objektov a formovaní pamäte súvisiacej so strachom (McQuown a kol., 2011; Kwapis a kol., 2017) pomocou manipulácií HDAC3 špecifických pre hippocampus a amygdalu. Ukázali sme tiež, že inhibícia HDAC3 uľahčuje zánik správania pri hľadaní drog spôsobom, ktorý blokuje obnovenie (Malvaez et al., 2013). Experimenty s extinkciou v Malvaez et al (2013) použili selektívny inhibítor HDAC3 podávaný systémovo, takže sme neboli schopní identifikovať, ktoré oblasti mozgu sú najdôležitejšie pre moduláciu extinkcie závislú od HDAC3-.

Samotný HDAC3 má silnú deacetylázovú aktivitu (Guenther a kol., 2002; Lahm a kol., 2007; Zhang a kol., 2002) a spája sa s HDAC4/HDAC5 prostredníctvom interakcií s korepresorom korepresora jadrového receptora (NCoR). tvoria funkčný, multiproteínový represorový komplex (Guenther a kol., 2001; Fischle a kol., 2002; Alenghat a kol., 2008). Jednou myšlienkou je, že tieto multiproteínové komplexy môžu byť potrebné na deacetyláciu, pretože HDAC4 má malú alebo žiadnu katalytickú aktivitu na kanonických acetyl-lyzínových substrátoch (Lahm et al., 2007). Ukázalo sa, že HDAC4 modulujePamäťnezávisle od jeho deacetylázovej domény (Sando et al., 2012). Mimo oblasti učenia aPamäť, expresia génu sprostredkovaná HDAC3- v iných tkanivách nevyhnutne nevyžaduje enzymatickú funkciu HDAC3 (Sun et al., 2013), čo naznačuje, že deacetylázová aktivita HDAC3 možno nemusí byť potrebná na tvorbu pamäte. Až donedávna nebola deacetylázová aktivita HDAC3 pri tvorbe pamäte priamo testovaná. Kwapis a kolegovia (2017) preukázali, že enzymatická aktivita HDAC3 je skutočne potrebná pre formy závislé od amygdaly.Pamäťtvorenie.

Predchádzajúce štúdie ukázali, že systémové podávanie inhibítora HDAC3 by mohlo uľahčiť tvorbu umiestnenia objektuPamäť(OLM), ako aj vymieranie súvisiaceho s kokaínomPamäť(Malvaez et al., 2013). Avšak, či je deacetylázová aktivita HDAC3 potrebná na umiestnenie objektuPamäťOLM v hipokampe a zánik pamäte súvisiacej s kokaínom v infralimbickej kôre zostáva nejasný. V súčasnej štúdii sme sa špecificky zamerali na deacetylázovú aktivitu HDAC3 pri tvorbe pamäte závislej od hipokampu, ako aj v dorzálnom hipokampe (DH), prelimbickej kôre (PrL) a infralimbickej kôre (IL) s ohľadom na získanie a zánik preferencia miesta podmieneného kokaínom alebo súvisiaci kontext s kokaínomPamäťprocesy.

Materiály a metódy

Predmety

Všetky postupy boli schválené Kalifornskou univerzitou, Irvinovým výborom pre inštitucionálnu starostlivosť o zvieratá a použitie a boli v súlade s usmerneniami Národného inštitútu zdravia. Myši boli vo veku 8 až 12 týždňov a mali prístup k potrave a vode ad libitum vo svojich domácich klietkach so svetlami udržiavanými v 12-hodinovom cykle svetlo/tma. Behaviorálne testovanie sa uskutočnilo počas ľahkej časti cyklu. Subjektmi boli dospelí samci myší C57BL/6J pre experimenty AAV-HDAC3(Y298H)-v5. Pre experiment s deléciou HDAC3 flox boli myši Hdac3flox/flox a divokého typu Hdac3 plus / plus myši z rovnakého vrhu udržiavané na pozadí C57BL/6J (Mullican et al., 2011). Stručne povedané, tieto myši boli vytvorené v laboratóriu Dr. Mitcha Lazara na University of Pennsylvania (Philadelphia, PA) s miestami loxP lemujúcimi exón 4 až exón 7 génu Hdac3, čo je oblasť potrebná pre katalytickú aktivitu enzýmu (Mullican et al., 2011).

