Časť 2|Hyperaktivita kinázy glykogénsyntázy 3b v močových exfoliovaných bunkách predpovedá progresiu diabetickej obličkovej choroby

Kliknite sem pre časť 1

Pre viac informácií kontaktujte:emily.li@wecistanche.com

DISKUSIA

V Spojených štátoch a iných západných krajinách zostáva DKD vedúcou etiológiou progresívneho ochoreniachronické ochorenie obličieka predstavuje veľkú záťaž pre štátnu pokladnicu a systémy zdravotnej starostlivosti, pričom zatiaľ nie je k dispozícii žiadna definitívna liečba.5 Dlho sa uznáva, že nie u všetkých pacientov s diabetom sa rozvinie DN.5 V závislosti od skúmanej kohorty sa odhaduje, že DN postihuje 30 až 50 percent diabetických pacientov. Opatrenia prijaté súčasnou klinickou praxou na identifikáciu diabetických pacientov s rizikom rozvoja DKD sa do značnej miery obmedzujú na očné vyšetrenia na retinopatiu a analýzu moču na albuminúriu.5 Konvergujúce epidemiologické dôkazy však naznačujú, že extrarenálna mikrovaskulopatia alebo albuminúria sú vo významnom rozpore s následnou progresiou DKD.12,13,26,27 Preto existuje naliehavá potreba vyvinúť nový biomarker na presnú stratifikáciu diabetických pacientov s rizikom DN. Táto štúdia po prvýkrát uvádza, že GSK3b je nadmerne exprimovaný a hyperaktívny v parenchýmeobličkybunky v experimentálnej aj klinickej DN, spojené sprogresia ochorenia obličiek. Okrem toho je hyperaktivita GSK3b v močových exfoliovaných bunkách pravdepodobne schopná predpovedať progresiu DN.

Cistanche tubulosa zabraňuje ochoreniu obličiek, kliknite sem a získajte vzorku

GSK3b, vysoko konzervovaná, redoxne citlivá serín/treonín-proteínkináza, je centrálne zapojená do inzulínovej signalizácie, ako aj do množstva ďalších bunkových signálnych dráh, ktoré sú kľúčové pre patofyziologické procesy súvisiace sobličkyzranenie, oprava a regenerácia. V tkanivách citlivých na inzulín, ako sú pečeň a kostrové svaly, je GSK3b aktívny za základných podmienok a potláča aktivitu glykogénsyntázy.19,28 Inzulín rýchlo inaktivuje GSK3b prostredníctvom inhibičnej fosforylácie na seríne 9, čo vedie k biosyntéze glykogénu. Rastúci počet dôkazov naznačuje, že dysregulácia GSK3b je spojená s diabetes mellitus 2. typu.19,29–31 V skutočnosti existujú údaje naznačujúce nadmernú expresiu a hyperaktivitu GSK3b vo svaloch diabetických pacientov31–33 a v tukovom tkanive obéznych diabetických myší.34 Navyše transgénna nadmerná expresia GSK3b v kostrových svaloch myší spôsobuje zhoršenú glukózovú toleranciu, inzulínovú rezistenciu a hyperinzulinémiu. napodobňujú pôsobenie inzulínu v bunkových líniách a tkanivách.37 Okrem toho u obéznych diabetických myší inhibítory GSK3 zlepšili citlivosť na inzulín a homeostázu glukózy.38obličkysa tradične nepovažuje za cieľový orgán účinku inzulínu. Presvedčivé dôkazy však nedávno naznačili, že inzulínová signalizácia vobličkybuniek, najmä v podocytoch, hrá kľúčovú úlohu pri udržiavaní glomerulárnej aobličkyhomeostáza.39–41 Defektná inzulínová signalizácia v podocytoch v dôsledku nedostatku inzulínu alebo rezistencie je pravdepodobne kľúčovým iniciátorom mnohých patologických lézií pozorovaných pri DN. Okrem toho klinické štúdie ukázali, že inzulínová rezistencia koreluje s nástupom a závažnosťou albuminúrie dokonca aj u normotenzných pacientov, ktorí nemajú diabetes, čo naznačuje, že inzulínová rezistencia ako taká môže spôsobiť albuminúriu.42 Podobne myši s podocytovo špecifickou inzulínovou rezistenciou, dosiahnutou podmienený knockout inzulínového receptora v glomerulárnych podocytoch, rozvinutá albuminúria a glomerulárne lézie, ktoré rekapitulujú DN, napriek absencii hyperglykémie alebo diabetu.41 Naopak, u diabetických zvierat sú inzulínové senzibilizátory schopné spomaliť progresiu DN nezávisle od glykemickej kontroly.43 Tieto zistenia naznačujú, že inzulínová signalizácia reguluje funkciu podocytov nezávisle od hladín glukózy v krvi. Avšak ako kľúčový prevodník inzulínovej signálnej dráhy bola úloha GSK3b v patogenéze a progresii DN značne nedostatočne preskúmaná.

