ČASŤ Ⅰ: Účinky podmienok prostredia na počet nefrónov
Mar 20, 2022
pre viac informácií:{0}}
ČASŤ Ⅰ: Účinky podmienok prostredia na počet nefrónov: Modelovanie materských chorôb a epigenetická regulácia vo vývoji obličiek
Lars Fuhrmann, Saskia Lindner, Alexander-Thomas Hauser, Clemens Höse a kol.
1. Úvod
Vývoj plodu je ovplyvnený prostredím in utero a nepriaznivé prostredie môže neskôr v živote predisponovať k chorobám, ako je hypertenzia, kardiovaskulárne ochorenie a chronické ochorenie obličiek [1-4]. Rad vnútromaternicových porúch môže viesť k zníženiu zásob nefrónov a zhoršeniu funkcie obličiek u potomstva. U hlodavcov stavy vedúce k zníženiu počtu nefrónov pri narodení zahŕňajú obmedzenie vnútromaternicového rastu (IUGR), nízkobielkovinovú diétu matky, lieky (vrátane kortikosteroidov alebo nesteroidných protizápalových liekov), monogenetické mutácie a nízke hladiny vitamínu A, ako aj cukrovku matky. a nedostatok železa [5-10]. U ľudí v súčasnosti neexistuje žiadna neinvazívna metóda merania počtu nefrónov. Postmortálne štúdie však preukázali negatívnu koreláciu medzi počtom nefrónov a krvným tlakom [4,11]. Okrem toho je známe, že vnútromaternicové stavy spojené so zníženým počtom nefrónov, ako je IUGR, sú spojené so zvýšeným výskytom hypertenzie a CKD (12).
Pokusy in vivo, pri ktorých sa nepriaznivé vnútromaternicové stavy umelo vyvolali u gravidných zvierat, sa ukázali ako neoceniteľné pri detekcii a opise zmien obličiek vyvolaných u potomstva. Akýkoľvek experimentálny zásah počas tehotenstva však vedie ku komplexným zmenám vo fyziológii matky, placenty a plodu, ktoré môžu samotné ovplyvniť prostredie vyvíjajúceho sa metanefroi. Techniky ex vivo modelovania to obchádzajú tým, že umožňujú skúmať vývoj obličiek úplne oddelený od vplyvu matky zvieraťa, placenty alebo iných orgánov plodu. Izolované kultúry metanefroi na rozhraní médium-vzduch pôvodne vykonal Trowell v roku 1950 [13] a následne boli spresnené kultiváciou obličiek na filtračných membránach [14], čím sa vytvoril základ pre kultivačné podmienky s jednou premennou.
Stručne povedané, existuje čoraz viac dôkazov, ktoré naznačujú, že prenatálne urážky spojené s nízkym počtom nefrónov sú relevantné pre rizikové faktory hypertenzie a CKD. Aby bolo možné vyvinúť preventívne stratégie na zabezpečenie adekvátneho vybavenia nefrónov pri narodení, je potrebné mechanické pochopenie faktorov ovplyvňujúcich vývoj obličiek a nefrogenézu. V tejto práci sa metanefrická orgánová kultúra použila na modelovanie rôznych aspektov regulácie životného prostredia na štúdium ich účinkov na rast obličiek a možných dôsledkov na dlhodobú funkciu obličiek a použila sa na skríning epigenetických regulátorov pomocou malých zlúčenín schválených FDA.
