pre viac informácií:{0}}

Sante Princero Berlingerio^1,†, Junling He^2,†, Lies De Groef ³, Harold Taeter⁴, Tomáš Norton⁴, Pieter Baatsen ⁵, Sara Cairoli⁶, Bianca Goffredo⁶, Peter de Witte ⁷, Lambertus van den Heuvel^1,8, Hans J. Baelde²a Elena Levtčenková^1,*

^{Časť I: Renálne a extrarenálne prejavy v modeli cystinózy dospelých zebričiek}

¹Laboratórium detskej nefrológie, KU Leuven, 3000 Leuven, Belgicko; santeprinciero.berlingerio@kuleuven.be (SPB); Bert.vandenHeuvel@radboudumc.nl (LvdH)

²Katedra patológie, Leiden University Medical Center, 2300 RC Leiden, Holandsko; J.He@lumc.nl (JH); j.j.baelde@lumc.nl (HJB)

³ Výskumná skupina pre vývoj a regeneráciu neurálnych obvodov, KU Leuven, 3000 Leuven, Belgicko; lies.degroef@kuleuven.be

⁴Group of M3-BIORES, Division of Animal and Human Health Engineering, KU Leuven, 3000 Leuven, Belgicko; harold.taeter@kuleuven.be (HT); tomas.norton@kuleuven.be (TN)

⁵Molecular Neurobiology, VIB-KU Leuven, 3000 Leuven, Belgicko; pieter.baatsen@kuleuven.be

⁶Oddelenie pediatrickej medicíny, Laboratórium metabolickej biochemickej jednotky, Detská nemocnica Bambino Gesù, IRCCS, 00146 Rím, Taliansko; sara.cairoli@opbg.net (SC); biancamaria.goffredo@opbg.net (BG)

⁷Laboratory for Molecular Biodiscovery, KU Leuven, 3000 Leuven, Belgicko; peter.dewitte@kuleuven.be

⁸Oddelenie detskej nefrológie, Radboud University Medical Center, 6525 GA Nijmegen, Holandsko

^*Korešpondencia: elena.levtchenko@uzleuven.be; Tel.: plus 32-16-34-38-22

^† Títo autori prispeli k tejto práci rovnakou mierou.

Abstrakt:Cystinózaje zriedkavé, nevyliečiteľné, autozomálne recesívne ochorenie spôsobené mutáciami v géne CTNS. Tento gén kóduje cystinózu lyzozomálneho cystínového transportéra, čo vedie k akumulácii lyzozomálneho cystínu vo všetkých bunkách tela, pričom obličky sú prvými postihnutými orgánmi. Súčasná liečba cysteamínom znižuje akumuláciu cystínu, ale nezvráti proximálnu tubulárnu dysfunkciu, glomerulárne poškodenie alebo stratuobličkovéfunkciu. V našej predchádzajúcej štúdii sme vyvinuli model cystinózy zebričiek prostredníctvom nezmyselnej mutácie v géne CTNS a ukázali sme, že larvy zebričiek rekapitulujúobličkyfenotyp opísaný u ľudí. V súčasnej štúdii sme charakterizovali dospeléhocystinózamodel zebrafish a vyhodnotili dlhodobé účinky choroby naobličkya extrarenálne orgánov prostredníctvom biochemických, histologických štúdií, štúdií fertility a lokomotorickej aktivity. Zistili sme, že dospelýcystinózazebra má hromadenie cystínu v rôznych orgánoch, zmenenú morfológiu obličiek, zhoršenú pigmentáciu kože, zníženú plodnosť, zmenenú pohybovú aktivitu a očné anomálie. Celkovo naše údaje naznačujú, že dospelýcystinózamodel zebrafish reprodukuje niekoľko ľudských fenotypov cystinózy a môže byť užitočný na štúdium patofyziológie a dlhodobých účinkov nových terapií.