VobličkyGSK3b je prevažne exprimovaný v podocytoch a v menšom rozsahu v mezangiálnych a endotelových bunkách v glomerulus20,21 a extenzívne exprimovaný renálnymi tubulárnymi bunkami. Existujú údaje z našej a iných skupín, ktoré naznačujú, že GSK3b sprostredkuje autonómne poškodenie podocytov integráciou viacerých podocytových topatických signálnych dráh.17,20,44,45 Nekonzistentnosť, genetická alebo farmakologická blokáda GSK3b môže chrániť pred poškodením podocytov a zmierniť proteinúriu na zvieracích modeloch rôznych nediabetických glomerulopatiách.21 Navyše pri progresívnomchronickýobličkychorobaZistilo sa, že GSK3b je modulátorom renálneho tubulárneho a intersticiálneho poškodenia. Avšak to, či a ako sa GSK3b podieľa na DN, bolo neisté a intenzívne kontroverzné, aj keď táto štúdia ukázala, že zvýšená aktivácia GSK3b vobličkya v močových exfoliovaných bunkách môže byť spojená s rozvojom alebo progresiou DKD. Napríklad u potkanov s diabetom vyvolaným streptozotocínom Lin a kol.46 zistili, že inhibícia GSK3b kompetitívnym inhibítorom adenozíntrifosfátu (20 Z,30 E)-6- bróm v indirubín-30 -oxíme ( BIO) zmiernil proteinúriu a zlepšil glomerulárne lézie DN v neprítomnosti korekcie hyperglykémie, čo naznačuje, že GSK3b hrá pri DN škodlivú úlohu. Tiež u potkanov s diabetom vyvolaným streptozotocínom Paeng a spol.22 urobili podobné zistenia pomocou BIO a dospeli k záveru, že zvýšená aktivita GSK3b v podocytoch za diabetických podmienok je spojená s apoptózou podocytov a stratou DN. To je v súlade s ďalšou in vitro štúdiou, kde sa zistilo, že GSK3b sprostredkuje dediferenciáciu a poškodenie podocytov po vystavení médiu s vysokým obsahom glukózy.47 Naopak, Mariappan a kol.48 tvrdili, že aktivácia GSK3b namiesto toho zmierňuje diabetes vyvolanýobličkyzranenie. Vo svojej štúdii boli diabetické myši vyvolané streptozotocínom liečené nitroprusidom sodným, donorom oxidu dusnatého, ktorý je schopný aktivovať GSK3b. Zistili, že albuminúria, hypertrofia obličiek a akumulácia extracelulárnej matrice v glomerulách sa všetky zlepšili bez zlepšenia hypertenzie alebo hyperglykémie. Tieto zistenia však ostro protirečia údajom z génovo zacielených knock-in myší s konštitutívne aktívnym GSK3, u ktorých sa vyvinula spontánna albuminúria a poškodenie podocytov.49 Aby sa zosúladili protichodné zistenia, je potrebné venovať pozornosť interpretácii údajov generovaných použitím chemických inhibítorov alebo aktivátorov. z GSK3b. Hoci sa BIO opakovane potvrdilo, že je vysoko selektívnym inhibítorom GSK3b s malou molekulou, nitroprusid sodný nie je špecifickým aktivátorom GSK3b, ale je známe, že má silný hemodynamický účinok,50 ktorý pravdepodobne narúša jeho renoprotektívny účinok na zníženie albuminúrie. diabetické myši. Celkovo, napriek niektorým protichodným údajom, prevládajúce dôkazy majú tendenciu podporovať, že GSK3b je pravdepodobne spojený sobličkyzraneniea proteinúria pri DN. Je potrebné spomenúť niekoľko obmedzení tejto štúdie. Po prvé, predklinické údaje boli obmedzené len na DB/DB myšacie modely. Na určenie zovšeobecniteľnosti úlohy GSK3b vdiabetické poškodenie obličiek, je potrebné overiť zistenia v iných modeloch DN, vrátane modelov DN typu 1. Po druhé, klinické pozorovania tu boli odvodené z retrospektívnych kohort diabetických pacientov s obmedzenou veľkosťou vzorky a relatívne krátkym časom sledovania. Je pravda, že na overenie našich pozorovaní a potvrdenie sily GSK3b v močových exfoliovaných bunkách pri predpovedaní výsledku DKD sú potrebné rozsiahle, prospektívne, randomizované, multicentrické štúdie.

GSK3b, vysoko konzervovaná, redoxne citlivá serín/treonín-proteínkináza, je centrálne zapojená do inzulínovej signalizácie, ako aj do množstva ďalších bunkových signálnych dráh, ktoré sú kľúčové pre patofyziologické procesy súvisiace sobličkyzranenie, oprava a regenerácia. V tkanivách citlivých na inzulín, ako sú pečeň a kostrové svaly, je GSK3b aktívny za základných podmienok a potláča aktivitu glykogénsyntázy.19,28 Inzulín rýchlo inaktivuje GSK3b prostredníctvom inhibičnej fosforylácie na seríne 9, čo vedie k biosyntéze glykogénu. Rastúci počet dôkazov naznačuje, že dysregulácia GSK3b je spojená s diabetes mellitus 2. typu.19,29–31 V skutočnosti existujú údaje naznačujúce nadmernú expresiu a hyperaktivitu GSK3b vo svaloch diabetických pacientov31–33 a v tukovom tkanive obéznych diabetických myší.34 Navyše transgénna nadmerná expresia GSK3b v kostrových svaloch myší spôsobuje zhoršenú glukózovú toleranciu, inzulínovú rezistenciu a hyperinzulinémiu. napodobňujú inzulín

