Časť 2: Echinakozid zvyšuje množstvo spermií u potkanov zacielením na hypotalamický androgénny receptor
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Zhihui Jiang1,2, Bo Zhou2, Xinping Li2, Gordon M. Kirby3 & Xiaoying Zhang1,2
Experimentujte liečbe.
Experimentujte 1. Myši boli náhodne rozdelené do šiestich skupín, sedem myší v každej skupine (n=7).ECH(Echinakozid z cistanche)(CAS: 82854-37-3; Chengdu Preferred Biotechnology Co., Ltd, Sichuan, Čína) bola podaná intragastrickou sondou a bol podaný testosterón propionát (TP, CAS: 57-85-2; KingYork, Tianjin, Čína). intramuskulárnou injekciou raz denne počas 14 dní podľa nasledujúceho experimentálneho usporiadania: Kontrolná skupina: normálny fyziologický roztok (10 ml/kg), ECH(L)skupina (5 mg/kg), ECH(M)skupina (20 mg/kg), ECH(H)skupina (80 mg/kg), TP (15 mg/kg) a enzalutamid (AR inhibítor, jedenkrát denne každý druhý deň počas 14 dní; 20 mg/kg; CAS: 915087- 33-1; Aladdin, Shanghai, Čína).
Po 2 týždňoch liečby boli myši anestetizované dietyléterom, aby sa odobrali vzorky krvi na analýzu hladín hormónov. Myši sa potom pitvali, aby sa oddelil hypotalamus, encefalón plus hypofýza, semenníky a cauda nadsemenníky. Vzorky cauda nadsemenníka sa umiestnili do normálneho fyziologického roztoku s 5 percentami BSA na posúdenie kvality spermií a hypotalamus, mozog plus hypofýza a semenníky sa zmrazili v tekutom dusíku a skladovali sa pri -80 stupňoch na ďalšie vyšetrenia.
Experimentujte 2. Myši boli náhodne rozdelené do 10 skupín, päť zvierat na skupinu. ECH (20 mg/kg) bol podávaný perorálne a myši v každej skupine boli anestetizované dietyléterom v časových bodoch 0,5 h, 1 h, 1,5 h, 2 h, 2,5 h, 3 h, 4 h, 6 h, 9 h a 12 h po podaní na odber vzoriek.
Odobrala sa plazma a srdce sa obnažilo. Perfúzia normálneho fyziologického roztoku do ľavej komory sa uskutočňovala pomocou infúzneho prístroja, kým sa pečeň a pľúca nezbledli. Potom sa odobrali hypotalamus a semenníky, aby sa určili tkanivové koncentrácie ECH(Echinakozid z cistanche).
Experimentujte 3. Myši boli náhodne rozdelené do 4 skupín, sedem v každej skupine. ECH(Echinakozid z cistanche)a BPA (CAS: 80-05-7; Aladdin, Shanghai, Čína) boli podávané pomocou intragastrickej sondy raz denne počas 6 týždňov podľa nasledujúceho experimentálneho usporiadania: normálna skupina (kukuričný olej, 10 ml/kg, bw/ d), modelová skupina: skupina BPA (BPA 200 mg/kg, telesná hmotnosť/d, kukuričný olej) a experimentálna skupina: skupina BPA plus ECH (BPA 200 mg/kg; ECH 20 mg/kg).
Po 42 dňoch liečby boli myši anestetizované dietyléterom a odoberali sa vzorky krvi na analýzu hladiny hormónov. Semenníky a cauda nadsemenníky boli oddelené a odobraté. Zadná časť nadsemenníka sa použila na hodnotenie kvality spermií a semenník sa zmrazil v tekutom dusíku a skladoval pri teplote -80 stupňov na ďalšie vyšetrenie.
Obrázok 7. Dráhy regulované vybraným hormónom a proteínom súvisiacim s osou HPG v samčej reprodukcii, ako je predpovedané databázou Pathway Ontology Database a KEGG Pathway Database.
Poznámky: Regulované procesy sú znázornené pozadiami rôznych farieb a tvarov a regulačné udalosti sú zobrazené pomocou šípok a čiar.
Odkazy spojené s každým proteínom boli založené na Pathway Ontology Database a KEGG Pathway Database a nie sú uvedené.
Stanovenie kvality spermií. Príprava suspenzie spermií. Cauda nadsemenníky boli rozdrvené do 5 ml normálneho fyziologického roztoku s 5 percentami BSA a inkubované počas 5 minút pri 37 stupňoch, aby sa ich obsah mohol rozšíriť do média.
Počet spermií: Podľa metódy, ktorú opísal Yokoi (2003), zriedená suspenzia spermií (1:10; v/v; suspenzia spermií/10% metanol) sa preniesla do každej počítacej komory hemocytometra a nechala sa stáť 5 min a potom spočítané pod svetelným mikroskopom (Nikon, Instruments Inc., Japonsko) pri 200-násobnom zväčšení.
