pre viac informácií:{0}}

Diskusia

Molekulárne základy tvorby engramov boli oblasťou veľkého záujmu. Tu využívame myšací model TRAP na objasnenie dynamiky dostupnosti chromatínu, 3-D genómovej architektúry a génovej expresie počas životnosti engramovej bunky. Najprv to priamo ukážemePamäťkódovanie má rozsiahly a dlhodobý vplyv na dostupnosť chromatínu. Akonáhle sa tento chromatínový stav ustanoví, následné udalosti ako naprPamäťZdá sa, že konsolidácia a pripomenutie majú malý vplyv na chromatínovú krajinu. Je možné, že zvolený časový bod na stiahnutie nemusí úplne zachytiť chromatínové udalosti reaktivovaných buniek a následné zmeny chromatínu môžu byť spojené sPamäťopätovná konsolidácia alebo zánik8. Dôležité je, že v súlade s predchádzajúcimi publikáciami12, 13,23 to naznačujú naše údajePamäťtvorba je do značnej miery fenoménom poháňaným zosilňovačom.

Pre pamäť kliknite na Cistanche UK

Po druhé, naša štúdia poskytuje prvú komplexnú krajinu architektúry 3D genómu počas rôznych fázPamäťformácie, pretože sme ukázali opätovnú lokalizáciu veľkých chromatínových segmentov a špecifické dynamické interakcie promótor-enhancer v týchto kompartmentoch, ktoré umožňujú jemné doladenie rôznych transkripčných programov. Okrem toho sme ukázali, že promótory down-regulovaných génov interagujú častejšie so zosilňovačmi, ktoré obsahujú transkripčné represory a naopak.

Nakoniec, naša práca poskytuje prvý dôkaz o funkčnej primárnej udalosti, ktorá sa vyznačuje počiatočným zvýšením dostupnosti zosilňovača počas kódovania bez očakávaných transkripčných zmien. Naša analýza odhalila, že pri reaktivácii engramové neuróny využívajú podskupinu interakcií denovopromótor-enhancer, kde sa primárne aktivované zosilňovače dostanú do kontaktu s ich príslušnými promótormi, aby up-regulovali gény zapojené do transportu mRNA a lokálnej translácie proteínov v synaptických kompartmentoch. Tieto zmeny zodpovedali očakávaným morfologickým a funkčným zmenám. Súhrnne sa zdá, že engramové bunky sú označené na epigenetickej úrovni a súhra medzi dostupnosťou chromatínu, 3D-genómovou architektúrou a interakciami promótor-enhancer opisuje dobre koordinovaný systém, ktorý vedie k oneskorenému transkripčnému nárastu počas reaktivácie engramu.

Ako každá práca, aj štúdia mala niekoľko obmedzení. Použitie myší TRAP závislých od tamoxifénu umožňuje dočasné rozlíšenie, ale otvára okno označovania približne 12 hodín, čo môže viesť k nešpecifickému označovaniu neurónov, ktoré nie sú súčasťou skúsenosti s CFC. Navyše, ako už bolo navrhnuté37, neuróny označené Arc môžu byť heterogénne a môžu zahŕňať rôzne súbory, ktoré regulujú obePamäťdiskriminácia a zovšeobecňovanie. Okrem toho akýkoľvek časový bod pred 1,5–2 hodinami (skorý) nebude dostatočný na zachytenie transkripčných a translačných udalostí spôsobených rekombináciou DNA, tj expresie Cre rekombinázy a konečnej expresie génu eYFP5. Preto sa domnievame, že mnoho skorých prechodných zhlukov DEG bolo vynechaných, ako sa už predtým ukázalo, že mnoho IEG sa vracia na základné úrovne po 2 hodinách (okrem Arc46). Napokon, aj keď sa naša štúdia zamerala na hipokampus, štrukturálna a synaptická plasticita bola spojená s dlhodobým ukladaním informácií v iných oblastiach mozgu, ako je prefrontálny kortex, amygdala2. Budúce štúdie by mali určiť, či tieto epigenetické zmeny môžu predstavovať globálny kritický proces zapojený do dlhodobej tvorby a uchovávania spomienok, alebo či sú jedinečné pre hipokampálne okruhy.