účinok v bunkových líniách a tkanivách.37 Okrem toho u obéznych diabetických myší inhibítory GSK3 zlepšili citlivosť na inzulín a homeostázu glukózy.38 Obličky sa tradične nepovažovali za cieľový orgán účinku inzulínu. Presvedčivé dôkazy však nedávno naznačili, že inzulínová signalizácia v obličkových bunkách, najmä v podocytoch, hrá kľúčovú úlohu pri udržiavaní glomerulárnej a obličkovej homeostázy.39–41 Defektná inzulínová signalizácia v podocytoch z dôvodu nedostatku alebo rezistencie inzulínu je pravdepodobne kľúčovým iniciátorom pre mnohé z patologických lézií pozorovaných pri DN. Okrem toho klinické štúdie ukázali, že inzulínová rezistencia koreluje s nástupom a závažnosťou albuminúrie dokonca aj u normotenzných pacientov, ktorí nemajú diabetes, čo naznačuje, že inzulínová rezistencia ako taká môže spôsobiť albuminúriu.42 Podobne myši s podocytovo špecifickou inzulínovou rezistenciou, dosiahnutou podmienený knockout inzulínového receptora v glomerulárnych podocytoch, rozvinutá albuminúria a glomerulárne lézie, ktoré rekapitulujú DN, napriek absencii hyperglykémie alebo diabetu.41 Naopak, u diabetických zvierat sú inzulínové senzibilizátory schopné spomaliť progresiu DN nezávisle od glykemickej kontroly.43 Tieto zistenia naznačujú, že inzulínová signalizácia reguluje funkciu podocytov nezávisle od hladín glukózy v krvi. Avšak ako kľúčový prevodník inzulínovej signálnej dráhy bola úloha GSK3b v patogenéze a progresii DN značne nedostatočne preskúmaná.

V obličkách je GSK3b prevažne exprimovaný v podocytoch a v menšej miere v mezangiálnych a endotelových bunkách v glomerulus20, 21 a extenzívne exprimovaný renálnymi tubulárnymi bunkami. Existujú údaje z našej a iných skupín, ktoré naznačujú, že GSK3b sprostredkuje autonómne poškodenie podocytov integráciou viacerých patických signálnych dráh podocytov.17,20,44,45 Nekonzistentnosť, genetická alebo farmakologická blokáda GSK3b môže chrániť pred poškodením podocytov a zmierniť proteinúriu na zvieracích modeloch rôznych nediabetických glomerulopatiách.21 Navyše pri progresívnej chronickejobličkychorobaZistilo sa, že GSK3b je modulátorom renálneho tubulárneho a intersticiálneho poškodenia. Avšak to, či a ako sa GSK3b podieľa na DN, bolo neisté a intenzívne kontroverzné, aj keď táto štúdia ukázala, že zvýšená aktivácia GSK3b v obličkách a v močových exfoliovaných bunkách môže byť spojená s vývojom alebo progresiou DKD. Napríklad u potkanov s diabetom vyvolaným streptozotocínom Lin et al.46 zistili, že inhibícia GSK3b kompetitívnym inhibítorom adenozíntrifosfátu (20 Z,30 E)-6- bróm v indirubín-30 -oxíme ( BIO) zmiernil proteinúriu a zlepšil glomerulárne lézie DN v neprítomnosti korekcie hyperglykémie, čo naznačuje, že GSK3b hrá pri DN škodlivú úlohu. Tiež u potkanov s diabetom vyvolaným streptozotocínom Paeng a spol.22 urobili podobné zistenia pomocou BIO a dospeli k záveru, že zvýšená aktivita GSK3b v podocytoch za diabetických podmienok je spojená s apoptózou podocytov a stratou DN. To je v súlade s ďalšou in vitro štúdiou, kde sa zistilo, že GSK3b sprostredkuje dediferenciáciu a poškodenie podocytov po vystavení médiu s vysokým obsahom glukózy.47 Naopak, Mariappan a kol.48 tvrdili, že aktivácia GSK3b namiesto toho zmierňuje diabetes vyvolanýobličkyzranenie. Vo svojej štúdii boli diabetické myši vyvolané streptozotocínom liečené nitroprusidom sodným, donorom oxidu dusnatého, ktorý je schopný aktivovať GSK3b. Zistili, že albuminúria, hypertrofia obličiek a akumulácia extracelulárnej matrice v glomerulách sa všetky zlepšili bez zlepšenia hypertenzie alebo hyperglykémie. Tieto zistenia však ostro protirečia údajom z génovo zacielených knock-in myší s konštitutívne aktívnym GSK3, u ktorých sa vyvinula spontánna albuminúria a poškodenie podocytov.49 Aby sa zosúladili protichodné zistenia, je potrebné venovať pozornosť interpretácii údajov generovaných použitím chemických inhibítorov alebo aktivátorov. z GSK3b. Hoci sa BIO opakovane potvrdilo, že je vysoko selektívnym inhibítorom GSK3b s malou molekulou, nitroprusid sodný nie je špecifickým aktivátorom GSK3b, ale je známe, že má silný hemodynamický účinok,50 ktorý pravdepodobne narúša jeho renoprotektívny účinok na zníženie albuminúrie. diabetické myši. Celkovo, napriek niektorým protichodným údajom, prevládajúce dôkazy majú tendenciu podporovať, že GSK3b je pravdepodobne spojený sobličkyzraneniea proteinúria pri DN. Pár obmedzení

je potrebné spomenúť súčasnú štúdiu. Po prvé, predklinické údaje boli obmedzené iba na myšacie modely dB / dB. Na určenie zovšeobecniteľnosti úlohy GSK3b vdiabetické poškodenie obličiek, je potrebné overiť zistenia v iných modeloch DN, vrátane modelov DN typu 1. Po druhé, klinické pozorovania tu boli odvodené z retrospektívnych kohort diabetických pacientov s obmedzenou veľkosťou vzorky a relatívne krátkym časom sledovania. Je pravda, že na overenie našich pozorovaní a potvrdenie sily GSK3b v močových exfoliovaných bunkách pri predpovedaní výsledku DKD sú potrebné rozsiahle, prospektívne, randomizované, multicentrické štúdie.

