Časť 1: Identifikácia dopaminergných neurónov, ktoré dokážu vytvoriť asociatívnu pamäť a akútne ukončiť jej prejavy správania
Mar 19, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Michael Schleyer, 1* Alice Weiglein, 1 Juliane Thoener, 1 Martin Strauch, 2 Volker Hartenstein, 3
Melisa Kantar Weigelt,1 Sarah Schuller,1 Timo Saumweber,1 Katharina Eichler,4,5,6 Astrid Rohwedder,4,7 Dorit Merhof,2 Marta Zlatic,5,7 Andreas S. Thum,4,8 a Bertram Gerber1,9 ,10*
1Leibnizov inštitút pre neurobiológiu, oddelenie genetiky učenia aPamäť, 39118 Magdeburg, Nemecko, 2Institute of Imaging & Computer Vision, RWTH Aachen University, 52056 Aachen, Nemecko, 3Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, California 90095-1606, 4University of Konstanz, Institute pre biológiu, 78464 Konstanz, Nemecko, 5HHMI Janelia Research Campus, Ashburn, Virgínia 20147, 6Inštitút neurobiológie, University of Portoriko Medical Science Campus, Old San Juan, Portoriko 00901, 7Department of Zoology, University of Cambridge, Cambridge, CB{ {12}}EJ, Spojené kráľovstvo, 8University Leipzig, Institute for Biology, 04103 Lipsko, Nemecko, 9Centre for Behavioral Brain Sciences, 39108 Magdeburg, Nemecko, a 10Institute for Biology, Otto von Guericke University Magdeburg, 39106 Magdeburg, Nemecko
Pre všetky zvieratá je dôležitý adaptívny prechod od skúmania životného prostredia pri hľadaní životne dôležitých zdrojov k využívaniu týchto zdrojov po úspešnom hľadaní. Tu študujeme neurónový obvod, ktorý umožňuje larve Drosophila melanogaster oboch pohlaví vyjednávať o tomto prechode prieskumu a využívania. Robíme tak kombináciou Pavlovovho kondicionovania so sledovaním správania s vysokým rozlíšením, optogenetickou manipuláciou s individuálne identifikovanými neurónmi a analýzami synaptickej organizácie založenou na EM údajoch. Zistili sme, že optogenetická aktivácia dopaminergného neurónu DAN-i1 môže byť stanovenáPamäťpočas výcviku a akútne ukončiť naučené pátracie správanie v následnom teste zvolávania. Jeho aktivácia však ponecháva vrodené správanie nedotknuté. Konkrétne, aktivácia DAN-i1 môže vytvoriť asociatívne pamäte s opačnou valenciou po spárovanom a nepárovom tréningu so zápachom a jej aktivácia počas testu vyvolania môže ukončiť vyhľadávanie vyplývajúce z ktorejkoľvek z týchto pamätí. Naše výsledky ďalej naznačujú, že vo svojom behaviorálnom význame sa aktivácia DAN-i1 podobá, ale nerovná sa odmene cukru. Dendrogramové analýzy všetkých synaptických spojení medzi DAN-i1 a jeho dvoma hlavnými cieľmi, Kenyonovými bunkami a výstupným neurónom hubového tela MBON-i1, ďalej naznačujú, že signály DAN-i1 počas tréningu a počas testovacieho testu by mohli byť doručené Kenyonove bunky a MBON-i1, v tomto poradí, v rámci predtým nerozpoznaných, lokálne obmedzených rozvetvených štruktúr. To by poskytlo elegantný motív obvodu na ukončenie hľadania po jeho úspešnom dokončení.