Metódy

Myši a správanie

Ako už bolo opísané6, myši ArcCreERT2(plus) boli chované s homozygotnou líniou R26R-STOP-floxovaný žltý fluorescenčný proteín (eYFP). ~140 následných samčích potomkov bolo genotypizovaných pomocou protokolu genotypovania Jackson Laboratory. Myši boli umiestnené po štyri až päť v klietke v 12-hodinovej (06:00–18:00) svetlo-tmavej kolónii pri teplote 22 stupňov s 40- až 60-percentnou vlhkosťou. Potrava a voda boli poskytované ad libitum. Behaviorálne testovanie sa uskutočnilo počas svetelnej fázy. 1 hodinu pred behaviorálnym testom dostali myši jednu dávku 4-hydroxytamoxifénu (4- OHT, H6278, Sigma-Aldrich), čím sa otvorilo okno na označovanie ~12 hodín5. Aby sa minimalizovalo nešpecifické označenie eYFP, jeden deň pred behaviorálnou úlohou (napr. CFC) boli myši umiestnené samostatne v 24-hodinovej tme/tmavej komore. Okrem toho, aby sa znížila úroveň úzkosti, bola do klietky pridaná trubica na úkryt a hniezdenie. Nasledujúci deň sa myšiam injikoval TAM 1 hodinu pred CFC. Po behaviorálnej úlohe boli myši buď usmrtené po 1, 5 až 2 hodinách a boli odobraté mozgy. alebo umiestnite späť do tmavej komory na nasledujúcich 48 hodín. Keď boli myši vybraté z tmy, vrátili sa do normálneho 12-hodinového (06:00–18:00) cyklu svetlo-tma v rovnakej miestnosti. O 3 dni neskôr (celkovo 5 dní po CFC) bola polovica kohorty myší usmrtená a bol im odobratý mozog, zatiaľ čo druhá polovica sa vrátila do testovacej miestnosti, kde boli vystavené narážke vyvolávajúcej strach (tón a kontext) . Všetky práce na myšiach boli schválené Výborom pre starostlivosť o zvieratá z divízie porovnávacej medicíny na Massachusetts Institute of Technology. Cistanche sa môže zlepšiťPamäť.

Cistanche môže zlepšiť pamäť

Kontextové podmieňovanie strachu

Kontextový prístroj na kondicionovanie strachu (CFC) a akvizičný program boli od TSE-Systems. Myši boli vložené do CFC komory po 3 minútach počiatočného privykania 3 kilo Hz tón s 80 DB intenzitou bol prezentovaný na 30 sekúnd a bol súčasne ukončený 0,7 mA šokom do nohy na 1 sekundu. Medzi experimentmi sa na čistenie klietok použilo 70 percent izopropanolu. O 5 dní neskôr boli myši zavedené do pôvodného kondicionovaného kontextu spárovaného s tónom a úrovne zmrazovania boli merané počas 3 minút (predvolené parametre softvéru TSE používané na monitorovanie mrznutia), aby sa vyhodnotil kontextPamäť. Kontext B bol upravený kontext A. Nerezové tyče boli prekryté bielou plastovou vložkou, vonkajšie steny komôr boli pokryté tvarovkami lepiacej pásky, aby sa zmenil vzhľad komory. Komora bola prevoňaná vanilkou, osvetlenie miestnosti bolo oveľa jasnejšie a myši boli prepravované do prístroja v inom vozíku ako v kontexte A.

Drogy

Rekombinácia v ArcCreERT2 × R26R-STOP-floxed-EYFP transgénnych myšiach bola indukovaná použitím 4-Hydroxytamoxifénu (4-OHT, H6278, Sigma-Aldrich). 4-OHT sa rozpustil v 2,5 ml EtOH /100 percent a trepal sa na trepačke počas 30 minút. Potom sa pridalo 5 ml kukuričného oleja a trepalo sa na trepačke počas 1 hodiny. Nakoniec sa skúmavky umiestnili na 30 minút pri 60 stupňoch, aby sa umožnilo úplné odparenie EtOH. Jednorazová injekcia 50 mg/kg bola podaná intraperitoneálne (ip).