V súhrne naše štúdie preukázali, že renálna expresia a aktivita GSK3b sú zosilnené v experimentálnej a klinickej DN. Aktivita GSK3b v močových exfoliovaných bunkách môže slúžiť ako nový biomarker na predpovedanie progresie DN. Naše údaje môžu pripraviť pôdu pre rozsiahle, hĺbkové vyšetrenie hodnoty, ktorú GSK3b v močových exfoliovaných bunkách môže slúžiť ako prognostický biomarker DN.

METÓDY

Štúdie na zvieratách

Štúdie na zvieratách boli schválené Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť o zvieratá a sú v súlade s predpismi Ministerstva poľnohospodárstva USA a Príručkou pre starostlivosť o ľudí a používanie laboratórnych zvierat Národného inštitútu zdravia. Samce DB/DB myší a kontrolné db/m súrodence vo veku 6 týždňov boli zakúpené od NanjingUniversity Model Animal Research Center (Nanjing, Čína) a umiestnené v Central Animal Facility Zhengzhou University. Všetky myši boli kŕmené ad libitum a 8 až 10 myší bolo usmrtených v uvedenom veku. Vzorky moču a krvi sa odoberali v uvedených časových bodoch. Po usmrtení sa odobrali obličky na ďalšie vyšetrenie. Hladiny albumínu v moči sa merali pomocou kvantifikačnej súpravy na kvantifikáciu myšieho albumínu s enzýmom spojeným s imunosorbentom (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Hladiny kreatinínu v moči boli stanovené pomocou súpravy na stanovenie kreatinínu (BioAssay Systems, Hayward, CA).

Bunková kultúra

Podmienečne imortalizované myšacie podocyty medzi pasážami 21 a 25 sa kultivovali v médiu Roswell Park Memorial Institute 1640 doplnenom 10 percentným fetálnym hovädzím sérom za permisívnych podmienok, ako bolo opísané vyššie.22 Subkultúry podocytov sa podrobili nepermisívnym podmienkam na vyvolanie diferenciácie počas 14 dní a potom sa vystaví normálnemu prostrediu/kultivačnému médiu, ktoré obsahuje 5 mM glukózy, diabetickému prostrediu pozostávajúcim z glukózy (25 mM) a transformujúceho rastového faktora b1 (2 ng/ml) alebo kontrolnému médiu s vysokou osmolalitou, ktoré obsahuje 20 mM manitol počas 48 hodiny. Myšie proximálne tubulárne epitelové bunky a myšie glomerulárne mezangiálne bunky sa udržiavali v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu/F12 doplnenom 5 percentami fetálneho hovädzieho séra. Bunky boli nanesené pri 70 % konfluencii v médiu obsahujúcom 5 % fetálneho bovinného séra na 24 hodín a potom podrobené sérovému hladovaniu počas ďalších 24 hodín, po čom nasledovalo vystavenie normálnemu prostrediu/kultivačnému médiu, ktoré obsahovalo 5 mM glukózy, diabetické prostredie pozostávajúce z vysokej glukóza (25 mM) a transformačný rastový faktor bl (2 ng/ml), alebo kontrolné médium s vysokou osmolalitou obsahujúce 5 mM glukózu a 20 mM manitol počas 48 hodín. Životaschopnosť buniek bola hodnotená vylúčením trypánovej modrej. V uvedených časových bodoch boli bunky fixované alebo bunkové lyzáty zozbierané na ďalšie skúmanie.

Prechodná transfekcia vektorov

Vektory kódujúce prázdny vektor alebo hemaglutinínom (HA)-značený konštitutívne aktívny (S9A) mutant (S9A-GSK3b-HA/pcDNA3) GSK3b poskytol Dr. Gail VW Johnson (Birmingham, AL) a boli transfekované do kultivovaných podocytov, mezangiálne bunky a tubulárne epitelové bunky s použitím Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA), ako už bolo opísané.44 Účinnosť transfekcie bola overená imunofluorescenčným farbením alebo imunoblotovaním pre HA po 12 hodinách. Bunky sa následne zozbierali a pripravili na analýzu Western blot alebo iné testy.

RNAi

Súbor 3 malých interferujúcich duplexov RNA špecifických pre GSK3b – 50-CUUGUCCUGUAGAACUUUCtt-30, 50-AUGAUCCAUUUCCAAUCACtt{6}} a 50-AUACCGCAGUCGGACUAUGtt{8}} — boli navrhnuté a syntetizované podľa kompletnej kódujúcej sekvencie myšacieho génu GSK3b (GenBank prírastkové č. BC060743.1). Okrem toho sa ako kontrola pre RNAi použila zmiešaná malá, interferujúca sekvencia RNA (50-GCGAGUAGCGCUAGGAAGUtt-30) bez sekvenčnej podobnosti s akýmikoľvek známymi génovými sekvenciami z myší, potkanov alebo ľudí. Účinnosť umlčania génov sprostredkovaného lipofektamínom (Invitrogen, Carlsbad, CA) bola hodnotená imunoblotovou analýzou pre GSK3b. Uspokojivé potlačenie expresie proteínu GSK3b sa pozorovalo v kultivovaných podocytoch, mezangiálnych bunkách a tubulárnych epitelových bunkách 24 hodín po RNAi. Bunky sa potom podrobili normálnemu prostrediu/kultivačnému médiu, diabetickému prostrediu alebo kontrolnému médiu s vysokou osmolalitou počas 48 hodín, ako je uvedené vyššie, predtým, ako boli bunky spracované na ďalšie testy.