Kliknite na produkty Cistanche herba pre funkciu obličiek
2. Výsledky
2.1. Využitie kultúr metanefrických orgánov na štúdium vplyvu podmienok prostredia na vývoj obličiek
Na modelovanie nepriaznivých podmienok prostredia sa obličky z embryí embryonálneho dňa (E) 12,5 kultivovali na rozhraní médium-vzduch (obrázok 1A). Na uľahčenie sledovania vývoja nefrónu a glomerulov, Six2. Cre a Pod. Boli použité Cre duálne fluorescenčné reportérové myši (obrázok 1B, C). Bežným stavom počas tehotenstva je horúčka, ktorá postihuje viac ako 10 percent tehotenstiev počas prvých 16 týždňov tehotenstva [15]Teplo je dobre charakterizovaný teratogén a ukázalo sa, že hypertermia počas tehotenstva vedie k potratu plodu, spomaleniu rastu, a vývojové chyby, ako je agenéza obličiek, hypoplázia a nízka pôrodná hmotnosť u niekoľkých druhov [16-21]. Na posúdenie vplyvu predĺžených hypertermických stavov v rozsahu horúčky na rast obličiek a tvorbu nefrónov boli obličky izolované a udržiavané buď na 37 alebo 40 stupňoch (obrázok 1D). Po 7 dňoch kultivácie boli obličky kultivované pri 40 °C v priemere o 18,36 percent menšie ako ich náprotivky kultivované za fyziologických podmienok (obrázok 1E). Medzi skupinami sa však nezistil žiadny významný rozdiel v počte glomerulov na obličku (obrázok 1F). Znížený celkový rast obličiek však demonštruje negatívny vplyv zvýšenej teploty na rast metanefrík.
Odhaduje sa, že 19 percent tehotných žien trpí anémiou z nedostatku železa [22], nedostatok železa je jedným z najrozšírenejších stavov s potenciálom narušiť vývoj obličiek [23]. Údaje in vivo ukázali, že rast obličiek, počet glomerulov a vychytávanie železa obličkami sú znížené počas tehotenstiev ovplyvnených nedostatkom železa u matky [24]. Aby sa zhodnotil vplyv zníženého prísunu železa viazaného na transferín na rast obličiek a nefrogenézu, explantáty sa kultivovali v médiu obsahujúcom 50 ug/ml železom nasýteného holo-transferínu alebo 50 ug/ml apo-transferínu ochudobneného o železo, resp. Obličky s obmedzeným množstvom železa zostali oveľa menšie ako ich náprotivky s dostatkom železa a vykazovali zvýšenú apoptózu v ureterických púčikoch a znížené vetvenie a proliferáciu ureterických púčikov (obrázok 1G, doplnkový obrázok S1A-F). Zatiaľ čo populácia nefrónov bola morfologicky neovplyvnená, bolo možné pozorovať pokles vyvíjajúcej sa distálnej časti nefrónu, ako aj distálnych tubulov (obrázok 1H, I, doplnkový obrázok S1G-J). Obličky s nedostatkom železa mali v priemere 47,9 percent veľkosti ich náprotivkov kultivovaných holo-transferínom (obrázok 1) a vykazovali zníženie celkového počtu glomerulov na obličku o 69,9 percenta po 7 dňoch v kultúre (obrázok 1K) . Deplécia železa apotransferínom teda vykazovala závažné účinky na rast obličiek s fenotypom úplnej nefrogenézy.
Obrázok 1. Použitie metanefrických orgánových kultúr na štúdium vplyvu podmienok prostredia na vývoj obličiek.(A) Urogenitálny hrebeň z myších embryí E12.5 (ľavý panel) bol mikrochirurgicky extrahovaný (druhý panel) a obličky boli izolované (tretí panel) a umiestnené na vložky Transwell (pravý panel). Mierka∶ 1 mm （ľavý panel）, 500 μm (tretí panel). (B) Transgénne myši s duálnou expresiou Tomato/EGFP sa použili na podmienené označenie Six2-pozitívnych buniek a ich potomkov pomocou Six2. Cre alebo (C) podocin-pozitívne bunky s použitím Pod. Cre myši. (D) Explantáty z rovnakého embrya sa kultivovali 7 dní pri 37 alebo 40 stupňoch. Mierka∶ 500 μm. （E） Povrchové plochy explantátov pestovaných 7 dní pri 37 alebo 40 stupňoch .n=40 párov, párový t-test, priemer ± SD.(F) Počet glomerulov v skupinách s explantátmi po 7 dňoch.n{{ 17}} párov, párový t-test, priemer ±SD. (G) Explantáty z rovnakého embrya sa kultivovali 7 dní v médiu obsahujúcom holo-Tf alebo apo-Tf. Mierka∶ 500 μm. (H) Široké snímky holo-Tf a apo-Tf kultivovaného explantátového páru zafarbeného proti SIX2 a E-kadherínu po 48 hodinách kultivácie ukazujú normálny pool progenitorových buniek a defekty v skorej morfológii nefrónu. Mierka∶100 μm.（I） Širokoúhlé snímky páru explantátov kultivovaných holo-Tf a apo-Tf zafarbené proti WT1 a JAG1. Mierka∶100 μm. （） Povrchové plochy explantátov kultivovaných holo-Tf a apo-Tf po 7 dňoch.n=30 párov, párový t-test, priemer ± SD.(K) Počet glomerulov v skupinách explantátov po 7 dňoch.n =17 párov, párový t-test, priemer ± SD.