Drogy

Kokaín-HCl bol zakúpený od Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) a rozpustený vo fyziologickom roztoku (0,9 percent NaCl). Kokaín-HCl je vyjadrený ako hmotnosť soli. Na tréning kokaín-CPP v akvizičných experimentoch sa kokaín-HCl rozpustil na konečnú koncentráciu 0,5 mg/ml a podal sa v objeme 10 ml/kg telesnej hmotnosti, čo viedlo ku konečnej dávke 5 mg/kg. Pre tréning kokaín-CPP v extinkčnom experimente bol kokaín-HCl rozpustený na konečnú koncentráciu 2 mg/ml a podávaný v objeme 10 ml/kg telesnej hmotnosti, výsledkom čoho bola konečná dávka 20 mg/kg. Kokaín-HCl a fyziologický roztok sa podávali intraperitoneálne (ip).

Chirurgia

Myšiam boli indukované 4 percentá izofluranu v kyslíku a udržiavané na 1,5 – 2.0 percentách počas trvania operácie. Zvieratám sa injekčne podali buď AAV-HDAC3(Y298H)-v5 alebo AAV-EV (prázdny vektor) (Kwapis et al., 20}17). Pre DH experimenty sa obojstranne infundoval 1 ul vírusu. Pre prelimbické a infralimbické experimenty bolo obojstranne infúziou 0.3 ul vírusu. Na potvrdenie expresie HDAC3(Y298H) sa použila imunofluorescencia. Injekčné ihly sa spúšťali na požadované súradnice rýchlosťou 0,2 mm/15 s. {{20}}min po dosiahnutí cieľovej hĺbky bol vírus injikovaný rýchlosťou 6 µl/h. Po infúzii boli injekčné ihly ponechané na mieste 2- min, aby sa umožnila difúzia vírusu. Injektory sa potom zdvihli o 0 0,1 mm a nechali sa sedieť ďalšiu minútu a potom sa pomaly vybrali (0 0,1 mm/15 s). Incízia bola zošitá a 2 týždne boli ponechané na úplnú expresiu vírusu pred správaním. Vírusy boli infúzne podané duálnymi infúznymi prístrojmi s veľkosťou 28 (DH: 3 mm od stredu k stredu; PrL/IL: 0,8 mm od stredu k stredu) pripojených k PE50 hadičkám a pripojeným k Hamiltonovým striekačkám namontované na infúznych pumpách. Súradnice pre DH boli: AP, -2,0 mm; ML, ± 1,5 mm; DV, -1,5 mm vzhľadom na Bregma. Súradnice pre PrL boli: AP plus 1,9 mm; ML, ± 0,4 mm; DV, -2,2 mm vzhľadom na Bregma. Súradnice pre IL boli: AP plus 1,5; ML, ± 0,4 mm; DV, -3,2 mm vzhľadom na Bregma.

Výroba AAV

HDAC3 divokého typu sa amplifikoval z myšacej hipokampálnej cDNA a klonoval sa do modifikovaného pAAV-IRES-hrGFP (Agilent), pod kontrolou CMV promótora a -globínového intrónu. Na vytvorenie bodovej mutácie bola vytvorená jednonukleotidová substitúcia v exóne 11 na priamu produkciu histidínového zvyšku namiesto tyrozínu v aminokyseline 298 (plazmid MW92). Pre kontrolu s prázdnym vektorom nebola prítomná kódujúca sekvencia HDAC3, ale všetky ostatné prvky zostali (plazmid MW87). Adeno-asociovaný vírus (AAV) bol vyrobený Penn Vector Core (University of Pennsylvania) z vyššie opísaných plazmidov a bol sérotypovaný pomocou AAV 2.1. Konečný titer AAV-HDAC3 (Y298H) bol 6,48 x 1012 GC/ml a konečný titer AAV-EV bol 1,35 x 1013 GC/ml.