Kľúčové slová: dopamín; prieskum-ťažba; hubové telo; optogenetika; výstuž; Vyhľadávanie
Vyhlásenie o význame
V boji o prežitie musia zvieratá skúmať svoje prostredie pri hľadaní potravy. Keď sa však jedlo nájde, prispôsobí sa uprednostniť jeho využitie pred pokračovaním v hľadaní, ktoré by teraz bolo rovnako zbytočné ako hľadanie okuliarov, ktoré nosíte. Tento kompromis medzi prieskumom a využívaním je dôležitý pre zvieratá a ľudí, ako aj pre technické pátracie zariadenia. Skúmame, ktoré z iba 10000 neurónov larvy ovocnej mušky dokážu nakloniť rovnováhu v tomto kompromise, a identifikujeme jeden dopamínový neurón s názvom DAN-i1, ktorý to dokáže. Vzhľadom na podobnosti vo funkcii dopamínových neurónov naprieč zvieracím kráľom
dom, môže to odrážať všeobecný princíp, ako sa vyhľadávanie ukončí, keď je úspešné.
Úvod
Zviera, ktoré skúma svoje prostredie, môže použiť minulé skúsenosti na usmernenie pri hľadaní potravy. Keď sa však nájde potrava, prispôsobí sa ukončiť vyhľadávanie a namiesto toho využiť zdroj potravy. Tu študujeme okruhy, ktoré umožňujú larve Drosophila melanogaster vyjednávať tento prechod prieskumu a využívania. Numerická jednoduchosť mozgu lariev v kombinácii s bunkovo špecifickou expresiou transgénu a znalosťou jeho synaptickej konektivity (Pfeiffer a kol., 2010; Li a kol., 2014; Eichler a kol., 2017; Saumweber a kol., 2018; Eschbach et al., 2020), umožňuje to skúmať na úrovni individuálne identifikovaných neurónov.
Larvy D. melanogaster ľahko spájajú pachy s potravinovou odmenou (Scherer a kol., 2003; Gerber a Hendel, 2006; Schipanski a kol., 2008; Rohwedder a kol., 2012; Apostolopoulou a kol., 2014; Kudow a kol. , 2017, 2019). Najdôležitejšie je, že naučené správanie založené na týchto asociáciách zápachu a jedla prestane, ak je počas testovania odmeny prítomná odmena (obr. 1A). Naučené správanie je teda možné vnímať ako hľadanie, ktoré je adaptívne ukončené hľadaným výsledkom (teda odmenou) (Schleyer et al., 2011, 2013, 2015a). Rovnako nie je ovplyvnené vrodené čuchové správanie (obr. 1B), čo naznačuje, že takéto vrodené správanie je organizované reflexným spôsobom (Schleyer et al., 2011, 2013, 2015a,b). Prirodzené odmeny teda môžu vyvolať dva efekty: počas tréningu poskytujú signál odmeny, ktorý môže byť spojený s podnetmi, ktoré následne usmerňujú hľadanie odmeny; a počas testovacieho testu môžu akútne ukončiť toto naučené vyhľadávanie, čím zabránia tomu, aby sa zvieratá vzdialili od zdroja, keď ho nájdu. Tento prechod teda odráža zmenu stratégie získavania odmeny, nie zmenu motivácie (teda nie stratu záujmu o odmenu).
Bezstavovce aj bezstavovce poskytujú dopaminergné neuróny (DAN) posilňujúce signály pre asociatívne učenie (Waddell, 2013; Schultz, 2015; Kaun a Rothenfluh, 2017). V D. melanogaster odlišné súbory DAN sprostredkúvajú apetitívne a averzívne posilnenie (larvy: Schroll a kol., 2006; Rohwedder a kol., 2016; Saumweber a kol., 2018; Eschbach a kol., 2020; dospelé muchy: Schwaerzel a kol., 2003; Claridge-Chang a kol., 2009; Liu a kol., 2012) (podobný scenár môžu mať aj vznikajúce bezstavovce: Lammel a kol., 2012; Groessl a kol., 2018; Menegas a kol. al., 2018). Tieto DAN vytvárajú kompartmentovú štruktúru a pretínajú paralelné vlákna Kenyonových buniek (KC), vnútorné neuróny najvyššieho rádu čuchového centra hmyzu, nazývaného hubové telo. Rešpektujúc rovnakú kompartmentovú štruktúru, výstupné neuróny húb (MBON) zhromažďujú informácie cez KC a posielajú ich do eferentných obvodov (pozri obr. 2A–D) (larvy: Selcho a kol., 2009; Pauls a kol., 2010 ; Eichler a kol., 2017; Saumweber a kol., 2018; Eschbach a kol., 2020; dospelí: Sejourne a kol., 2011; Places a kol., 2013; Aso a kol., 2014a,b; Oswald a Waddel , 2015;Takemura a kol., 2017). Nedávna rekonštrukcia elektrónového mikroskopu odhalila, že DAN majú dva hlavné ciele: KC a MBON (pozri obr. 2B) (larvy: Eichler a kol., 2017; dospelí: Takemura a kol., 2017).