2.2. Ex Vio vysoká expozícia glukózy vedie k zmenám spojeným s diabetickou nefropatiou vo vyvíjajúcej sa obličke
Diabetes matky je ďalším bežným stavom počas tehotenstva, s celosvetovou prevalenciou hyperglykémie v tehotenstve ~ 17 percent a viac ako 20 miliónmi živonarodených detí každý rok [25]. Ukázalo sa, že diabetes indukovaný v modeloch myší a potkanov vedie k potomkom s nižším počtom nefrónov [10,26,27]. Metanefrická orgánová kultúra sa už predtým používala na štúdium účinku vysokej hladiny glukózy na vývoj obličiek [27-29]. Predtým sme uviedli zníženie veľkosti, počtu nefrónov a metylácie DNA za podmienok vysokej hladiny glukózy 55 mM [30]. Na rozdiel od publikovaných údajov [28] nebolo možné v našich vzorkách pozorovať žiadny vplyv na veľkosť explantátu alebo glomerulárne číslo, keď sa kultivovali v rôznych 30 mM glukózových médiách v porovnaní s 5 mM kontrolnými podmienkami po 7 dňoch (doplnkový obrázok S2A, B). Okrem toho nebolo možné zistiť žiadne zníženie metylácie DNA na LINE-1 a hlavných satelitných miestach (doplnkový obrázok S2C, D). Účinok 55 mM vysokej glukózy na vývoj obličiek po 7-dňovom období kultivácie sa ďalej analyzoval, pričom sa ukázalo zníženie rýchlosti rastu počnúc 3. dňom v kultúre (obrázok 2A, B). Imunofluorescenčné farbenie neukázalo žiadne morfologické defekty skupiny SIX2-pozitívnych progenitorových buniek (obrázok 2C), ale ukázalo sa znížené farbenie podocytového markera podokalyxínu (PODXL, obrázok 2D). Zistilo sa, že glomeruly obsahujú zhrubnutú glomerulárnu základnú matricu viditeľnú pri histologickom zafarbení (obrázok 2E). Podobné nálezy boli urobené v elektrónovej mikroskopii, ukazujúce zvýšenie hrúbky glomerulárnej bazálnej membrány (obrázok 2F), jedného z prvých markerov prediabetu a diabetickej nefropatie (DN) [31,32], v piatich zo šiestich obličiek a žiadnej siedmich kontrolných obličiek zo vrhu. Na ďalšie odhalenie zmien v transkriptóme sa uskutočnila analýza párovej diferenciálnej génovej expresie (DGE) kultúr obličiek z troch vrhov, pričom jedna oblička z každého embrya bola kultivovaná s vysokým obsahom glukózy a druhá s kontrolným médiom a obličky sa spojili na analýzu ( n=3). DGE potvrdila upreguláciu zložiek extracelulárnej