Imunohistochémia (IHC)

Myši boli transkardiálne perfundované ľadovo studeným 25 ml fosfátom pufrovaného fyziologického roztoku (PBS) a následne 4 0 ml 4 % paraformaldehydu v PBS. Mozgy boli odstránené a následne fixované v 4 percentách PFA cez noc pri 4 stupňoch a prenesené do PBS až do rezov. Mozgy boli namontované na vibratómový stolík (Leica VT1000S) pomocou superglue a narezané na rezy s hrúbkou 40 μm. Rezy boli premyté PBS a blokované s použitím 1 percenta bovinného sérového albumínu (BSA) pripraveného v PBS obsahujúcom 0,1 percenta Triton-X100 (PBST) počas 2 hodín pri teplote miestnosti. Blokovací pufor sa odsal a plátky sa inkubovali s vhodnou primárnou protilátkou (doplnková tabuľka 11) cez noc pri 4 stupňoch na trepačke. Rezy sa potom trikrát premyli 15 minút blokovacím pufrom a potom sa inkubovali s konjugovanými sekundárnymi protilátkami Alexa Fluor 488, 594 alebo 647 počas 2 hodín pri teplote miestnosti. Po troch premytiach, každé po 15 minútach blokovacím pufrom a jednom konečnom premytí PBS počas 10 minút, boli rezy pripevnené pomocou fluromount-G (Electron microscopic Sciences). Cistanche sa môže zlepšiťPamäť.

In situ hybridizácia (RNAscope®)

Vzorky boli pripravené na základe inštrukcií výrobcu pre multiplexný fluorescenčný test v2 RNAscope® (Advanced cell diagnostics, USA), s niekoľkými modifikáciami a kombinované s protokolom Imunohistochémia (IHC). Najprv sa vzorky zafarbili na primárne (Arc a GFP) a sekundárne (Alexa Fluor 488 a 594) protilátky (ako je opísané v protokole IHC vyššie). Mozgové rezy boli vložené na sklíčko a

dehydratovaná počas 30 minút pri teplote miestnosti. Potom bola okolo každej sekcie nakreslená bariéra pomocou hydrofóbneho pera Immedge™ a vzorky boli ošetrené peroxidom vodíka RNAscope® počas 10 minút pri teplote miestnosti (neaplikovalo sa žiadne vyhľadávanie cieľa a ošetrenie proteázou). Na základe pokynov výrobcu boli rezy podrobené hybridizácii sondy (RNAscope® Probe-Mm-Gria1, 26241, Advanced cell diagnostics), amplifikácii a vývoju signálu HRP-C1 pomocou kanála TSA® Plus Cyanine 5. Cistanche môže zlepšiť pamäť.

Zobrazovacia analýza

Obrázky sa získali pomocou konfokálnych mikroskopov LSM 710 alebo LSM 880 (Zeiss) s objektívmi 10x, 20x, 40x alebo 63x pri rovnakých nastaveniach pre všetky podmienky. Obrázky boli kvantifikované pomocou ImageJ 1.42q alebo Imarisx64 8.1.2 (Bitplane, Zurich, Švajčiarsko). Pre každú experimentálnu podmienku sa na kvantifikáciu použilo päť koronálnych rezov z najmenej piatich zvierat. Cistanche môže zlepšiť pamäť.

Quantification of tagged cells—The surfaces module was utilized to detect Arc+ and eYFP+ cells. Double positive cells (co-localization of Arc+/eYFP+) were then counted using the Surface-To-Surface Xtension module. After applying the 'area' filter (>6 μM) na odstránenie nešpecifického značenia sa kvantifikácia dvojito pozitívnych buniek uskutočnila v CA1, CA3 a DG. Cistanche môže zlepšiť pamäť.

Kvantifikácia proteínov Eif a Gria1 / mRNA - Modul povrchov sa použil na detekciu a 3D vykresľovanie axónov neurónov na základe signálu GFP. EiF2a, Eif4E, Eif3E a Gria{5}}pozitívne bodky sa potom spočítali pomocou modulu škvŕn. Nakoniec bol spustený modul Spots Close - To - Surface Xtension na nájdenie podmnožiny bodov, ktoré sú bližšie k povrchovým objektom, než je definovaný prah 1 uM, a vylúčenie bodov, ktoré spadajú mimo tento rozsah.

Morfológia tŕňov - tŕne boli klasifikované do troch typov na základe dĺžky chrbtice (L), priemeru hlavy (Dh) a priemeru krku (Dn). Zavalité ostne – Dn=L, Tenké ostne – L > Dn a Dh Väčšie alebo rovné Dn, Hríbové ostne – Dh Väčšie alebo rovné 2Dn, Zväčšené hríbové ostne – Dh Väčšie alebo rovné 2Dn.Cistanche môže zlepšiť pamäť.