Imunofluorescencia

V behaviorálnych experimentoch znázornených na obrázkoch 2–7 malo každé zviera zahrnuté do analýz správania vírusovú infúziu potvrdenú imunohistochémiou. Myši boli usmrtené cervikálnou dislokáciou a ich mozgy boli vybraté a rýchlo zmrazené v ľadovo studenom izopentáne. 20 µm plátky boli zhromaždené v IL/PrL alebo DH, rozmrazené namontované na sklíčka a uložené pri -80 stupňoch až do použitia. Na imunofluorescenčnú analýzu boli sklíčka fixované 4 percentami paraformaldehydu počas 10 minúty a permeablizované v 0,01% Triton X-100 v 0,1M PBS počas 15 minút. Sklíčka sa potom blokovali 1 hodinu pri teplote miestnosti v 8 percentnom normálnom kozom sére (Jackson) a inkubovali sa cez noc pri 4 stupňoch v primárnej protilátke (protilátka HDAC3 klon Y415: 1:250; Abcam). Nasledujúci deň boli sklíčka inkubované počas 1 hodiny pri izbovej teplote s kozím anti-králičím Alexa 488 (1:1000 riedenie, Invitrogen) v tme, po čom nasledovala buď 15-minútová DAPI inkubácia (1: 10 000, Invitrogen; DH). Na experimenty, v ktorých sa použilo červené fluorescenčné nissl farbivo NeuroTrace (1:50 NeuroTrace 530/615; Life Technologies), sa sklíčka inkubovali 50 minút pri izbovej teplote a potom nasledovali dve premytia v 0,01 percentnom Tritone-X-100 pre 5 minút a potom dve premytia v PBS počas 5 minút. Sklíčka sa prekryli pomocou montážneho média VectaShield Antifade (Vector Laboratories).

Všetky obrázky boli získané pomocou skenera Olympus Scanner VS110 s 20× apochromatickým objektívom (numerická apertúra 0,75) so softvérom skenera VS110. Všetky liečené skupiny boli zastúpené na každom sklíčku a všetky obrázky na sklíčku boli zachytené s rovnakým expozičným časom. Intenzita imunoznačenia sa kvantifikovala pomocou ImageJ vzorkovaním optickej hustoty v bunkovej vrstve CA1 normalizovanej na pozadie.

Kvantitatívna RT-PCR

Kvantitatívna RT-PCR v reálnom čase sa uskutočnila na overenie expresie V5 a upregulácie expresie Hdac3mRNA divokého typu po infúzii AAV-HDAC3 (Y298H) (experiment 1), ako už bolo opísané (López et al., 2016; White et al., 2016). Pre experiment 1 boli 1 mm razidlá v DH odobraté z 500 um rezov v oblasti vírusovej expresie (alebo ekvivalentnej oblasti u EV myší), ako bolo potvrdené imunofluorescenciou. Všetko tkanivo sa skladovalo pri -80 stupňoch až do spracovania.

RNA bola izolovaná pomocou RNeasy Minikit (Qiagen) a cDNA bola vytvorená pomocou súpravy Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit (Roche Applied Science). Boli použité nasledujúce priméry odvodené z Roche Universal ProbeLibrary: Hdac3right primér, 5'- ttcaacgtgggtgatgactg-3'; Hdac3left primer, 5'- ttagctgtgttgctccttgc-3'; sonda, ctgctccc; Hdac3-v5right primer, 5'-tggagattctcgagggtaagc{12}}'; Hdac3-v5left primer, 5'- atgccacccgtagatctgg-3'; sonda, ctctcctc. Každá zo sond pre tieto cieľové gény bola konjugovaná s farbivom FAM. Glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza (Gapd) sa použila ako referenčný gén pre všetky testy RT-qPCR. Pre Gapd sme použili nasledujúce priméry: ľavý primér, 5'atggtgaaggtcggtgtga-3'; pravý základ, 5-aatctccactttgccactgc-3'; sonda, tggcggtattgg. Gapdprobe bola konjugovaná s LightCycler Yellow 555. Neprekrývajúce sa farbivá a zhášač na referenčnom géne umožňujú multiplexovanie v zariadeniach Roche LightCycle 480 II (Roche Applied Sciences). Všetky hodnoty boli normalizované na hladiny expresie Gapd. Analýza a štatistika sa uskutočnili pomocou vlastných algoritmov spoločnosti Roche a softvéru REST 2009 založeného na metóde Pfaffl (Pfaffl 2001; Pfaffl et al., 2002).