matrice ako primárny upregulovaný biologický proces (doplnková tabuľka S1). Downregulované gény sa podieľali hlavne na aktivácii (imunitných) buniek a exocytóze / sekrécii (doplnková tabuľka S1). Ontológia fenotypu cicavcov indikovala abnormálnu morfológiu obličkovej kôry a obličkových teliesok v dôsledku downregulovaných génov, ako sú Pdgfb, Podxl, Ren, Ptpro, Mafb a Vegfa (doplnková tabuľka S1). Zistilo sa, že renálna expresia niekoľkých génov, ako sú Angptl4, Spon2 (Mindin), Pappa a Txnip, u ktorých sa ukázalo, že sú upregulované pri diabetickej nefropatii [33-36], je zvýšená za hyperglykemických podmienok. Na porovnanie profilu expresie génov v kultúre obličiek s vysokou hladinou glukózy s ľudskou DN boli údaje DGE porovnané s ľudskými údajmi z mikrodisekovaných glomerulov a tubulov z biopsií pacientov s diabetickou nefropatiou z Európskej renálnej cDNA banky (ERCB). Z 216 rozdielne regulovaných génov zhodných po vsádzkovej analýze bolo 94 génov zodpovedajúcim spôsobom diferencovane regulovaných v glomerulárnych a/alebo tubulárnych frakciách (obrázok 2G). Prekrytie nášho modelu a ľudských DNgénov ukázalo 40 z 95 génov upregulovaných v glomeruloch a 34 génov v tubuloch (25 génov spoločných) (obrázok 2H). Gény sa väčšinou podieľali na organizácii extracelulárnej matrice (COL4A5, COL4A6, COL8A2, LAMB3, LAMC3) a bunkovej adhézii (ITGBL1, CLDN15). Okrem toho boli upregulované gény spojené s cukrovkou, ako sú TXNIP, SPON2 a PAPPA. Zo 120 downregulovaných génov z obličkových kultúr bolo 22 downregulovaných aj v glomerulách a 39 bolo downregulovaných aj v tubuloch (16 spoločných (obrázok 2I). Tieto gény sa podieľali na reakcii na endogénny stimul (BMP2, KLF15, JUNB, CTSB), vývoj epitelu nefrónu (PTPRO, PODXL, VEGFA) a pozitívna regulácia chemotaxie endoteliálnych buniek (LGMN, P2RX4, VEGFA). 37-39]. Diferenciálne regulované gény, ktoré sa neprekrývajú s údajmi ERCB, tiež odrážali zmeny súvisiace s cukrovkou, ako je napríklad extracelulárna matrica (ANGPTL4, TNN, DPT, COL9A2) alebo gestačný diabetes (LAT2, HP, CXCL10, CD{{76} }, CD68, REN, SLC2A3, VCAM1. Vývoj obličiek za podmienok vysokej hladiny glukózy teda vykazoval pozoruhodné podobnosti s diabetickou nefropatiou dospelých ľudí.