Kľúčové slová:obličkychoroba;cystinóza; model zebrafish;obličkovéa extrarenálne prejav; fenotypové znaky dospelých

1. Úvod

Cystinózaje autozomálne recesívne akumulačné ochorenie spôsobené mutáciami v géne CTNS, ktorý kóduje cystinózu lyzozomálneho cystínového protónového kotransportéra, prenášajúceho cystín z lyzozomálneho lúmenu do cytosolu. Na chorobe je zapojených niekoľko orgánov, ako sú svaly, semenníky, oči a mozog a medzi všetkýmiobličkysú prvými a najťažšie postihnutými orgánmi [1]. Najčastejším a najzávažnejším klinickým variantom je infantilné nefropatické ochoreniecystinóza, pri ktorej je prvým klinickým prejavomobličkovéFanconiho syndróm, charakterizovaný poruchou proximálnej tubulárnej epiteliálnej bunky

(PTE) reabsorpcia vedúca k strate aminokyselín, glukózy, nízkomolekulárnych až stredne molekulárnych proteínov a iných metabolitov močom. Po poškodení PTEC nasleduje progresívna glomerulárna dysfunkcia a ak sa nelieči, vedie ku konečnému štádiuobličkychoroba [1]. Súčasný terapeutický prístup pozostáva z cysteamínu, čo je aminotiol poškodzujúci cystín, ktorý prerušuje disulfidický mostík cysteínu, čo vedie k tvorbe aminokyseliny cysteínu a zmiešaného disulfidu cysteamín-cysteín. Táto druhá molekula môže cez transportér aminokyselín PQLC2[2] vyjsť do lyzozómov. Napriek tomu, že liečba cysteamínom znižuje akumuláciu lyzozomálneho cystínu, len odďaľuje progresiu ochorenia [3–5]. Preto ďalšie pochopenie patogenézycystinózaa vývoj nového rapeutikopcie sú stále v agende výskumu. Na rekapituláciu fenotypu cystinózy bolo vyvinutých niekoľko zvieracích modelov [6,7]. Jedným z najpoužívanejších modelov je myš Ctns−/− C57BL/6, u ktorej sa rozvíja akumulácia cystínu a mierna proximálna tubulopatia. Nevykazuje však glomerulárne poškodenie a zistil sa, že fenotyp závisí od genetického pozadia [8].

K dnešnému dňu sa modely zebričiek stali atraktívnym nástrojom na vyšetrovanie ľudských chorôb vďaka niekoľkým výhodám, ako je ich rýchly vývoj, vysoká plodnosť, nižšie náklady na údržbu a dostupnosť ľahko použiteľných technológií na úpravu génov [9]. V predchádzajúcej štúdii sme predstavili kongénny model lariev zebričky s homozygotnou nezmyselnou mutáciou v exóne 8 génu ctns-/-, čo vedie k funkčnej strate cystinózy [10], čo vedie k zvýšenému hromadeniu cystínu v celom tele. deformácia lariev, oneskorený vývoj aobličkyškody. Avšak dlhodobé následky ochorenia u dospelých zebričiek neboli doteraz študované. V súčasnej štúdii sme sa zamerali na charakterizáciuobličkovéa extrarenálne prejavy v modeli dospelých zebričiekcystinóza.

Kliknite na organickéCistanche na ochorenie obličiek

2. Výsledky

2.1. Cystín sa hromadí v Ctns-/- Zebrafish

Cystinózasa považuje za multisystémovú poruchu, ktorá vedie k akumulácii cystínu vo všetkých bunkách tela. V našej predchádzajúcej práci sme zistili, že cystinóza (ctns−/−) zebry vykazujú akumuláciu cystínu od štádia vývoja lariev a vo viacerých orgánoch až do veku 8 mesiacov [9]. Aby sme vyhodnotili, či náš model udržiava akumuláciu cystínu v neskorších štádiách ochorenia, zmerali sme hladiny cystínu v celom tele,obličky, semenníky, oči, svaly a mozog u 18-mesačných zebričiek ctns−/− v porovnaní so samcami zebričky divokého typu rovnakého veku. Zistili sme 54--násobné zvýšenie obsahu cystínu v celom tele (obrázok 1A) a 146--násobné zvýšenie v obličkách (obrázok 1B) ctns-/- zebričiek v porovnaní s divokým typom zebričky. Okrem toho sme pozorovali rozsiahlu akumuláciu cystínu v semenníkoch, očiach, svaloch a mozgu (obrázok 1C–F) u zebričiek ctns-/-.