Klinické štúdie

Klinická časť tejto štúdie bola v súlade s etickými usmerneniami Helsinskej deklarácie z roku 1975 a bola schválená Inštitucionálnou revíznou radou Prvej pridruženej nemocnice univerzity Zhengzhou. Účastníci výskumu na ľuďoch neboli špecificky prijatí do tejto štúdie. Všetky klinické údaje boli zhromaždené retrospektívnym prehľadom grafov a vyšetrením archivovaných tkanivových rezov alebo vzoriek moču. Nadmerné alebo vyradené vzorky biopsie obličky, ako aj frakcionované vzorky moču, boli bežne uložené v Inštitúte nefrológie prvej pridruženej nemocnice Zhengzhou University. Archivované neidentifikované vo formalíne fixované tkanivá obličkovej biopsie zaliate v parafíne od pacientov v rôznych štádiách DN boli náhodne vybrané na vyšetrenie. Ďalšie vzorky obličiek bez histomorfologických lézií boli získané z obličiek vyradených na transplantáciu kvôli vaskulárnym anomáliám alebo z tkanív predimplantačnej biopsie a slúžili ako normálne kontroly. V rámci retrospektívnej kohortovej štúdie bolo na zaradenie do tejto štúdie retrospektívne vyšetrených celkovo 127 pacientov s diabetes mellitus 2. typu, ktorí boli od roku 2010 sledovaní bankovými vzorkami frakcionovaného moču. Študovaní pacienti boli vo veku od 29 do 80 rokov a diagnostikovaný diabetes 2. typu podľa kritérií American Diabetes Association. Kritériá vylúčenia zahŕňali stratu sledovania, nedostatočné informácie,obličkydysfunkcia, or overt proteinuria at baseline, or other superimposed kidney diseases such as acute kidney injury or glomerulopathies. Finally, 60 patients have enrolled in this study for further assessment. All patients had been followed up for >5 rokov. Počas rutinného sledovania boli zdokumentované demografické údaje, ako aj klinické parametre, vrátane pohlavia, veku, komorbidít, liekov, trvania diabetu, krvného tlaku, hladiny glykémie, hladiny kreatinínu v sére, údajov z analýzy moču, UAE a eGFR. Klinickým výsledkom po 5-ročnom sledovaní bola prítomnosť alebo absencia progresie poruchy funkcie obličiek, ktorá bola definovaná buď ako zníženie eGFR o 25 % alebo progresia albuminúrie, ako je indikované eskaláciou závažnosti albuminúrie v rôznych klinických štádiách DN, teda normoalbuminúria, mikroalbuminúria, makroalbuminúria alebo zjavná proteinúria. Všetci pacienti poskytli písomný informovaný súhlas.

Hodnotenie renálnej morfológie a imunohistochemická analýza

V parafíne zaliate formalínom fixované bloky tkaniva myších obličiek boli narezané na 3- mm rezy. Pre všeobecnú histológiu boli rezy spracované na farbenie kyselinou periodickou – Schiff. Imunohistochemické farbenie na GSK3b a p-GSK3b sa uskutočnilo s použitím súpravy VECTASTAIN ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA), ako bolo opísané vyššie.20 Ako negatívna kontrola bola primárna protilátka nahradená neimunitným sérom z rovnakého druhu; nedošlo k žiadnemu zafarbeniu. Morfologické znaky všetkých rezov boli hodnotené jediným pozorovateľom naslepo za asistencie obličkového patológa.

Imunofluorescenčné farbenie

Kultivované bunky alebo zmrazené rezy kryostatu boli fixované a zafarbené primárnymi protilátkami a nasledovala aplikácia sekundárnych protilátok konjugovaných s Alexa Fluor (Invitrogen). Ako negatívna kontrola boli primárne protilátky nahradené preimunitným IgG z rovnakého druhu; nedošlo k žiadnemu zafarbeniu. Nakoniec boli rezy kontrastne zafarbené 40,6-diamidino-2-fenylindolom alebo propídiumjodidom a pripevnené montážnym médiom VECTASHIELD (Vector Laboratories). Pre fluorescenčnú mikroskopiu FL sa všetky rezy analyzovali súčasne, aby sa vylúčili artefakty v dôsledku variabilného rozpadu fluorochrómu. Rezy sa skúmali pomocou fluorescenčného mikroskopu Olympus FL vybaveného digitálnym fotoaparátom Spot II (Olympus, Tokio, Japonsko). Pre dvojfarebné farbenie sa obrázky získavali postupne, aby sa zabránilo interferencii farbiva. Softvér ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) sa použil na následné spracovanie obrázkov, napríklad škálovanie, zlúčenie a kolokalizačnú analýzu.

Počítačová morfometria

Obrazy imunohistochemického farbenia sa zachytili a digitalizovali pomocou počítačového systému na analýzu obrazu pozostávajúceho z digitálneho fotoaparátu s vysokým rozlíšením s nábojovým spojením pripojeného k mikroskopu (Olympus BX41, Olympus) a k počítaču. Obrázky sa zobrazili v pixelovom rozlíšení 1024 768 pixelov (priestorové rozlíšenie, 0,24 mm/pixel). Pre obrazy imunohistochemického farbenia tkanív ľudských obličiek sa na segmentáciu obrazu, stanovenie prahu a meranie intenzity signálu použil softvér ImageJ. Manuálne korekcie boli vykonávané podľa potreby. Celkovo bolo odobratých 10 glomerulov alebo 10 náhodných tubulointersticiálnych polí na morfometrickú analýzu a konečné údaje boli vyjadrené ako hodnota integrovanej hustoty pixelov vzhľadom na kontrolnú skupinu.