Cistanche môže zlepšiť pamäť

Príprava tkaniva

Hipokampálne tkanivo bolo extrahované a rýchlo zmrazené. Po extrakcii boli vzorky okamžite homogenizované v {{0}},5 ml ľadovo studenom PBS s inhibítormi proteázy (Pi) (11836170001, Roche ). Aby sa čo najviac zmiernil dopad triedenia, len v experimentoch NC-RNAseq a capture-HiC bola suspenzia fixovaná 1 percentom (pre NC-RNAseq/HiC) alebo 2 percentami (pc-HiC) paraformaldehydom počas 10 minút, uhasená s glycínom 2,5 M počas 5 minút a dvakrát premyté 5 ml PBS. Tento proces zachováva transkripčnú a chromatínovú krajinu a minimalizuje skreslenie triedenia. Pre ATACseq, RNAseq a capture-HiC bola suspenzia 5 minút centrifugovaná pri 1200 g, 4 stupne a peleta bola resuspendovaná v 5 ml NF-1 hypotonickom pufri (0,5 % Triton X-100/ 0,1 M sacharóza/5 mM MgCl2/1 mM EDTA/ 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, Pi). Potom sa suspenzia homogenizovala (tĺčik A) 30 ťahmi a palička sa premyla ďalšími 5 ml NF-1 pufra na celkový objem 10 ml. Suspenzia sa zhromaždila v 15 ml kónickej skúmavke, prefiltrovala sa cez 70 μm sieťový filter (08–771-2, Falcon) a inkubovala sa na ľade počas 30 minút. Peletované jadrá (všetky centrifúgy boli 4 stupne, 1 600 x g počas 15 minút) sa resuspendovali v 10 ml PBS plus 1 percento BSA plus Pi a inkubovali sa na ľade počas 1 hodiny. Jadrá sa odstredili a peleta sa resuspendovala v 1 ml PBST plus 1 percento BSA plus Pi a inkubovala sa s primárnymi protilátkami NeuN, Arc a GFP cez noc pri 4 stupňoch. Nenaviazané protilátky sa dvakrát premyli 5 ml PBS a nakoniec sa resuspendovali v 1 ml PBS plus 1 percento BSA plus Pi a sekundárne protilátky počas 2–4 hodín pri 4 stupňoch. Po dvoch premytiach boli jadrá resuspendované v 0, 5 ml (PBS plus 1 percento BSA plus Pi) a prefiltrované cez 40 μm sieťový filter na triedenie FACS. 4',6-diamidín-2′-fenylindoldihydrochlorid (DAPI) sa pridal priamo do skúmaviek FACS (1:5000, 10236276001, Sigma-Aldrich). Cistanche sa môže zlepšiťPamäť.

Prietoková cytometria

Na prietokovú cytometriu sa jadrá najskôr uzatvorili pomocou parametrov oblasti pulzu s priamym a bočným rozptylom (FSC-A a SSC-A) s výnimkou trosiek, po čom nasledovalo vylúčenie agregátov pomocou šírky pulzu (FSC-W a SSC-W). Potom sa izotypové kontrolné farbenie použilo na nastavenie brán NEUN plus, ARC plus a GFP plus. Aby sa zabezpečila homogénna neurónová populácia, populácia NeuN plus bola hradená pred hradlovaním populácií na základe fluorescencie ARC plus a GFP plus. Zoradili sme štyri rôzne populácie z troch rôznych časových bodov; Približne 1,5–2 hodiny po expozícii FS i) NeuN plus /GFP plus ii) NeuN plus /GFP-. Po piatich dňoch, bez získania, sme zhromaždili iii) NeuN plus /GFP plus. V inej kohorte boli myši opätovne vystavené podmienenému stimulu. 1,5–2 hodiny po opätovnej expozícii sme odobrali iv) NeuN plus /ARC plus /GFP plus. Všetky jadrá sa roztriedili do 1,5 ml skúmaviek Eppendorf obsahujúcich; 500 ul PBS plus 1 percento BSA plus Pi pre ATCAseq, 200 ul tlmivého roztoku na trávenie (RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit pre FFPE, kat. AM1975, Invitrogen) pre RNAseq, 500 ul čerstvej ľadovej lýzy pufor (10 mM Tris pH=8, 10 mM NaCl, 0,2 % Igepal CA-630, Pi a voda v kvalite PCR) pre Hi-C/capture-HiC. Analýza údajov sa uskutočnila pomocou Flowjo (v10).