2.2. Renálny prejav

2.2.1. Ctns−/− Zebrafish Present PTEC Damage

Keďžeobličkyje najťažšie postihnutý orgán, skúmali sme histologické charakteristiky obličky pomocou farbenia hematoxylínom a eozínom (H&E) a periodickou kyselinou-Shiff (PAS). Zaznamenali sme prítomnosť zakaleného opuchu, eozinofilných kvapôčok podobných hyalínom a cytoplazmatických vakuol v PTEC ctns-/- zebrafish (obrázok 2B, D), ale nie v prípade zebry divokého typu (obrázok 2A, C). Je potrebné poznamenať, že sa nenašlo žiadne distálne tubulárne poškodenie. Kryštály cystínu boli predtým pozorované v PTEC ako cytoplazmatické vakuoly s pravouhlým alebo polymorfným tvarom [11]. Preto sme skúmali, či tieto štruktúry boli prítomné aj v tubuloch zebry. Našli sme početné cytoplazmatické vakuoly v PTEC ctns-/- zebrafish prostredníctvom farbenia toluidínovou modrou (obrázok 3B, D, označené hviezdičkami). Okrem toho sme našli vakuolárny priestor s obdĺžnikovými alebo polymorfnými tvarmi (obrázok 3B, D, označené šípkami). Toto zistenie sme potvrdili transmisnou elektrónovou mikroskopiou (TEM) (obrázok 3F). Tieto štruktúry neboli prítomné v PTEC zobričiek divokého typu (obrázok 3A, C, E). Je zaujímavé, že okrem prítomnosti vakuol v polymorfnom tvare sme pozorovali čiastočnú stratu kefového okraja v ultraštruktúre PTEC (obrázok 3F).

Obrázok 1. Obsah cystínu v homogenátoch divokého typu a zebričiek ctns−/−. (A–F) Obsah cystínu v celom tele (A),obličky(B), semenníky (C), oči (D), sval (E) a mozog (F) u divokých a ctns−/− 18-mesačných samcov zebričky. Koncentrácia cystínu je vyjadrená ako nmol/mg proteínu. Každá bodka predstavuje jednu zebričku, spolu teda n=3 divokých a n=3 centov–/− 18-mesačných samcov zebričky; nepárový t-test s Welchovou korekciou, obojstranný: * p < 0.05;="" **=""><0.01; ns:="" not="" significant.="">

Obrázok 2Obličkyhistológia u divokých a ctns-/- zebričiek. (A, B) Reprezentatívne obrázkyobličkovétubuly divokého typu (A) a ctns−/− (B) 18-mesačných zebričiek. Podrobnosti o proximálnych tubuloch s eozinofilnými kvapôčkami podobnými hyalínom (čierne šípky) a cytoplazmatickými vakuolami (*). Farbenie H&E. Stĺpce stupnice predstavujú 50 um. (C, D) Reprezentatívne snímky PAS farbenia obličkových tubulov divokého typu (C) a ctns-/- (D) 18-mesačných zebričiek. Podrobnosti o proximálnych tubuloch s hyalínovými kvapôčkami (čierne šípky) a cytoplazmatickými vakuolami (*). PAS farbenie. Stĺpce stupnice predstavujú 50 um. PT: proximálny tubulus; DT: distálny tubulus.

Obrázok 3.Obličkycystínové kryštály v PTEC divého typu a ctns-/- zebričiek. (A, B) Reprezentatívne obrázky zafarbené toluidínovou modrouobličkovéproximálnych tubuloch u divého typu (A) a ctns−/− (B) 18-mesačných zebričiek. Stĺpce stupnice predstavujú 50 um. (C, D) Obrázky 3C, D ukazujú väčšie zväčšenie obrázku 3A, B. Podrobnosti o renálnych proximálnych tubuloch s cytoplazmatickými vakuolami ((D); *), pravouhlými a polymorfnými vakuolovými priestormi ((D); čierne šípky). (E, F) Reprezentatívne TEM snímky renálneho proximálneho tubulu divokého typu (E) a ctns-/- 18-mesačných zebričiek (F). (F) V proximálnom tubule zebry ctns-/- bola pozorovaná čiastočná strata proximálnych tubulov (PB) a akumulácia pravouhlých a polymorfných vakuol (*). Pohľad s vysokým zväčšením na obdĺžnik v pravom dolnom rohu ukazuje polymorfné vakuoly a veľkú vakuolu s rovnými segmentmi ohraničenia membrány (priama čiara). Stĺpce stupnice predstavujú 5 um.