Úlohy OLM a ORM

Pre OLM a nové rozpoznávanie objektovPamäť(ORM), údaje o habituácii (vzdialenosť prejdená počas jednotlivých relácií zvyknutia), tréningové a testovacie videá boli zhromaždené pomocou softvéru na analýzu správania ANY-bludisko. Školenie a testovanie pre OLM a ORM sa uskutočnilo tak, ako bolo opísané vyššie (López a kol., 2016; McQuown a kol., 2011; Vogel-Ciernia a kol., 2013; Vogel-Ciernia a Wood, 2014). Pred tréningom sa s myšami manipulovalo 1–2 minúty počas 4 dní a boli zvyknuté na experimentálny prístroj 5 minút do komory OLM počas 6 po sebe nasledujúcich dní v neprítomnosti predmetov. Počas tréningového pokusu boli myši umiestnené do experimentálneho zariadenia s dvoma identickými predmetmi (OLM: kadičky s objemom 100 ml, priemer 2,5 cm, výška 4 cm; ORM: plechovky na korenie a sklenené svietniky) a nechali sa tieto predmety skúmať 3 minúty. , ktorá nevedie v krátkodobom ani dlhodobom horizontePamäť. Už sme predtým ukázali, že 3-minútové tréningové obdobie je nedostatočné na vytvorenie LTM testovaného po 24 hodinách (Haettig a kol., 2011, 2013; López a kol., 2016; McQuown a kol., 2011; Stefanko a kol., 2009) . O 24 hodín neskôr sa testovala retencia zvierat počas 5 minút. Pre OLM bola jedna kópia známeho objektu umiestnená na rovnaké miesto ako počas tréningového pokusu a jedna kópia známeho objektu bola umiestnená do stredu krabice. Pre ORM bola jedna kópia známeho objektu a nový objekt umiestnený na rovnaké miesto ako počas tréningového pokusu. Všetky tréningové a testovacie pokusy boli zaznamenané na video a ručne hodnotené jednotlivcami, ktorí boli slepí voči liečbe zvierat. Videá sa analyzovali na celkové skúmanie objektov okrem indexu diskriminácie (DI) [(čas strávený skúmaním nového cieľa strávený skúmaním známeho objektu)/(celkový čas skúmania oboch objektov) × 100 percent]. Všetky kombinácie a umiestnenia objektov boli použité vyváženým spôsobom, aby sa znížilo potenciálne skreslenie, ktoré možno pripísať preferencii konkrétnych miest alebo objektov.