U lariev D. melanogaster môže aktivácia DAN z klastra pPAM prejaviť odmeňujúci účinok počas tréningu (Rohwedder et al., 2016). Zo štyroch dní tohto klastra môžu dva jednotlivo poskytnúť takýto odmeňujúci účinok (DAN-h1 a DAN-i1) (Saumweber et al., 2018). Tu sme sa rozhodli zamerať
Obrázok 1. Cukor môže poskytnúť odmeny a signály ukončenia vyhľadávania. Larvy boli vycvičené tak, že zápach bol prezentovaný buď spárovaný alebo nespárovaný s cukrom. V následnom spätnom teste boli testované na preferenciu vône buď v neprítomnosti alebo v prítomnosti cukru (náčrt smerom hore). Testovanie v neprítomnosti cukru odhalilo asociatívne čuchovéPamäť, kvantifikované ako pozitívny PI. Behaviorálny prejav tohtoPamäťbola ukončená v prítomnosti cukru. Cukor teda môže poskytnúť dva druhy signálu: počas tréningu poskytuje signál odmeny, ktorý môže byť spojený s pachom, aby sa zvieratá neskôr viedli pri hľadaní odmeny; a počas testovacieho testu cukor ako hľadaná odmena poskytuje signál na ukončenie tohto naučeného hľadania. Veľkosti vzoriek: N=29, N =28. B, Larvy boli testované na vrodenú preferenciu zápachu, buď v neprítomnosti alebo v prítomnosti cukru (náčrt smerom hore). Cukor neovplyvnil vrodené čuchové správanie, čo naznačuje jeho reflexnú organizáciu. Veľkosti vzoriek: N=20 každá. Rôzne písmená nad rámčekovými grafmi označujú párovú významnosť (Mann–Whitney U test, p, 0.05, opravené podľa Bonferroni-Holma). *Významnosť od nuly (jednovýberový znamienkový test, p, 0,05, korigované podľa Bonferroni-Holma). ns, nie je významné. Všetky štatistické testy a ich výsledky sú uvedené spolu so zdrojovými údajmi na obrázku rozšírených údajov 1-1. Hodnoty preferencie vône, ktoré sú základom PI skóre tohto experimentu, pozri obrázok 9A.