2.2.2. Ctns−/− Zebrafish Show Glomerular Hypertrophy

Keďže glomerulárne poškodenie zvyčajne nasleduje po léziách PTEC, vyhodnotili sme glomerulárnu histológiu zebričiek a pozorovali sme, že samce zebričky vykazovali významné zväčšenie Bowmanovej kapsuly (obrázok 4B, E) a glomerulárneho chumáča (obrázok 4B, F4B), ale nie Bowmanov priestor , G) v porovnaní so samcom zebričky divokého typu (obrázok 4A, E–G). To isté sa potvrdilo pre glomerulárnu rtuť u samíc, ktoré nesú mutáciu ctns-/- (obrázok 4F) a podobný trend sa pozoroval pri meraniach Bowmanovho priestoru a Bowmanovej kapsuly (obrázok 4E, G). Nebola pozorovaná žiadna proliferácia mezangiálnych buniek alebo glomeruloskleróza. Na obrázkoch TEM sme nepozorovali zmeny na glomerulárnej bazálnej membráne, vymazanie podocytového výbežku nohy alebo abnormálne fenestrované endotelové bunky v glomeruloch zebričiek ctns-/- (obrázok 4D) v porovnaní s divokým typom zebričky (obrázok 4C).

Obrázok 4. Glomerulárna morfológia u divokého typu a u ctns−/− zebrafish. (A, B) Reprezentatívne snímky glomerulu divokého typu (A) a ctns−/− (B) 18-mesačných zebričiek. PAS farbenie. Stĺpce stupnice predstavujú 50 um. (C,D) Reprezentatívne TEM snímky glomerulu divokého typu (ctns−/− (D) zebrafish. Mierka predstavuje 1 µm. (E–G) Kvantifikácia povrchových plôch Bowmanovej kapsuly (E), glomerulárny chumáč (F) a Bowmanov priestor (G) divokého typu a zebričky u oboch pohlaví.

2.2.3. Ctns-/- Zebrafish zobrazuje zvýšenú apoptózu na úrovni PTEC

Ďalej sme skúmali, čicystinózaspustili bunkovú smrť v našom modeli zebrafish [10,12]. Vykonali sme imunofarbenie štiepenou kaspázou-3 vobličkovétkanivách divokého typu a zebričiek ctns-/- a pozorovali sme významné zvýšenie hladín štiepeného proteínu kaspázy3 v PTEC zebričiek ctns-/- (obrázok 5B, D, G) v porovnaní s divokým typom zebričky (obrázok 5A, C, G) u oboch pohlaví. Expresia štiepenej kaspázy-3 bola prítomná hlavne v bunkách vykazujúcich polymorfné cytoplazmatické vakuoly (obrázok 5B, D). Žiadna expresia štiepenej kaspázy-3 nebola prítomná v glomeruloch, a to ako u divokých druhov, tak u zebričiek ctns-/- (obrázok 5E, F).

Obrázok 5. Zvýšená apoptóza v PTEC s vakuolami u ctns−/− zebrafish. (A, B) Reprezentatívne obrázky imunofarbenia štiepenou kaspázou-3 tubulov divokého typu (A) a ctns− starej zebričky. Stĺpce mierky predstavujú 50 µm. (C,D) Spodné panely zobrazujú väčšie zväčšenie orámovaných oblastí v horných paneloch. Podrobnosti o PTEC s cytoplazmatickými vakuolami (*). Stĺpce mierky predstavujú 50 µm. (E, F) Reprezentatívne snímky štiepenej kaspázy-3 imunofarbenia glomerulu divokého typu (E) a ctns−/− (F) 18-mesačných zebričiek. Stĺpce stupnice predstavujú 50 um. (G) Kvantifikácia oblasti pozitívnej na farbenie tubulárnou kaspázou{10}} u divokých rýb a zebričiek u oboch pohlaví. Každá bodka predstavuje jednu zebričku, spolu teda n=3 divokých a ctns−/− 18-mesačných zebričiek. Dvojcestná ANOVA s Fisherovým testom najmenšieho významného rozdielu (PLSD): ** p < 0,01;="" ***="" p=""><>