Western imunoblotová analýza

Kultivované bunky boli lyzované;obličkytkanívalebo izolované obličkové glomeruly sa homogenizovali v rádioimunoprecipitačnom testovacom pufri doplnenom proteázovými inhibítormi a vzorky sa spracovali na imunoblotovú analýzu. Na imunoblotovú analýzu obmedzeného počtu exfoliovaných buniek v moči bol protokol Western blotu upravený, ako bolo opísané vyššie, použitím vysokovýkonných NuPAGE Bis-Tris gélov (Invitrogen) a vysokokvalitných prenosových membrán.25 Prepracované imunoblotovanie by mohlo detegovať stredne exprimované proteíny už v 1000 bunkách. Protilátky proti GSK3b, fibronektínu, kolagénu IV, aktínu a glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáze (GAPDH) boli zakúpené od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); tie proti synaptopodínu boli zakúpené od PROGEN Biotechnik GmbH (Heidelberg, Nemecko); a tie proti ZO-1 a p-GSK3b boli získané od Cell Signaling Technology (Danvers, MA).

Štatistická analýza

All in vitro studies were repeated 3 to 6 times. For immunoblot analysis, bands were scanned and the integrated pixel density was determined using a densitometer and the ImageJ analysis program, version 1.48 (National Institutes of Health). Data were expressed as mean -SD or median (interquartile range). All included patients had baseline data. Patients with missing data or lost to follow-up were excluded from this study. Continuous variables were analyzed as appropriate by using the t-test, Mann-Whitney U test, or 1-way analysis of variance (ANOVA) followed by the Student-NewmanKeuls test if there were 3 comparisons or by the Scheffé test if there were >3 prirovnania. Kategorické údaje sa porovnávali medzi skupinami pomocou chí-kvadrát testu. Lineárna regresná analýza sa použila na preskúmanie možných vzťahov medzi 2 parametrami. Uskutočnili sa jednorozmerné Coxove regresné analýzy proporcionálnych rizík, aby sa posúdili súvislosti medzi relevantnými premennými a rizikom progresie poruchy funkcie obličiek, po ktorých nasledovali viacrozmerné analýzy s ohľadom na potenciálne mätúce faktory. Uskutočnila sa analýza ROC krivky a zmerali sa oblasti pod ROC krivkami, aby sa analyzovala sila určitých premenných pri predpovedaní progresie poruchy funkcie obličiek u diabetických pacientov. Nenormálne distribuované premenné, ako napríklad Spojené arabské emiráty, boli transformované logaritmom, aby sa dosiahla normalita pre Coxovu regresnú analýzu proporčných rizík pre analýzy ROC krivky. Všetky štatistické analýzy sa uskutočnili s použitím PSS verzie 22 (IBM Corporation, Armonk, NY). P hodnoty<0.05 in2-tailed="" tests="" were="" considered="" statistically="" significant="" in="" all="">

DISCLOSURE

Všetci autori nedeklarovali žiadne konkurenčné záujmy.

POĎAKOVANIE

Časť tejto štúdie bola prezentovaná ako ústna prezentácia na KidneyWeek 2016: Výročné stretnutie American Society of Nephrology, 15. – 20. novembra 2016, Chicago, IL. RG čiastočne podporila nadácia pre zdravie. XL bol podporený výskumným štipendiom, aby mohol absolvovať extramurálny tréning. ZL bol podporený grantmi National NaturalScience Foundation of China U1604284, 81770672 a 81873612. Donori nezohrávali žiadnu úlohu pri navrhovaní a vykonávaní tejto štúdie, zbere a interpretácii údajov alebo príprave a schvaľovaní rukopisu.

AUTORSKÉ PRÍSPEVKY

RG vymyslel koncepčné myšlienky. XL, ZL a RG prispeli k dizajnu štúdie. XL, PW, BC, YG, AYG a BF uskutočnili experimenty s bunkovou kultúrou. XL a ZL vykonali pokusy na zvieratách a zhromaždili údaje od diabetických pacientov. XL, LJW, DKM, LDD, ZL a prispeli do diskusie a interpretácie výsledkov. prevzal vedenie pri písaní rukopisu. XL, BC a BF prispeli k úprave rukopisu. Všetci autori sa zhodli, že celý koncept a vlastníctvo tohto diela patrí RG. Všetci autori schválili konečný rukopis.

DOPLNKOVÝ MATERIÁL

Doplnkové metódy.