Životaschopnosť spermií: Celkom 20 ul suspenzie spermií sa zmiešalo s rovnakým objemom eozín-nigrozínového farbiva počas 2 minút; nezafarbené spermie sa spočítali pod svetelným mikroskopom pri 200-násobnom zväčšení.
Pohyblivosť spermií: Celkom 10 ul suspenzie spermií sa nanieslo na podložné sklíčko a zaznamenali sa ako mobilné alebo nepohyblivé pod svetelným mikroskopom pri 200-násobnom zväčšení.
Stanovenie hladín hormónov. Hladiny testosterónu (T) a LH boli kvantifikované v sére, encefalóne, hypofýze a homogenátoch semenníkov pomocou súprav pre rádioimunoanalýzu (RIA) (Beijing Sino-UK Institute of Biological Technology, Peking, Čína). Stručne, anti-testosterónová alebo anti-LH IgG protilátka (100 ul) a 125-I-konjugovaná anti-myšia protilátka boli pridané do vzoriek alebo štandardu (100 ul) a miešané na vahadle cez noc pri 4 stupňoch. Po trojnásobnom premytí PBS-Tween 20 (500 ul) sa zmesi centrifugovali (3500 ot./min./min.) pri 4 stupňoch počas 15 minút. Hodnoty CPM precipitátov boli hodnotené rádioimunotestovacím prístrojom (Beijing Sino-western Technology Co. Ltd, CN202M/KZ4GC-1200, Peking, Čína) a koncentrácie T a LH boli vypočítané podľa vzorca štandardu krivka. Variačný koeficient T a LH je 2,8 percenta a 3,2 percenta v skupinách vzoriek a 2,1 percenta a 2,8 percenta v štandardných skupinách.
Stanovenie génových expresií pomocou kvantitatívnej PCR v reálnom čase. Celková RNA sa izolovala zo zmrazených semenníkov a tkanív mozgu a hypofýzy pomocou súpravy RNA Simple Total RNA (Tiangen, Peking, Čína). Kvantitatívna PCR v reálnom čase (q RT-PCR) sa uskutočnila na amplifikáciu cDNA s použitím 2 x SYBR Green I PCR Master Mix (Vazyme, Nanjing, Čína). Postup PCR pozostával z 95 stupňov počas 30 sekúnd, po ktorých nasledovalo 35 cyklov 95 stupňov počas 15 sekúnd, 58 stupňov počas 30 sekúnd a 72 stupňov počas 30 sekúnd. Analýza krivky topenia sa uskutočnila na produktoch PCR, aby sa overila špecifickosť priméru a čistota produktu. Pre každú platňu sa uskutočnila disociačná krivka na potvrdenie produkcie jedného produktu. Vypočítalo sa relatívne množstvo každej mRNA. PCR priméry použité na štúdiu sú uvedené v tabuľke 2.
Western blot. Na analýzu expresie AR sa uskutočnila extrakcia a izolácia cytoplazmatického a jadrového proteínu pomocou súpravy na extrakciu cytoplazmatického a jadrového proteínu (Beyotime, Nanjing, Čína) podľa pokynov výrobcu. Koncentrácie cytoplazmatických a jadrových proteínov sa hodnotili pomocou súpravy Bradford Protein Assay Kit (Beyotime, Jiangsu, Čína). Vzorky proteínov (80 ug) boli nanesené na 12 % a 5 % SDS-PAGE gél a prenesené na PVDF membrány. Po blokovaní boli membrány inkubované s anti-AR IgG protilátkami (1:1,000; Bioss; Peking Čína) a myšími polyklonálnymi anti-GAPDH protilátkami (1:1,000; Wuhan Boster BiologickéTechnology, Wuhan, Čína) alebo myšacie polyklonálne anti-Lamin b1 protilátky počas 2 hodín. Membrána bola trikrát premytá TBST a inkubovaná s HRP-konjugovanou králičou anti-myšou IgG protilátkou (1:5, 000; Bioss; Peking Čína). Signál bol vizualizovaný pomocou systému ChemiDoc Imaging System (Tanon-3,500, Šanghaj, Čína).
Test vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC). Krv sa odoberala do heparinizovaných sklenených skúmaviek. Plazma bola oddelená okamžitou centrifugáciou pri 6, 000 otáčkach za minútu počas 10 minúty a uskladnená pri -20 stupňoch pre ďalší experiment. Vzorky hypotalamu a semenníkov z každého časového bodu sa spojili a homogenizovali s metanolom. Po centrifugácii pri 10, 000 otáčkach za minútu pri 4 stupňoch počas 10 minút sa supernatant skoncentroval N2 a zvyšok sa rozpustil v 50 ul metanolu a prefiltroval cez 0,45 μm filter. Desať μl vzorky filtrovanej kvapaliny sa vstreklo do systému HPLC na analýzu.