Obrázok 2. Obvod matice DAN-KC-MBON. Chiasma stredného laloku. Informácie o pachu sa spracúvajú na vyvolanie vrodeného prístupu, ako aj smerom ku kalichovej oblasti tela huby KCs (fialová; úplne zobrazený je jeden príklad KC na pravej strane). Informácie o odmene chuti sa tiež spracúvajú na usmernenie vrodeného správania, ako aj prostredníctvom väčšinou aminergných modulačných neurónov (zobrazený je DAN-i1, tyrkysová/čierna) smerom k jednotlivým kompartmentom lalokov húb (na ľavej strane sú označené kompartmenty). Každý zo štyroch kompartmentov mediálneho laloku (hk) prijíma vstup z jedného DAN, ktorý tiež inervuje rovnaký kompartment v kontralaterálnej hemisfére. MBON mediálneho laloka čerpajú z jednotlivých kompartmentov, zvyčajne z oboch hemisfér (zobrazený je MBON-i1, purpurová/žltá) a dodávajú svoj výstup v konfiguráciách, ktoré sa medzi kompartmentmi líšia, cez hemisférický predel. Spoločne sú za to zodpovedné MBONPamäťsprávanie pri vyhľadávaní. Údaje sú založené na Eichler et al. (2017) a Saumweber a kol. (2018). B, Matrica DAN-KC-MBON v i-priehradke. DAN-i1 a väčšina KC vytvára vzájomné chemické synapsie a DAN-i1 aj KC poskytujú výstup pre MBON-i1. Pre jednoduchosť sú detailne zobrazené iba synapsie s ľavými neurónmi DAN-i1 a MBON-i1. Rovnaká konektivita sa nachádza vo väčšine, ak nie vo všetkých, iných kompartmentoch (Eichler a kol., 2017; Saumweber a kol., 2018). C, DAN-i1 (tyrkysová) prijíma vstup zvonku tela huby (tmavosivá) ipsilaterálne k telu bunky (oblasť označená 1) a potom inervuje i-priestor v oboch hemisférach (označený 2 a 3). MBON-i1 (purpurová) dvakrát prekročí strednú čiaru; prijíma vstup v i-kompartmente oboch hemisfér a poskytuje výstup v oblastiach susediacich s telom huby oboch hemisfér. D, Rovnaké ako v C, ale v mierne naklonenom pohľade, zobrazujúce rekonštrukcie kostry ľavých neurónov DAN-i1 a MBON-i1 a jeden príklad KC (čierna). Údaje sú založené na Eichler et al. (2017). E, Dendrogram ľavého neurónu DAN-i1. Farebné bodky predstavujú výstupné synapsie z DAN-i1. Trojuholníky predstavujú vstupné synapsie do DAN-i1. Farby predstavujú partnerský neurón príslušnej synapsie. Všetky ostatné synapsie v tele huby sú označené ako „Iné“. Nie sú zobrazené synapsie, ktoré DAN-i1 tvorí s neurónmi mimo tela huby, najmä v oblasti 1 (Eschbach et al., 2020). Bodkované čiary označujú oblasti, kde neurón pretína strednú čiaru mozgu. F, Rovnaké ako v E, ale pre ľavý neurón MBON-i1. Nie sú zobrazené synapsie, ktoré MBON-i1 tvorí s neurónmi mimo tela huby. Verzie neurónov DAN-i1 a MBON-i1 oboch hemisfér s vysokým rozlíšením, ako aj všetky zrelé KC, nájdete v časti Obrázky rozšírených údajov 2-1, 2-2 a 2-3. .
na DAN-i1, pretože bol predtým podrobnejšie analyzovaný (Saumweber a kol., 2018) a pretože prináša robustnejší odmeňujúci účinok ako DAN-h1 (Saumweber a kol., 2018; nepublikované údaje). Najprv poskytujeme podrobný popis priestorového usporiadania všetkých synapsií medzi DAN-i1 a oboma jeho hlavnými výstupnými partnermi, MBON-i1 a KC. Potom sa pýtame, či optogenetická aktivácia DAN-i1 môže sprostredkovať nielen signál odmeny počas tréningu, ale aj signál na akútne ukončenie, ktorý sa naučil hľadať odmenu počas testovacieho testu.
cistanche kulturistika
Materiály a metódy
Experimentálny model a detaily predmetu. Počas celého obdobia sa používali larvy v kŕmnom štádiu tretieho instaru oboch pohlaví (D. melanogaster), vo veku 5 dní po znesení vajíčok. Muchy sa udržiavali na štandardnom médiu, v masovej kultúre pri 25 stupňoch, 60 percentách -70 percent relatívnej vlhkosti a 12/12 hodinovom cykle svetlo/tma. Zobrali sme lyžicu živného média z ampulky s jedlom, náhodne sme vybrali požadovaný počet lariev, krátko ich opláchli vo vode z vodovodu a začali experiment.
