Časť 2: Mapovanie epigenomickej a transkriptomickej súhry počas formovania a vybavovania pamäti v súbore Hippocampal Engram Ensemble
Mar 15, 2022
pre viac informácií:{0}}
Odlišné transkripčné programy engramových súborov počas vytvárania a vybavovania pamäte
Aby sme objasnili, ako zmeny v dostupnosti chromatínu a interakcie promótor-enhancer ovplyvňujú génovú expresiu, vykonali sme jadrovú RNA-seq (nRNA-seq) zo všetkých neuronálnych subpopulácií. Naša analýza diferenciálne exprimovaného génu (DEG) odhalila nízke množstvo zmien v skorej fáze v porovnaní s neurónmi v bazálnom stave (Basal vs. Early, 88°, obr. 5a, doplnková tabuľka 8). Toto bolo obzvlášť neočakávané vzhľadom na rozsiahly stupeň organizácie chromatínu pozorovaný v tomto časovom bode (obr. 2a). Na rozdiel od toho neuróny z neskorej fázy vykazovali vyšší počet stupňov napriek väčšej podobnosti v dostupnosti chromatínu v týchto časových bodoch (obr. 5a). Aby sme potvrdili naše transkripčné zistenia, porovnali sme naše výsledky s predtým publikovanými údajmi o aktivovaných granulových bunkách DG 1 hodinu po novej expozícii32, 24 hodín po FS20 a po predĺženej stimulácii (6 hodín) myších kultivovaných kortikálnych neurónov pomocou KCl33 (rozšírené údaje, obr. 4a ). Je zaujímavé, že hoci toto porovnanie odhalilo významné prekrývanie medzi upregulovanými génmi z nášho súboru údajov a 1 hodinu po novej expozícii32 (P=0.006) alebo 24 hodín po FS20 (P=0.0005), my nepozorovali žiadne významné prekrývanie s génmi, ktoré boli up-regulované v reaktivovaných engramových bunkách a iných súboroch údajov, čo potvrdzuje jedinečnú transkripčnú krajinu reaktivovaných engramových buniek počas vyvolávania.
Kliknite naVýhody a vedľajšie účinky Cistanche na pamäť
Ďalej sme využili predtým publikovaný výpočtový prístup34, ktorý meria zmeny v čítaní zrelej RNA (exóny) a pre-mRNA (intróny). Ako sa očakávalo, exonické zmeny korelujú s globálnymi transkripčnými zmenami meranými pomocou DEseq2 (čítanie exónu aj intrónu) vo všetkýchPamäťfázy (Rozšírené údaje Obr. 4b). Avšak meranie pomerov exón/intrón naznačuje, že zmenené transkripty (regulované hore a dole) počasPamäťkonsolidácia (skorá vs. neskorá) je poháňaná prevažne intronickými čítaniami, čo naznačuje, že tento transkripčný profil väčšinou odráža nezrelé transkripty, ktoré vyžadujú ďalšie kroky spracovania RNA (rozšírené údaje obr. 4c). Na rozdiel od toho, up-regulované gény počas pripomenutia (neskoré vs. reaktivované) sú prevažne riadené exónovými transkriptmi, čo odráža zrelší stav RNA (rozšírené údaje, obr. 4c).
Aby sme zosúladili nesúlad medzi pozorovanými zmenami chromatínu a transkripčným stavom v každej subpopulácii, vykonali sme korelačnú analýzu DAR a DEG, identifikovaných v rôznych časových bodochPamäťformovanie a odvolanie. Pre túto analýzu boli DAR na nekódujúcich oblastiach (intergénnych a intrónových) mapované na ich príslušné promótory s využitím našich údajov pc-HiC. Celkovo sme zistili nízku koreláciu (P=2,81 × 10−2) medzi rozdielnou dostupnosťou chromatínu a zmenami génovej expresie, ktoré sa vyskytujú v skorej fáze (Basal vs. Early, Extended Data Obr. 4d). Tieto výsledky boli v súlade s predchádzajúcou prácou21 a uvádzali, že modifikácie histónov majú malú koreláciu s transkripčnými zmenami počasPamäťakvizície. Neočakávane sme pozorovali silnejšie prekrývanie a podobnosť medzi zmenami chromatínu, ku ktorým dochádza počasPamäťkódovanie (Skoré) so zmenenou transkripčnou krajinou počas konsolidácie pamäte (Neskoro) a reaktivovanými engramovými neurónmi (P {{0}}.13 × 10−8, 2,42 × 10 −7, rozšírené údaje, obr. 4d). Na ďalšie potvrdenie tejto analýzy sme vykonali Pearsonovu koreláciu medzi hodnotami log2FC z DAR a hodnotami log2FC DEG, ktoré boli anotované do tejto oblasti (intergénne oblasti boli mapované prostredníctvom súboru údajov pc-HiC, rozšírené údaje, obr. 4e, doplnková tabuľka 9) . Naša analýza odhalila, že skoré zmeny chromatínu (bazálne vs. skoré, DAR) významne korelovali s down-reguláciou génov v neskorej fáze (skoré vs. neskoré, rozšírené údaje obr. 4e, sivá čiara, r=− 0.14, p < 0.0001).