Štandardná krivka pozostávala zo vzoriek obsahujúcich 50, 100, 250, 500 a 750 ng/ml ECH(Echinakozid z cistanche)(Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd, Sichuan, Čína). Vzorky na kontrolu kvality plazmy obohatené o 75 ng/ml (nízka), 150 ng/ml (stredná) a 300 ng/ml (vysoká) ECH boli podľa toho pripravené na meranie presnosti a presnosti metódy.
Chromatografia sa uskutočnila pomocou systému HPLC (D2{{1{12}}}}}00 Elite series, Hitachi, Japonsko) spojenom s UV detektorom (L-2400, Hitachi, Japonsko). Separácia sa uskutočnila na Thermo-C18 (250 mm x 4,6 mm vnútorný priemer, 4,6 um častice) kolóne udržiavanej pri 25 stupňoch. Mobilnou fázou bol gradient pripravený z 0,1 % kyseliny fosforečnej s obsahom 0,04 % trimetylamínu (zložka A) a metanolu (zložka B). Lineárny gradient bol nasledujúci: 70 – 90 percent A počas 0-2 min, 60 – 70 percent A počas 2 – 6 min, 55 – 60 percent B počas 6 – 8 min a potom sa vrátil na 90 percent A po 8 min ihneď. Prietok bol 0,8 ml/min. UV detektor pracoval pri 332 nm. Oblasť píku bola vyhodnotená ako analytické meranie.
Farmakokinetické štúdie na myšiach. Prienik ECH(Echinakozid z cistanche)do hypotalamu a semenníkov bola podrobená farmakokinetickej analýze pomocou softvéru Drug and Statistics (Drug and Statistics, Mathematical Pharmacology Professional Committee of China). Farmakokinetické parametre boli stanovené pomocou nekompartmentovej metódy založenej na teórii štatistického momentu. Predbežné farmakokinetické parametre vrátane času do dosiahnutia maximálnej konštanty (Tmax), maximálnej koncentrácie (Cmax), konštanty rýchlosti eliminácie (Ke), polčasu eliminácie (T0.5), plochy pod krivkou (AUC{ {4}}–12), zdanlivý distribučný objem (Vc) a klírens (CL) sa získali na ďalšiu analýzu. Pomery mozog/plazma sa vypočítali na základe hodnôt AUC0-t pre plazmu a mozog.
Syntéza a identifikácia ECH-ovalbumínu (ECH-OVA). Celkom 9,8 mg ECH(Echinakozid z cistanche)a 1 0 mg anhydridu butándiolu sa rozpustilo v 2 ml pyridínu, miešalo sa 12 hodín za miešania pri teplote miestnosti. Zmes sa zahustila pomocou N2 a zvyšok sa spojil s 10,8 mg N-hydroxysukcínimidu (NHS) a 19,3 mg dicyklohexylkarbodiimidu (DCC) a rozpustil sa v 4 ml N,N-dimetylformamidu (DMF) počas 12 hodín za miešania pri teplote miestnosti. . Po centrifugácii pri 2,{14}} g počas 5 minút pri 4 stupňoch sa supernatant pridal do 5 ml PBS, v ktorom sa rozpustilo 14,4 mg ovalbumínu (OVA). Nová zmes sa miešala 24 hodín pri 4 stupňoch. Reakčný roztok sa potom dialyzoval proti PBS počas troch dní. Prítomnosť ECH-OVA bola potvrdená UV spektrom (Shimadzu Scientifc Instruments, Inc. Columbia, MD USA) pri vlnovej dĺžke v rozsahu od 190 do 400 nm, ako aj denaturáciou PAGE.
Nepriama ELISA (iELISA). Mikrotitračná doštička bola potiahnutá ECH-OVA (2 ug/100 ul) a inkubovaná cez noc pri 4 stupňoch. Platňa sa premyla trikrát s PBST a dvakrát s PBS; a pridalo sa 5 percent PBSM (PBS obsahujúci 5 percent odstredeného mlieka), aby sa blokovali nenaviazané miesta pri 37 stupňoch počas 2 hodín. Po premytí doštičiek PBST a PBS sa jamky rozdelili do 4 skupín; experimentálna skupina, 1 ug celkového proteínu AR/100 ul; pozitívna skupina, králičia anti-OVA protilátka (1:1,000); negatívna skupina, 1 ug hovädzieho sérového albumínu; a prázdna skupina obsahujúca PBS. Po inkubácii počas 1,5 hodiny sa doštičky premyli a do pozitívnej skupiny sa pridalo 100 ul/jamku králičieho IgG konjugovaného s HRP (1:1,000), pridalo sa 100 ul/jamku anti-AR (1:1,000) ostatným skupinám. Po inkubácii počas 1,5 hodiny sa na doštičky pridalo riedenie králičieho HRP-konjugovaného IgG (1:5, 000). Po inkubácii pri 37 stupňoch počas 1 hodiny sa doštičky premyli trikrát PBST a dvakrát PBS. Potom sa pridal TMB a inkuboval sa 10 minút v tme pri teplote miestnosti a na zastavenie reakcie sa pridala 2 M H2S04. Absorbancia sa odčítala pri vlnovej dĺžke 450 nm.