Použili sme transgénne larvy na expresiu svetelného iónového kanála ChR2-XXL v DAN. Na tento účel bol efektorový kmeň UAS-ChR2-XXL (Dawydow et al., 2014) (láskavo poskytol R. Kittel, University Leipzig) skrížený s jedným z dvoch riadiacich kmeňov: buď 58E{{6 }}Gal4 (Pfeiffer a kol., 2008; Liu a kol., 2012; Rohwedder a kol., 2016) (Bloomington Stock Center č. 41347) alebo split-Gal4 riadiaci kmeň SS00864 (Eichler a kol., 2017; Saumweber; et al., 2018) na získanie dvojito heterozygotných potomkov. Ovládač riadi, že kmene ovládačov boli skrížené na lokálnu kópiu w1118 (Bloomington Stock Center #3605, #5905, #6326). Ako efektorové kontroly kmeň nesúci miesta pristátia používané pre Gal4 (attP2) alebo split-Gal4 (attP40/attP2), avšak bez vloženej Gal4 domény ("prázdny") (Pfeiffer et al., 2010), bol skrížený UAS- ChR2-XXL. Potvrdili sme expresný vzor 58E02 a SS00864 ich krížením do pJFRC-10xUAS-IVS-mCD8::GFP (Pfeiffer et al., 2010) (Bloomington Stock Center #32185). Pretože ChR2-XXL je dostatočne citlivý na to, aby bol aktivovaný denným svetlom (nezobrazené), muchy boli chované v liekovkách, ktoré boli neustále tmavé obalom z čiernej lepenky. Pre experiment uvedený na obrázku 8E bol UAS-ChR2 (Schroll et al., 2006) skrížený s 58E02-Gal4.
Experimentálne nastavenie. Pre behaviorálne experimenty boli larvy trénované v Petriho miskách s vnútorným priemerom 9 cm a testované v Petriho miskách s vnútorným priemerom 9 alebo 15 cm (obe od Sarstedt), ako je uvedené v legendách obrázkov, vo všetkých prípadoch naplnených 1 percentom agarózy (stupeň elektroforézy Roth). Podobne ako pri zápachu sme použili n-amylacetát zriedený v pomere 1:20 v parafínovom oleji (AM; CAS: 628-63-7; Merck) a v niektorých prípadoch navyše neriedený 1-oktanol (OCT; CAS: {{ 9}}; Merck).
Experimenty sa uskutočňovali vo vnútri 43 43 73 cm obklopujúceho boxu vybaveného na mieru vyrobeným svetelným stolom s 24 12 LED poľom (470 nm; Solarox) a 6- mm hrubou difúznou doskou z matného plexiskla na vrchu, aby sa zabezpečilo jednotné modré svetlo pre aktiváciu ChR2-XXL (120 mW/cm2). Petriho misky sa umiestnili priamo na vrch difúznej platne. Petriho misky boli obklopené polyetylénovým difúznym prstencom; za difúznym prstencom bolo namontovaných 30 infračervených LED diód (850 nm; Solarox), ktoré poskytovali osvetlenie, ktoré bolo pre larvy neviditeľné, no umožňovalo zaznamenávanie a sledovanie ich správania pre offline analýzu. Na tento účel bola nad Petriho miskou umiestnená kamera (Basler acA204090umNIR; Basler) vybavená infračerveným filtrom. Ďalšie podrobnosti týkajúce sa experimentálneho usporiadania nájdete v Saumweber et al. (2018).
cistanche kulturistika
Asociatívne učenie sa zápachom a cukrom. Experimenty s učením sa riadili zavedenými protokolmi (Michels et al., 2017). Zápachové nádoby boli pripravené pridaním 10 ml pachovej látky do na mieru vyrobených teflónových nádobiek (vnútorný priemer 5 mm s vekom perforovaným 7 otvormi, každý s priemerom 0,5 mm). Petriho misky boli zakryté upravenými viečkami perforovanými v strede 15 otvormi s priemerom 1 mm, aby sa zlepšilo prevzdušnenie.