ChIP-qPCR

Ihneď po nasledujúcom triedení sa 10, 000 buniek peletovalo pri 4 stupňoch, 1 600 x g počas 15 minút a resuspendovalo sa v SDS lýzovom pufri. ChIP sa uskutočnil na základe pokynov výrobcu pre súpravu ChIP-IT High Sensitivity® (HS) (katalógové č. 53040, Active Motif, USA) s použitím anti-H3K4me1 (Abcam, ab8895, 1:100) a anti-H3K27ac (Abcam, ab4729, 1:100) protilátky. ChIP testy sa uskutočnili v Bio-Rad CFX96 connect real-time PCR jednotke s použitím SsoFast™ EvaGreen® qPCR reagenčnej zmesi (Bio-Rad, 172–5202). Vzorky boli testované v troch opakovaniach a výsledky boli normalizované na vstup. Sekvencie párov primérov pre testy ChIP–qPCR sú uvedené v doplnkovej tabuľke 12.

Cistanche môže zlepšiť pamäť

ATAC-sekv

príprava knižníc— ATAC seq knižnice boli pripravené tak, ako už bolo opísané v 49 s menšou modifikáciou. 10,000 buniek z každej skupiny bolo získaných z 8–10 rôznych myší a považované za N=1. Na prípravu knižnice sa použili 3–4 biologické replikáty (N=3–4). Ihneď po nasledujúcom triedení sa bunky odstredili (4 stupne, 1 600 x g počas 15 minút) a resuspendovali sa v čerstvom 50 ul studeného lyzačného pufra (0,15 percent NP-40 namiesto Igpal) a 10 minút sa kývali na ľade . Ďalej sa uskutočnila segmentačná reakcia (súprava na prípravu vzoriek DNA Nextera 24 reakcií, FC-121–1030, Illumina) v objeme 25 ul (12,5 ul TD, 1,25 ul TDE1, 11,25 ul vody bez nukleázy) počas 30 min pri 37c s jemným kolísaním. Augmentované fragmenty DNA boli amplifikované a označené čiarovým kódom pomocou PCR reakcie (1 cyklus; 5 min – 72 c, 30 s – 98 c, 10 cyklov; 15 s – 98 c, 30 s – 60 c, 3 min – 72 c). Podľa protokolu výrobcu bola amplifikovaná DNA vyčistená a purifikovaná pomocou 1,8x AMPure guľôčok (AmpureXP beads, Beckman Coulter, A63880). Po bioanalyzátore QC pre veľkosť a distribúciu knižnice boli knižnice sekvenované na platforme Illumina Nextseq 550 v MIT BioMicro Center. Cistanche môže zlepšiť pamäť.

Analýza ATAC-seq – nespracované údaje fastq z 40-odčítaní párového sekvenovania bp boli zarovnané s referenčným genómom myši mm9 pomocou Bowtie 2.{5}} v režime párového konca50. Zbierka Samtools51 sa použila na triedenie, odstraňovanie duplikátov PCR (červené nahor), indexovanie súborov BAM (index) a výpočet štatistických údajov knižnice (flagstat, pozri doplnkovú tabuľku 13). Súbory BAM boli prevzorkované zo správne zarovnaných, spárovaných a jedinečných načítaní na 50 miliónov. Otvorené chromatínové píky sa analyzovali pomocou softvéru MACS252. Rozdielne dostupné oblasti (DAR) boli identifikované pomocou Diffbind v1.16.353 s predvolenými parametrami a nastaveniami na použitie DESeq2 (medzná hodnota; FDR < 0,01;="" násobné="" zmeny=""> 1,5). Úplná matica normalizovaných počtov (RPKM54) bola získaná balíkom DiffBind. Pre generáciu bigwigových stôp boli súbory signálu pileup (hromadenie fragmentov na milión prečítaní) v biografickom formáte skonštruované pomocou funkcie špičky hovoru MACS2 s príznakmi -B –SPMR. Potom sa pomocou funkcie bdgcmp MACS2 s nastavením - m FE vygenerovalo normalizované násobné obohatenie (FE) cez vstupné stopy lambda. Potom boli súbory bedGraph prevedené do formátu bigwig.Cistanche môže zlepšiť pamäť

Na vizualizáciu veľkých súborov boli použité nástroje IGV55. ChromHMM56 sa použil na vytvorenie modelu stavu chromatínu z dvoch nezávislých štúdií, ktoré využívali objemové tkanivo hipokampu pred a po šoku chodidiel21, 22 a na určenie ponúk násobného obohatenia oproti štátnemu modelu. Analýza obohatenia motívu57,58 a anotácia píkov boli vykonané nástrojmi HOMER59. Všetky kódy sú dostupné v doplnkovom softvérovom súbore