="" navyše,="" po="" analýze="" stupňov="" na="" intronické="" a="" exonické="" čítania="" sme="" zistili,="" že="" korelácia="" bola="" do="" značnej="" miery="" riadená="" intronickými="" čítaniami="" (intróny="" r="−0,21," p="">< 0,0001,="" exóny="" r="−0,09," p="" {{="" 29}}.02).="" na="" rozdiel="" od="" toho="" skoré="" zmeny="" chromatínu="" (basal="" vs.="" early,="" dars)="" vykazovali="" pozitívnu="" koreláciu="" s="" deg="" z="" reaktivovaných="" buniek,="" ktorá="" bola="" prevažne="" riadená="" exonickými="" čítaniami="" (intróny="" r="−0,007," p="0,73" ,="" exóny="" r="0.11," p="0.04)." tieto="" údaje="" poskytujú="" ďalší="" dôkaz="" o="" primingu="" a="" transkripčnom="" oneskorení,="" pri="" ktorých="" zmeny="" chromatínu,="" ku="" ktorým="" dochádza="" počas="" skorej="" fázy,="" umožňujú="" transkripčné="" zmeny="" pozorované="" v="" neskoršom="" časovom="" bode,="" predovšetkým="" v="" reaktivovaných="" engramových="">
Pamäťkódovanie, konsolidácia a vyvolanie je dynamický proces vyžadujúci niekoľko vĺn oneskorenej génovej transkripcie12,32,33. Preto identifikovať rôzne transkripčné programy vo všetkýchPamäťfázy sme hodnotili expresiu každého génu od neaktivovaných neurónov (bazálne) cez skoré (aktivované skoro), neskoré (aktivované-neskoro) a neuróny, ktoré boli reaktivované počas pripomenutia (reaktivované). Všetky diferenciálne exprimované gény (DEGs, n=1095), ktoré spĺňali hraničné kritériá (p-hodnota < 0.01,="" log2="" (násobná="" zmena)=""> 1), boli nestranne zoskupené (k-priemer) (obr. 5b, c). Boli identifikované štyri hlavné klastre; i) 260 génov
ktoré boli down-regulované v neskorej fáze (Dw-neskorý klaster), ii) 207 génov, ktoré boli upregulované v neskorej fáze (Up-late klaster), iii) 186 génov, ktoré boli upregulované v skorej fáze, a boli udržiavané po celú dobuPamäťfázy (stabilný klaster) a iv) 438 génov
ktoré boli jedinečne upregulované v reaktivovaných neurónoch počasPamäťodvolanie (Reaktivačný klaster). Podobne ako v našom párovom porovnaní, transkripčné zmeny v aktivovaných neskorých neurónoch korelovali vyššie s intrónovými čítaniami a transkripčná krajina reaktivovaných neurónov sa zdá byť zrelšia a predstavovala vyššiu koreláciu s exónovými čítaniami (rozšírené údaje obr. 5a, b).
Ďalej sme vykonali analýzu génovej ontológie (GO) pre každý klaster (obr. 5d), aby sme identifikovali obohatené dráhy v rámci rôznychPamäťfázy. Transkripčný podpis neskorého klastra bol obohatený o gény zapojené do regulácie „funkcie inhibičnej synapsie“, o ktorých sa ukázalo, že zohrávajú úlohu v neurónovej excitabilite35,36 (obr. 5e). V klastri Up-late sme pozorovali súbory génov zapojených do pozitívnej alebo negatívnej regulácie transkripcie, ako je rodina onkogénov muskuloaponeurotického fibrosarkómu v-maf, proteín B (Mafb), rodina slimákov zinkový prst 2 (Snai2) a RE{{ 8}} umlčujúci transkripčný faktor (Rest) (obr. 5e). Zaujímavé je, že sme zistili, že 15 percent (32/207) promótora génu v Dw – neskoršom klastri obsahuje buď Snai2 (p-hodnota - 1 × 10-9) alebo Rest (p-hodnota - 1 × 10−3) väzbové miesta. Táto dynamika transkripčných regulátorov poukazuje na možnú súhru medzi klastrami Dw a Up-late. Predovšetkým sa zistilo, že v rámci jedného existujú funkčne odlišné neurónové súboryPamäťengram, v ktorom súbory závislé od onkogénu osteosarkómu FBJ (Fos) a neuronálneho PAS doménového proteínu 4 (Npas4) podliehajú odlišným synaptickým modifikáciám po CFC a riadia správanie riadené pamäťou v opačných smeroch37. Ukázalo sa, že excitačné synaptické vstupy podporujúPamäťzovšeobecňujúce a inhibičné podporujú rozlišovanie pamäti. Hoci tieto odlišné súbory nebolo možné v súčasnej štúdii rozlíšiť, tieto pozorovania by mohli vysvetliť obojsmernú expresiu pozitívnych alebo negatívnych transkripčných regulátorov, ako aj hore a dole regulovaných génov zapojených do excitability neurónov.