Na tréning vône cukru sa 20 lariev umiestnilo do stredu Petriho misky naplnenej agarózou, ktorá obsahovala 2 mol/l D-fruktózy (CAS: 57-48-7; Roth) ako odmenu (1) a vybavila sa dvoma vôňami nádoby na opačných stranách, obe naplnené AM (AM1). Po 2,5 minútach boli larvy premiestnené na čerstvú Petriho misku s obyčajnou agarózou bez chuti, vybavenú dvoma prázdnymi nádobami (EM), kde tiež strávili 2,5 minúty. Uskutočnili sa tri takéto „párové“ tréningové cykly, v každom prípade s použitím čerstvých Petriho misiek. V polovici prípadov sa tréning začal s Petriho miskami obsahujúcimi odmenu, ako je uvedené (AM1/EM), zatiaľ čo v druhej polovici prípadov bola sekvencia obrátená (EM/AM1). Pre každú kohortu lariev trénovaných AM1/EM (alebo EM/AM1) bola druhá kohorta trénovaná recipročne, to znamená „nespárovanými“ prezentáciami zápachu a odmeny (AM/EM1, resp. EM1/AM).
Po tréningu boli larvy prenesené do stredu testovacej Petriho misky a testované na ich preferenciu vône. Dôležité je, že test stiahnutia sa vykonal buď na obyčajnej Petriho miske, aby sa vyhodnotilPamäťna základe vyhľadávacieho správania alebo na Petriho miske obsahujúcej odmenu, aby sa zistilo, či prítomnosť odmeny ukončilaPamäť-založené vyhľadávanie. V oboch prípadoch bola jedna strana testovacej Petriho misky vybavená AM nádobou a druhá strana EM nádobou. Počet lariev na každej strane sa určil z obrazu kamery 3 minúty po začatí testu. Z týchto čísel sa vypočítala preferencia zápachu takto:
Hodnoty PI sa teda môžu pohybovať od 1 do 1, pričom kladné hodnoty naznačujú, že larvy preferovali zápach viac po párovom ako nepárovom tréningu. Pozitívne hodnoty PI teda naznačujú apetitívnu asociáciuPamäťto sa najlepšie interpretuje akoPamäťsprávanie pri vyhľadávaní. Negatívne hodnoty PI naopak naznačujú averzívnu asociatívnosťPamäť.
Asociatívne učenie optogenetickou aktiváciou DAN. Pre optogenetické experimenty sa tréning a test uskutočňovali analogicky. Všetky Petriho misky však boli naplnené obyčajnou agarózou (tj neboli použité žiadne obohacujúce chute). Namiesto toho bol pre párový tréning AM spárovaný s nepretržitou stimuláciou modrým svetlom, aby sa aktivovalo buď 58E02-DAN alebo 864-DAN na 2,5 minúty, po čom nasledovalo 2,5 minúty tmy bez zápachu (AM1/EM). V prípade nepárového tréningu sa prezentácia pachu a stimulácia svetlom vyskytli oddelene (AM/EM1). Pre experiment prezentovaný na obrázku 8E boli prezentované pach a svetlo po dobu 5 minút; tento experiment inak sledoval postupy opísané Rohwedderom a kol. (2016).
Po troch takýchto tréningových cykloch sa uskutočnil test vyvolania pachu a vypočítali sa preferencie vône a PI, ako je opísané. Dôležité je, že test vyvolania sa uskutočnil buď bez aktivácie modrého svetla, aby sa určilo, či DAN sprostredkúvajú signál odmeny počas tréningu, alebo s aktiváciou modrého svetla, aby sa určilo, či navyše DAN môžu sprostredkovať signál na ukončenie vyhľadávania.