Obrázok 2. Ex vivo vysoká expozícia glukózy vedie k zmenám súvisiacim s diabetickou nefropatiou vo vyvíjajúcej sa obličke.(A) Embryonálne obličky z Pod.Cre; Zvieratá z paradajok/EGFP sa kultivovali 7 dní v podmienkach s nízkym obsahom glukózy (LG, 5,5 mM -D-glukóza, 55 mM manitol) alebo s vysokým obsahom glukózy (HG, 55 mM -D-glukóza). Mierka: 500 um.(B)Povrch obličiek v podmienkach HG a LG.*,p=0.0474;*,p=0.0052;*,p<0.0001.paired t-test,="" mean="" ±="" sd.(c)="" confocal="" immunofluorescent="" stainings="" of="" day="" 7="" kidney="" cultures="" against="" six2="" and="" (d)="" podocalyxin="" with="" pan-cytokeratin="" and="" hoechst.scale="" bar:="" 100="" um.="" (e)="" stainings="" of="" 6="" um="" sections="" from="" day="" 7="" kidney="" cultures.="" scale="" bar:="" 20="" um.="" (f)transmission="" electron="" microscopy="" of="" sections="" from="" day="" 7="" kidney="" cultures.="" glomerular="" basement="" membranes="" are="" thickened="" in="" kidneys="" exposed="" to="" high="" glucose="" conditions.="" left="" column:="" magnification="" showing="" podocyte="" foot="" processes.="" scale="" bars:="" 500="" nm="" (left="" panels),100="" nm="" (right="" panels).(g)="" fold="" change="" of="" rna-seq="" data="" from="" hg="" compared="" to="" lg="" kidneys="" and="" ercb="" diabetic="" nephropathy="" (dn)patient="" microarray="" data="" from="" microdissected="" glomeruli="" and="" tubules="" showing="" differentially="" expressed="" genes.="" (h)="" genes="" upregulated="" in="" the="" kidney="" cultures(kc)overlapping="" with="" ercb="" dn="" patient="" data="" and="" selected="" genes="" highlighted.="" (i)genes="" downregulated="" in="" the="" kidney="" cultures="" (kc)="" overlapping="" with="" ercb="" dn="" patient="" data="" and="" selected="" genes="">
2.3. Ex vivo vysoká expozícia glukózy ovplyvňuje tvorbu dlhodobej pamäte prostredníctvom metylácie DNA
Na ďalšie pochopenie molekulárnych zmien sprostredkovaných hyperglykemickým prostredím sa kultúry obličiek pestovali pri podmienkach vysokej glukózy počas 3,5 dňa a potom sa zmenili na podmienky s nízkou hladinou glukózy počas rovnakého času (obrázok 3A). Je pozoruhodné, že inkubácia za fyziologických podmienok po kratšom inkubačnom období v médiu s vysokým obsahom glukózy nezvrátila zníženie rastu po 7 dňoch v kultúre, pričom kultúry rástli rovnakou rýchlosťou ako pri kontinuálnom ošetrení vysokým obsahom glukózy (obrázok 3B). Okrem toho metylácia DNA ukázala hypometyláciu prvku LINE-1 a hlavných satelitných lokusov (obrázok 2C, D), ako aj trvalú hypermetyláciu DNA promótora Ppargcla, za podmienok vysokej hladiny glukózy aj za reverzných podmienok (obrázok 3E), čo naznačuje tvorba metabolickej pamäte prostredníctvom metylácie DNA v dôsledku skorších nepriaznivých podmienok prostredia ako prostriedku programovania plodu.
Obrázok 3. Ex vivo expozícia vysokej glukóze ovplyvňuje tvorbu dlhodobej pamäte prostredníctvom metylácie DNA.(A) Zobrazovanie E12.5 embryonálnych obličiek odo dňa 0 do dňa 7 v médiu s nízkym obsahom glukózy (5,5 mM), médiu s vysokým obsahom glukózy (55 mM) alebo médiu s vysokým obsahom glukózy počas 3,5 dňa a obrátenie na médium s nízkym obsahom glukózy na zostávajúce dni. Mierka: 500 um. (B) Plocha povrchu obličiek počas 7 dní. Priemer ± SD. n=36 obličiek. LG, liečba s nízkou hladinou glukózy; HG, liečba vysokou hladinou glukózy; HG na LG,3,5-dňová vysoká a 3,5-dňová liečba nízkej hladiny glukózy.***,LG-HG (nepárový t-test):p=0.0004;**,LG-HG na LG (párový t-test ):p<0.0001.(c) analysis="" of="" the="" dna="" methylation="" at="" line-1="" and(d)major="" satellite="" loci="" shows="" continuous="" dna="" hypomethylation="" in="" high="" glucose="" treated="" conditions.**,p-value="0.0022.*,p-value=0.0357.(E)" analysis="" of="" the="" dna="" methylation="" at="" the="" ppargcla="" locus="" shows="" continuous="" dna="" hypermethylation="" in="" high="" glucose="" conditions.="" mean="" ±="" sd.="" *,p-value="">