Kondicionovaný prístroj s preferenciou miesta

Kondicionovanie preferencie miesta sa uskutočnilo tak, ako bolo opísané vyššie v našich štúdiách (Malvaez a kol., 2011; Rogge a kol., 2013; White a kol., 2016). Stručne povedané, s myšami sa manipulovalo 1 minútu každý deň počas 3 dní pred začiatkom experimentu (dni 1 až 3). Postup CPP pre všetky experimenty sa uskutočňoval s použitím nestranného, ​​vyváženého protokolu. Východiskové preferencie pre každý z experimentov boli hodnotené umiestnením zvierat do stredového oddelenia zariadenia na preferenciu miesta a umožnením voľného prístupu do všetkých oddelení na 15 minút (predtest; deň 4). Tréningová fáza začala jeden deň po predbežnom teste. Kondicionovanie sa uskutočňovalo počas nasledujúcich 4 dní so zatvorenými gilotínovými dverami, čím sa zvieratá obmedzili na jeden z dvoch vonkajších oddelení prístroja CPP na 30 minút (dni 5–8). Použil sa nezaujatý dizajn tak, že polovici zvierat bol podaný kokaín pred umiestnením do kockovaného oddelenia a polovica dostala kokaín pred umiestnením do bieleho oddelenia v tréningový deň 1 (CS plus). Nasledujúci deň bola liečba a kompartment obrátené pre každé zviera (tréningový deň 2), myšiam bol injikovaný fyziologický roztok pred umiestnením do alternatívneho kompartmentu (CS-). Injekcie boli zmenené pre nasledujúce kondicionačné sedenia. Pre akvizičné experimenty znázornené na obr. 3–5 dostali zvieratá celkovo dve 30-minútové párovanie s kokaínom v jednom oddelení a dve 30-minútové párovanie s fyziologickým roztokom v druhom. Štyridsaťosem hodín po poslednej kondicionačnej relácii sa preferencia (15 minút; po teste 1; deň 10) hodnotila u všetkých zvierat, ako je opísané vyššie, v stave bez liečiva. Pre extinkčné experimenty znázornené na obr. 6–7 sa zvieratá podrobili kondicionovaniu, po ktorom nasledovalo posttestové 1 48 hodiny po poslednom kondicionovaní, ako je opísané vyššie. Dva týždne po vírusovej infúzii do DH alebo IL sa zvieratá podrobili opakovaným preferenčným testom bez liekov denne (15 minút; post-testy 2–5; dni 25–28). Skóre CPP sa vypočítalo ako čas(y) strávený v kompartmentoch spárovaných s kokaínom (CS plus ) mínus fyziologickým roztokom spárovaných (CS-). Čas strávený v každom z veľkých vonkajších oddelení bol analyzovaný automatizovaným softvérom z videí MPEG pomocou softvéru EthoVision 3.1 (Noldus Technology; pozri Malvaez et al., 2011).

Štatistická analýza

Na všetky štatistické analýzy sa použil Graphpad Prism 7.02 (GraphPad Software).

Habituácia sa analyzovala pomocou obojsmernej ANOVA na porovnanie celkovej vzdialenosti prejdenej počas návykových relácií. Údaje z tréningu a testovania sa analyzovali pomocou Studentovho t-testu na porovnanie buď skúmania alebo DI medzi kontrolnými a testovanými zvieratami. Testovacie dáta boli tiež analyzované pomocou jednostranného t-testu porovnávajúceho DI hodnoty s nulou, aby sa určilo, či bola alebo nebola pozorovaná významná diskriminácia. Experimenty CPP sa analyzovali pomocou dvojcestnej analýzy rozptylu (ANOVAs), po ktorej nasledovali Bonferroniho posthocttesty s preferenčnými skóre (PS) pri testoch ako premenné v rámci subjektov a skupina/genotyp (prázdny vektor vs. bodový mutant Y298H; Hdac3 plus/plus vs. Hdac3flox/flox). Tento štatistický test sa použil na uskutočnenie špecifických porovnaní, keď boli pozorované významné interakcie a/alebo účinky hlavnej skupiny. Testovacie dáta sa tiež analyzovali pomocou jednostranného t-testu porovnávajúceho hodnoty PS s nulou, aby sa určilo, či bola alebo nebola pozorovaná významná preferencia. Pre extinkčné experimenty sa najprv uskutočnili Studentove t-testy, aby sa určilo, či zvieratá tvoria významnú preferenciu v post-teste 1 pred infúziou vírusu. Hodnoty RT-qPCR sa získali tak, ako je opísané vyššie. Rozdiely v hodnotách RT-qPCR boli hodnotené Studentovým t-testom. Pre všetky analýzy bola pre významnosť potrebná hodnota 0.05.