Cistanche môže zlepšiť pamäť
Stabilný klaster bol väčšinou obohatený o transkripty zapojené do cytoskeletu, remodelácie axónov a závislých od hipokampuPamäť38, vrátane ľahkých a ťažkých polypeptidových neurofilamentov (Neal, Neath) a myozínu, ťažkého polypeptidu 10, nesvalového (Myh10) (obr. 5d, e). Na vizualizáciu a sledovanie zmien súvisiacich s cytoskeletom na dendritoch a tŕňoch bol reportér slučky eYFP (závislý od TAM) dodaný adeno-asociovaným vírusom (AAV) do myší DG ofArc-CreERT2 (rozšírené údaje obr. 6a). Naše údaje odhalili, že aktivované-neskoré a reaktivované neuróny obsahujú výrazne vyšší počet húb a tenkých tŕňov (P< 0.0001,="" extended="" data="" fig.="" 6b),="" with="" no="" significant="" changes="" in="" dendritic="" shaft="" diameter="" (p="0.6)," when="" compared="" to="" the="" activated="" -early="">
Jedinečný transkripčný podpis reaktivovaných engramových neurónov (reaktivačný klaster) bol väčšinou charakterizovaný kategóriami „transport/väzba RNA“ a „proteínovými translačnými mechanizmami“ (obr. 5d). Tento transkripčný program zahŕňa zvýšenú expresiu členov rodiny kinezínov 5a a c (Kif5a, Kif5c), iniciáciu eukaryotickej translácie (Eif) faktor 3 podjednotku A, D (3a, 3d), faktor 4 podjednotku H (Eif4h), faktor 5 podjednotku A ( Eif5a) a ribozomálny proteín (Rpl27a, Rpl35, Rpl36, Rps19, Rps24, Rosa) (obr. 5d, e), o ktorých sa predtým uvádzalo, že zohrávajú kľúčovú úlohu pri transporte mRNA do synaptického kompartmentu a autonómnej kontrole lokálnej translácie39 . Na ďalšie potvrdenie týchto zistení na translačnej úrovni sme merali proteínovú expresiu a lokalizáciu troch členov z rodiny Eif pomocou imunohistochémie (IHC). Serval Eif-členovia boli predtým hlásení, že sa špecificky podieľajú na translácii v synaptických kompartmentoch39, a preto sme oddelene analyzovali expresiu proteínov na soma a dendritových hriadeľoch aktivovaných neurónov (obr. 5f). Reaktivované neuróny mali vyššiu expresiu Eif3e proteínov v soma v porovnaní s aktivovanými skorými a neskorými neurónmi (rozšírené údaje, obr. 6c). Na rozdiel od toho bol Eif4e výrazne hojnejší v šachtách reaktivovaných neurónov v porovnaní s aktivovanými skorými a neskorými neurónmi (Ps<0.05, fig.="" 5f),="" providing="" further="" evidence="" for="" increased="" protein="" synthesis="" in="" those="" neurons.="" cistanche="" can="" improve="">Pamäť.
Zvýšený translačný mechanizmus uľahčuje zmeny tvaru, veľkosti a počtu chrbtice, čo vedie k zvýšenej synaptickej plasticite39–41. Okrem toho, tŕne s väčším priemerom hlavy pravdepodobne obsahujú ribozómy na lokálnu syntézu proteínov, väčšie postsynaptické hustoty, ktoré ukotvujú viac AMPA glutamátových receptorov a robia tieto synapsie funkčne silnejšími41,42. V súlade s týmito správami vykazovali reaktivované neuróny vyšší počet zväčšených priemerov hlavy (51 percent zo všetkých hríbových tŕňov) v porovnaní so skupinou aktivovaných neskoro (18 percent) (rozšírené údaje, obr. 6d). Okrem toho sme zistili významné zvýšenie hladín glutamátového receptora 1, ionotropnej, AMPA1 (Gria1) mRNA (rozšírené údaje, obr. 6e), a hladín proteínu Gria1 iba v dendritických šachtách reaktivovaných neurónov v porovnaní s aktivovanými - skorými a - neskoré neuróny (obr. 5g). Súhrnne tieto údaje podporujú hypotézu, že odlišné časovo oddelené transkripčné programy sa synchronizujú, aby sa zachovala excitabilita neurónov, štrukturálne zmeny, translácia proteínov a synaptická plasticita počas životnosti súboru engramov.