Variácie tohto protokolu sú uvedené v legendách obrázkov.
Vrodené čuchové správanie. Zápachové nádoby a Petriho misky boli pripravené tak, ako je opísané vyššie. Z liekovky sa odobrali kohorty 20 lariev, ktoré sa krátko premyli vodou z vodovodu a umiestnili sa na Petriho misku s nádobou AM na jednej strane a prázdnou nádobou na druhej strane. Po 3 minútach sa určila preferencia vrodenej vône podľa rovnice 1. Tento preferenčný test sa uskutočnil buď v neprítomnosti alebo v prítomnosti cukru, alebo v neprítomnosti alebo v prítomnosti aktivácie modrého svetla, aby sa zistilo, či sa tieto testovacie podmienky zmenia. vrodené čuchové správanie.
Analýza modulácií správania po tréningu s 864-aktiváciou DAN. Správanie lariev sa sledovalo na videu a analyzovalo, ako je podrobne opísané v Paisios et al. (2017). Stručne povedané, analyzovali sa dva aspekty chemotaxie lariev. Najprv sa vypočítala modulácia kastrácie hlavy (HC za sekundu) (HC/s) takto:
V tomto meraní uhol smeru (HA) opisuje orientáciu hlavy zvieraťa vzhľadom na zápach, pričom absolútny uhol smeru (abs (HA)) 0 stupňa alebo 180 stupňov, napríklad, naznačuje, že zápach je v prednej alebo zadnej časti lariev. Toto opatrenie teda dáva pozitívne skóre pre príťažlivosť (tj keď HC nasmeruje larvy skôr smerom k pachovému cieľu ako preč od neho), zatiaľ čo dáva negatívne skóre pre averziu.
Imunohistochémia. Larválne mozgy boli vypreparované vo fyziologickom roztoku bez Ca{0} a fixované v Bouinovom roztoku zriedenom 1:2 s fyziologickým roztokom bez Ca21- počas 7 minút. Po troch premývacích krokoch (každých 10 minút) v PBST (0,3 percenta Triton-X 100 v PBS) nasledovala inkubácia s primárnymi protilátkami cez noc pri 4 stupňoch. Po troch premytiach (každých 10 minút) v PBS sa tkanivo inkubovalo so sekundárnymi protilátkami počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Po troch záverečných krokoch premývania v PBS (každých 10 minút) sa vzorky umiestnili do Vectashield (Vector Laboratories). Prípravky sa skúmali pod konfokálnym mikroskopom DM 6000 CS (Leica Microsystems).
cistanche kulturistika
Ako protilátky sme použili buď monoklonálnu anti-FASII myšaciu protilátku (DSHB, zriedenú 1:50 v blokovacom roztoku obsahujúcom 4 percentá normálneho kozieho séra) a anti-GFP králičiu protilátku (A11122, Invitrogen, zriedená 1:1{ {28}}00 v blokovacom roztoku obsahujúcom 4 percentá normálneho kozieho séra) ako primárne protilátky a Cy3 anti-myšia protilátka (715-165-150, Jackson ImmunoResearch Laboratories) a Alexa-488 anti-králičia protilátka (A11034, Invitrogen), obe zriedené 1:200 v PBS, ako sekundárne protilátky; alebo sme použili monoklonálnu anti-ChR2 myšaciu protilátku (ProGen Biotechnik) zriedenú 1:100 v 0,3 percenta PBST ako primárnu protilátku, Cy3 anti-myšaciu protilátku (715-165-150, Jackson ImmunoResearch Laboratories), zriedenú 1:300 v 0,3 percenta PBST , ako sekundárna protilátka, a Alexa{30}} anti-HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories), zriedené v pomere 1:300 v 0,3% PBST, na kontrastné farbenie.