Tabuľka S1. Charakteristika kontrolných subjektov a pacientov s diabetickou nefropatiou, stratifikovaných podľa histologických tried diabetickej nefropatie. Tabuľka S2. Východiskové demografické, klinické a laboratórne údaje retrospektívnej kohorty diabetických pacientov v počiatočnom štádiu bez známok DKD. Tabuľka S3. Demografické, klinické a laboratórne údaje pacientov s diabetom 2. typu v počiatočnom štádiu, stratifikované podľa ich renálnych výsledkov po 5 rokoch sledovania. Obrázok S1. Zvýšená renálna aktivita GSK3b predpovedá vývoj a závažnosťdiabetikobličkychorobau db/db myší. Samce myší db/db a db/m boli sledované vo veku 4 až 13 týždňov. (A) Krv sa odoberala z myší, ktoré neboli nalačno vo veku 4 a 7 týždňov a testovali sa hladiny glukózy v plazme. *P < 0.001="" oproti="" db/m="" myšiam="" vo="" veku="" 7="" týždňov.="" n="" ¼="" 15–18.="" (b)="" bodový="" moč="" bol="" odobratý="" vo="" veku="" 4,="" 7,="" 10="" a="" 13="" týždňov="" a="" podrobený="" testu="" albumínu="" v="" moči="" a="" kreatinínu="" v="" moči="" na="" stanovenie="" pomerov="" albumínu="" ku="" kreatinínu="" v="" moči="" (uacr).="" *p="">< 0,001="" oproti="" db/m="" myšiam="" vo="" veku="" 10="" týždňov="" (n="" ¼="" 15–18);="" #p="">< 0,001="" oproti="" db/m="" myšiam="" vo="" veku="" 13="" týždňov.="" n="" ¼="" 15–18.="" (c)="" všetky="" myši="" dostali="" otvorenú="" renálnu="" biopsiu="" vo="" veku="" 7="" týždňov="" a="" bioptické="" vzorky="" sa="" spracovali="" na="" imunoblotovú="" analýzu="" pre="" p-gsk3b,="" gsk3b="" a="" gapdh.="" (d)="" imunobloty="" sa="" podrobili="" denzitometrickej="" analýze.="" relatívna="" abundancia="" gsk3b="" a="" p-gsk3b="" bola="" stanovená="" ako="" denzitometrické="" pomery="" príslušnej="" molekuly/gapdh="" ako="" násobok="" zmien="" v="" porovnaní="" s="" kontrolnými="" db/m="" myšami.="" relatívna="" aktivita="" gsk3b="" sa="" vypočítala="" ako="" pomery="" p="" gsk3b="" ku="" gsk3b="" ako="" násobky="" kontrolných="" db/m="" myší.="" (e)="" lineárna="" regresná="" analýza="" preukázala="" štatisticky="" významnú="" pozitívnu="" koreláciu="" medzi="" renálnou="" aktivitou="" gsk3b="" vo="" veku="" 7="" týždňov="" u="" db/db="" myší="" a="" rozvojom="" a="" závažnosťou="" albuminúrie,="" charakteristickým="">diabetikobličkychorobavo veku 13 týždňov. R ¼ 0,699; P ¼ 0.0{{20}}1. (F) Analýza prevádzkovej charakteristickej krivky prijímača preukázala, že renálna aktivita GSK3b v skorých štádiách diabetu (7 týždňov veku) poskytuje vynikajúcu presnosť a silu pri predpovedaní vývoja albuminúrie a DKD vo veku 13 týždňov u db/db myší. Obrázok S2. Inzulínová rezistencia a vysoká okolitá glukóza synergicky aktivujú GSK3b v obličkových bunkách. (A) Kultivované myšacie podocyty, (B) močové glomerulárne mezangiálne bunky (MMC) a (C) renálne tubulárne epitelové bunky (TEC) boli transfekované zmiešanými siRNA oligonukleotidmi (siCon) alebo siRNA oligonukleotidmi (siIRb) špecifickými pre b izoformu inzulínový receptor (IRB) na modelovanie stavu inzulínovej rezistencie in vitro. Bunky sa potom vystavili na 48 hodín normálnemu prostrediu s obsahom glukózy (NG) alebo diabetickému prostrediu s vysokým obsahom glukózy (HG). Bunkové lyzáty sa zhromaždili a podrobili imunoblotovej analýze na IRB, p-GSK3b, GSK3b a GAPDH, po ktorej nasledovala denzitometrická analýza blotov. *P < 0,01="" oproti="" expresii="" irb="" v="" bunkách="" ošetrených="" siconom="" vystaveným="" rovnakému="" prostrediu="" (n="" ¼="" 3),="" #p="">< 0,05="" oproti="" expresii="" rovnakého="" proteínu="" v="" skupine="" siirb="" þ="" ng="" alebo="" sicon="" þ="" hg="" (n="" ¼="" 3),="" &p="">< 0,05="" oproti="" rovnakej="" expresii="" proteínu="" v="" druhej="" skupine="" þ="" hg="" alebo="" siirb="" þ="" ng="" (n="" ¼="" 3).="" obrázok="" s3.="" hladiny="" expresie="" gsk3b="" mrna="" vo="" vzorkách="" ľudských="" obličiek="" získaných="" od="" zdravých="" žijúcich="" darcov="" a="" pacientov="" s="" diabetickou="" nefropatiou.="" údaje="" boli="" odvodené="" z="" www.nephroseq.org="" na="" základe="" súboru="" údajov="" ju="" ckd="" glom51="" a="" vyjadrené="" ako="" stredná="" intenzita="" log2.="" obrázok="" s4.="" zvýšená="" aktivita="" gsk3b="" v="" močových="" exfoliovaných="" bunkách="" odobratých="" od="" pacientov="" s="" cukrovkou="" v="" počiatočnom="" štádiu="" predpovedá="" vývoj="" diabetického="" ochorenia="" obličiek.="" (a,="" b)="" detekcia="" gsk3b="" a="" aktivovaného="" gsk3b="" v="" močových="" exfoliovaných="" bunkách="" odobratých="" od="" diabetických="" pacientov="" v="" ranom="" štádiu="" (pts)="" a="" zdravých="" kontrol="" (ctrls).="" urinárne="" exfoliované="" bunky="" boli="" zozbierané="" a="" lyzované.="" bunkové="" lyzáty="" boli="" spracované="" na="" imunoblotovú="" analýzu="" pre="" gsk3b,="" p-gsk3b="" a="" gapdh.="" (c)="" imunobloty="" sa="" podrobili="" denzitometrickej="" analýze.="" relatívna="" abundancia="" gsk3b="" a="" p-gsk3b="" bola="" stanovená="" ako="" denzitometrické="" pomery="" príslušnej="" molekuly/gapdh="" ako="" násobok="" zmien="" v="" porovnaní="" s="" kontrolami="" (ctrl).="" relatívna="" aktivita="" gsk3b="" sa="" vypočítala="" ako="" pomery="" p-gsk3b="" ku="" gsk3b="" ako="" násobky="" normálnej="" kontroly="" (ctrls).="" (d)="" analýza="" prevádzkovej="" charakteristickej="" krivky="" prijímača="" ukázala,="" že="" relatívna="" aktivita="" gsk3b="" (pomer="" p-gsk3b/gsk3b)="" v="" močových="" exfoliovaných="" bunkách="" odobratých="" od="" pacientov="" s="" diabetom="" v="" ranom="" štádiu="" poskytuje="" vynikajúcu="" presnosť="" pri="" predpovedaní="">diabetické ochorenie obličiekza 5 rokov, pričom plocha pod krivkou (AUC) je 0,886.