2.4. Ex Vivo Small Compound Screen identifikuje epigenetické regulátory vývoja obličiek
Výsledky tejto práce, ako aj predchádzajúcich prác naznačujú, že pri vývoji obličiek zohrávajú úlohu epigenetické mechanizmy [30, A40-45]. Preto sme chceli systematicky vyhodnotiť účinok epigenetických modulátorov rôznych tried enzýmov na vývoj obličiek. Na tento účel sme vybrali knižnicu 22 malých zlúčenín schválených FDA s preukázanou inhibičnou aktivitou [46-56] (obrázok 4A). Použitím Six2.Cre-reporter myší na vyhodnotenie vývoja nefrónov sa renálne štruktúry kultivovali 3 dni s inhibítormi v médiu. Veľkosť sa časom zväčšila v porovnaní s kontrolnými orgánmi súrodenca a morfológia sa skontrolovala na abnormality vo vývoji (obrázok 4B). Ukázalo sa, že niekoľko inhibítorov interferuje s normálnym ex vivo obličkovým vývojom. Inhibítor HDAC entinostat, inhibítor benzamid históndeacetylázy s vysokou afinitou k HDAC1,2 a 3 [57], vykazoval konzistentné zníženie rastu a nedostatok diferenciácie a proliferácie po 3 dňoch (obrázok 4C). TH39 sa vyvinul ako selektívny inhibítor HDAC8 (IC50 HDAC8 88 nM, 26-násobne selektívny voči HDAC1,28-násobne selektívny voči HDAC6[56]), vykazoval podobne závažnú inhibíciu rastu v porovnaní s kontrolnými orgánmi súrodencov. Okrem toho chelátory železa a inhibítory JmJC deferasirox a deferoxamín vykazovali zníženie rastu analogické s médiom s nedostatkom železa. Okrem toho inhibítor SET7/9 cyproheptadín [58,59] vykazoval zníženie rastu a nedostatok diferenciácie a proliferácie v porovnaní s kontrolnými obličkami (obrázok 4D), ale tiež sa zdalo, že interferuje so signalizáciou Wnt (doplnkový obrázok S3). Iné inhibítory HDAC, HAT, HDM a HMT a inhibítor DNMT 5-azacytidín nevykazovali zníženie rastu alebo vývojové anomálie v meranom časovom rámci (obrázok 4A).
Obrázok 4. Skríning malých zlúčenín ex vivo identifikuje modulátory vývoja obličiek.(A) Zoznam malých zlúčenín, ich epigenetických cieľov a použitých koncentrácií ukazuje zníženie rastu obličiek s entinostatom, TH39, deferasiroxom, deferoxamínom a cyproheptadínom v 3 nezávislých experimentoch väčších alebo rovných po 3 dňoch v kultúre. Kontrolné kultúry boli ošetrené DMSO. ***, p-hodnota<0.0001. (b)examples="" of="" two="" sets="" of="" embryonic="" kidney="" cultures="" with="" pictures="" taken="" from="" day="" 0="" until="" day="" 3="" showing="" growth="" reduction="" and="" morphological="" differences="" in="" kidneys="" treated="" with="" th39,="" deferasirox,="" and="" deferoxamine="" compared="" to="" littermate="" control="" kidneys.="" scale="" bar∶="" 500="" μm.="" (c）entinostat="" showed="" growth="" reduction="" at="" 5="" and="" 10="" μm="" concentrations,="" no="" nephron="" differentiation,="" and="" lack="" of="" proliferation="" after="" 3="" days="" (d)cvproheptadine="" showed="" growth="" reduction="" at="" 100="" and="" 50="" μm="" concentrations,="" lack="" differentiation,="" ureter="" dilation,="" and="" lack="" of="" proliferation="" after="" 3="" days="" in="" culture.="" scale="" bar:="" 500="" um.="" panck,="" pan-cytokeratin.="" cc3,="" cleaved="" caspase-3.="" pcna,="" proliferating="" cell="" nuclear="">