Regulačné prvky s opačnými transkripčnými účinkami interagujú s promótormi, keď pamäť postupuje od kódovania k vybavovaniu
Ďalej sme sa pýtali, ako by interakcia medzi promótorom a zosilňovačom s dlhým dosahom a stav chromatínu mohli viesť ku koordinovaným zmenám génovej expresie pozorovaným v každom z transkripčných klastrov. Aby sme to dosiahli, merali sme dostupnosť chromatínu cez zosilňovače, ktoré interagujú s promótormi, z každého transkripčného klastra (obr. 6a–c). Okrem toho sa interakčné skóre týchto zosilňovačov vynieslo spolu proti dostupnosti chromatínu a ich príslušnej génovej expresii (doplnková tabuľka 10).
Cistanche môže zlepšiť pamäť
Celkovo všetky klastre vykazovali významné prírastkové zvýšenie dostupnosti chromatínu na zosilňovačoch. Dôležité je, že sme zistili, že dostupnosť chromatínu nastala pred 3D preskupením chromatínu a zmenou génovej expresie, čo poskytuje ďalšiu podporu transkripčného oneskorenia (obr. 6a–c, rozšírené údaje obr. 7a, b). Konkrétne v reaktivačnom klastri naša analýza odhalila dvojfázový proces, v ktorom raná fázaPamäťtvorba vedie k primingu, kde sa zosilňovače stávajú dostupnejšie, ale nevykazujú očakávané zmeny v génovej expresii. Reaktivácia buniek engram bola spojená s reorganizáciou interakcií promótor-zosilňovač, kde sa aktivované zosilňovače dostali do kontaktu s ich príslušnými promótormi vo vyššej frekvencii a bol pozorovaný transkripčný nárast (obr. 6a–c). Cistanche sa môže zlepšiťPamäť.
Predtým sa predpokladalo, že interakcie promótor-enhancer sú vysoko dynamické a interakcie s odlišnými kombinatorickými zosilňovačmi vedú k smerovej zmene v expresii génu v závislosti od toho, či zosilňovač obsahuje represorové alebo aktivačné motívy14, 18. Cistanche môže zlepšiťPamäť.
Aby sme to ďalej skúmali, použili sme chróm na nezaujatú segregáciu genómu do rôznych stavov definovaných miestami motívu, ktoré viažu buď transkripčné aktivátory1 (včasná rastová odpoveď 1 (Egr1), Ap1), transkripčné represory43,44 (pleiomorfný gén podobný adenómu 1 (Plagl1) ), hypermetylované pri rakovine 2 (Hic2), metyl CpG viažuci proteín 2 (Mecp2), Snai2 a Rest,) alebo TF, ktoré obojsmerne ovplyvňujú transkripciu a podieľajú sa na architektúre 3D genómu25,44,45 (CCCTC-väzbový faktor ( CTCF), E2F transkripčný faktor 1 (E2f), Yy1). Toto identifikovalo tri rôzne kombinatorické stavy TF-väzbových miest (silný represor, bivalentný a silný aktivátor, obr. 6d, e). Je zaujímavé, že klaster so znížením génovej expresie (Dw-neskorá) vykazoval postupne sa zvyšujúcu koreláciu od kódovania po vyhľadávanie so zosilňovačmi, ktoré obsahujú transkripčné represory a bivalentné motívy (obr. 6d, horná teplotná mapa; rozšírené údaje obr. 7c, d). Tieto údaje naznačujú, že napriek pozorovanej dostupnosti chromatínu sú gény down-regulované v dôsledku represie, ktorá sa objavuje z týchto regulačných prvkov. Cistanche sa môže zlepšiťPamäť.
Na rozdiel od toho, v klastri reaktivácie sme pozorovali prírastkové obohatenie o zosilňovače, ktoré obsahujú transkripčné aktivátory spolu s motívmi, ktoré ukotvujú štruktúry slučky (rozšírené údaje obr. 7c, d). Zdá sa teda, že na základe neuronálnej aktivity môže niekoľko promótorov využiť širokú škálu rôznych zosilňovačov na vytvorenie nových interakcií promótor-zosilňovač, ktoré môžu odlišne koordinovať génovú expresiu. V tomto modeli promótory down-regulovaných génov interagujú so zosilňovačmi, ktoré obsahujú transkripčné represory, zatiaľ čo up-regulované gény sú výsledkom interakcií promótor-zosilňovač, ktoré privádzajú transkripčné aktivátory do úzkeho kontaktu s príslušnými promótormi. Súhrnne naše údaje odhaľujú sekvenčné preprogramovanie dostupnosti chromatínu, 3D-genómovú architektúru a interakcie promótor-enhancer počas tvorby engramu (rozšírené údaje, obr. 8).