LITERATÚRA

1. Umanath K, Lewis JB. Aktualizácia o diabetickej nefropatii: Core Curriculum 2018. Am J Kidney Dis. 2018;71:884–895.

2. Gregg EW, Li Y, Wang J, a kol. Zmeny v komplikáciách súvisiacich s cukrovkou v Spojených štátoch, 1990-2010. N Engl J Med. 2014;370:1514–1523.

3. Haller H, Ito S, Izzo JL Jr. a kol. Olmesartan na oddialenie alebo prevenciu mikroalbuminúrie pri cukrovke 2. N Engl J Med. 2011;364:907–917.

4. Schena FP, Gesualdo L. Patogenetické mechanizmy diabetickej nefropatie. J Am Soc Nephrol. 2005;16(dodatok 1):S30–S33.

5. Ritz E, Zeng XX, Rychlík I. Klinická manifestácia a prirodzená anamnéza diabetickej nefropatie. Contrib Nephrol. 2011;170:19–27.

6. Holman RR, Paul SK, Bethel MA, a kol. 10-ročné sledovanie intenzívnej kontroly glukózy u diabetu 2. typu. N Engl J Med. 2008;359:1577–1589.

7. Perkins BA, Ficociello LH, Ostrander BE a kol. Mikroalbuminúria a riziko skorého progresívneho poklesu funkcie obličiek u diabetu 1. J Am Soc Nephrol. 2007;18:1353–1361.

8. Koye DN, Magliano DJ, Reid CM a kol. Riziko progresie normoalbuminurického CKD do konečného štádia ochorenia obličiek u ľudí s diabetom: štúdia CRIC (Chronic Renal Insuficiency Cohort). Am J Kidney Dis. 2018;72:653–661.

9. Caramori ML, Fioretto P, Mauer M. Potreba včasných prediktorov rizika diabetickej nefropatie: je rýchlosť vylučovania albumínu dostatočná? Diabetes. 2000;49:1399–1408.

10. Caramori ML, Fioretto P, Mauer M. Nízka rýchlosť glomerulárnej filtrácie u normoalbuminurických diabetikov 1. typu: indikátor pokročilejších glomerulárnych lézií. Diabetes. 2003;52:1036–1040.

11. Krolewski AS. Progresívny renálny pokles: nová paradigma diabetickej nefropatie pri diabete 1. typu. Diabetes Care. 2015;38:954–962.

12. Robles NR, Villa J, Gallego RH. Neproteinurická diabetická nefropatia. J Clin Med. 2015;4:1761–1773.

13. Adler AI, Stevens RJ, Manley SE, a kol. Vývoj a progresia nefropatie pri diabete 2. typu: britská prospektívna štúdia diabetu (UKPDS 64). Kidney Int. 2003;63:225–232.

14. Gluhovschi C, Gluhovschi G, Petrica L, et al. Močové biomarkery pri hodnotení včasnej diabetickej nefropatie. J Diabetes Res. 2016;2016: 4626125.

15. Doi T, Moriya T, Fujita Y, a kol. Močové IgG4 a Smad1 sú špecifické biomarkery pre renálne štrukturálne a funkčné zmeny v skorých štádiách diabetickej nefropatie. Diabetes. 2018;67:986–993.

16. De S, Kuwahara S, Hosojima M, et al. Exocytózou sprostredkované úplné vylučovanie megalínu močom je spojené s patogenézou diabetickej nefropatie. Diabetes. 2017;66:1391–1404.

17. Xu W, Ge Y, Liu Z a kol. Glykogénsyntáza kináza 3b diktuje motilitu podocytov a obrat fokálnej adhézie moduláciou aktivity paxilínu: dôsledky pre ochranný účinok nízkej dávky lítia pri podocytopatii. Am J Pathol. 2014;184:2742–2756.

18. Ali A, Hoefiich KP, Woodgett JR. Glykogénsyntáza kináza-3: vlastnosti, funkcie a regulácia. Chem Rev. 2001;101:2527-2540.

19. Beurel E, Grieco SF, Jope RS. Glykogénsyntáza kináza-3 (GSK3): regulácia, pôsobenie a choroby. Pharmacol Ther. 2015;148:114–131.

20. Li C, Ge Y, Dworkin L, a kol. Izoforma b GSK3 sprostredkúva autonómne poškodenie podocytov pri proteinurickej glomerulopatii. J Pathol. 2016;239:23.