Molekulárne dokovanie. Uskutočnila sa štúdia molekulového dokovania, aby sa preskúmal väzbový režim zlúčeniny ECH(Echinakozid z cistanche)na ľudský androgénny receptor (AR) pomocou Autodock vina 1.1.2 (http://vina.scripps.edu). Trojrozmerná (3D) štruktúra AR (PDB ID: 2YHD) bola stiahnutá z Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/hone.do). 3D štruktúra ECH bola získaná softvérom ChemBioDraw Ultra 14.0 a ChemBio 3D Ultra 14.0. Na generovanie vstupných súborov dokovania bol použitý balík AutoDockTools 1.5.6 (http://mgltools.scripps.edu). Vyhľadávacia mriežka AR bola identifikovaná ako stred x: 36,141, stred y: 8,513 a stred z:
21.304 s rozmermi veľkosť x: 15, veľkosť y: 15 a veľkosť z: 15. Hodnota úplnosti bola nastavená na 20. Pre dokovanie Vina boli použité predvolené parametre, ak to nebolo uvedené. Najlepšia póza podľa hodnotenia Vina dokovacieho skóre bola vybraná a vizuálne analyzovaná pomocou softvéru PyMOL 1.7.6 (http://www.pymol.org).
Analýza dát a štatistické metódy. Údaje boli analyzované pomocou štatistického softvéru SPSS 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Na porovnanie medzi skupinami sa použila jednosmerná ANOVA. Boli stanovené Tukeyho porovnávacie testy významných rozdielov medzi skupinami. Výsledky boli vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka (SD) s použitím softvéru Graph Pad Prism v.7 (GraphPad Software, Inc, Kalifornia, USA).
Etický súhlas a súhlas s účasťou. Etický súhlas pre túto štúdiu získal Etický výbor Technologického inštitútu Anyang.
Referencie
1. Cano, SN, Misra, M. & Ackerman, KE Cvičenie, tréning a os hypotalamus-hypofýza-gonáda u mužov a žien.Pred. Horm. Res. 47, 27 – 43 (2016).
2. Papadopoulos, V. & Miller, WL Úloha mitochondrií v steroidogenéze. Najlepšia prax. Res. Cl. En. 26, 771 – 790 (2012).
3. Rone, MB a kol. Identifikácia dynamického mitochondriálneho proteínového komplexu, ktorý riadi import cholesterolu, obchodovanie a metabolizmus na steroidný hormón. Mol. Endocrinol. 26, 1868–1882 (2012).
4. Shibari, S., Ylonen, H. & Palme, R. Vylučovanie a meranie kortikosterónu a metabolitov testosterónu u hrabošov (Myodes glareolus). Gen. Comp. Endocrinol. 243, 39 – 50 (2017).
5. O'Hara, L. a kol. Signalizácia hypofýzového androgénneho receptora reguluje prolaktín, ale nie gonadotropíny u samcov myši. PloS jedna. 10, e0121657 (2015).
6. Amador, AG, Parkening, TA, Beamer, WG, Bartke, A. & Collins, TJ Testikulárne LH receptory a hladiny cirkulujúceho hormónu v troch myších modeloch pre dedičné choroby (Tfm/y, lit/lit a hyt/hyt). Endocrinol. Exp. 20, 349-58 (1986).
7. Bulldan, A., Dietze, R., Shihan, M. & Scheiner-Bobis, G. Neklasická testosterónová signalizácia sprostredkovaná prostredníctvom ZIP9 stimuluje expresiu klaudínu a tvorbu tesných spojení v Sertoliho bunkách. Bunka. Signál. 28, 1075 – 85 (2016).
8. Walker, WH Testosterónová signalizácia a regulácia spermatogenézy. Spermatogenéza. 1, 116 – 20 (2011).
9. Cao, C. & Kindscher, K. The Medicinal Chemistry of Echinacea Species (ed. Kindscher, K.) 127–145 (Springer, 2016).
10. Jiang, ZH, Jian, W., Li, XP & Zhang, XYEchinakozidaCistanche tubulosa (Schenk) R. Wight zlepšuje poškodenie semenníkov a spermií vyvolané bisfenolom A u potkanov prostredníctvom steroidogénnych enzýmov regulovaných osou gonád. J. Ethnopharmacol. 193, 321 – 328 (2016).