2.3. Extra renálne prejavy

2.3.1. Ctns−/− Zebrafish vykazuje charakteristický hypopigmentovaný škvrnitý vzor kože

Cystinózapacienti často vykazujú predčasné starnutie kože, hypopigmentáciu a blond vlasy [1,13]. Je zaujímavé, že sme pozorovali hypopigmentovaný škvrnitý vzor kože zebry ctns-/-, zatiaľ čo ryby divokého typu vykazovali typický čierny pruhovaný vzor. Fenotyp je prítomný u oboch pohlaví počas celého ich života (obrázok 6A, B). Aby sme preskúmali rozdiel v pigmentácii, vykonali sme farbenie PAS na koži zebry a zistili sme, že ctns-/- zebrička vykazuje zmenenú distribúciu melanínovej vrstvy v epidermis, čo spôsobilo svetelný škvrnitý vzor (obrázok 6C, D).

Obrázok 6. Hypopigmentovaný škvrnitý vzor kože u zebričiek ctns−/−. (A, B) Reprezentatívne obrázky divokého typu (A) a ctns−/− (B) 18-mesačných zebričiek. Mierka predstavuje 0,5 cm. Čierne šípky označujú rôzne pruhované vzory kože. (C,D) PAS-zafarbené obrázky epidermis divokého typu (C) a ctns−/− (D) 18-mesačných zebričiek. Čierne šípky zvýrazňujú vrstvu melanínu. Prerušenie v melanínovej vrstve je prítomné v ctns-/- (D), zatiaľ čo u divokých zebričiek (C) chýba. Stĺpce stupnice predstavujú 50 µ

2.3.2. Ctns−/− Zebrafish ukazuje spermatogénne cysty obohatené o spermie

Cystinózaje známe, že ovplyvňuje funkcie semenníkov, čo vedie k azoospermii a neplodnosti u mužských pacientov [14–16]. Pôvod azoospermie je stále nejasný, hoci sa ukázalo, že spermatogenéza je na úrovni semenníkov neporušená. Na rozdiel od mužských pacientov sú ženy s cystinózou fertilné [17]. V našom modeli zebričiek sú samice aj samce zebričky ctns−/− plodné. Aby sme zistili, či mutácia ctns−/− ovplyvňuje anatómiu semenníka, vykonali sme farbenie PAS a zistili sme zvýšenú akumuláciu spermií v spermatogénnych cystách u ctns−/− zebrafish

Obrázok 7. Spermatogénne cysty obohatené o spermie u ctns−/− zebrafish. (A, B) Reprezentatívne H&E zafarbené obrázky semenníkov divokého typu (A) a ctns−/− (B) 18-mesačných zebričiek. Tmavomodré a zaoblené sfarbenie predstavuje spermie nahromadené v spermatogénnych cystách (označené hviezdičkami). Stĺpce stupnice predstavujú 200 um.

2.3.3. Ctns−/− Samice zebričky ukazujú zníženú produkciu vajec

Aby sme preskúmali funkčnosť reprodukčného systému, merali sme produkciu vajíčok a percento oplodnených vajíčok u divokých a ctns-/- zebričiek. Zistili sme, že samice ctns - / - vykazujú zníženú produkciu vajec (obrázok 8A) a znížené percento oplodnených vajíčok (obrázok 8B) v porovnaní so samicami divokého typu.

Obrázok 8. Produkcia vajíčok a percento oplodnených vajíčok u divokých a ctns−/− zebričiek. (A) Produkcia vajec bola meraná ako celkový počet vajíčok u divého typu a ctns−/− zebričiek 18-mesačných zebričiek. Miera produkcie vajec je 1,941 vysoká u divokých zebričiek v porovnaní s ctns−/− 18-mesačnými zebričkami (pomer miery=1,941); 95 percent CI (dolná hranica=1.165, horná hranica=3.234); Poissonova regresná analýza; p=0.011. (B) Percento oplodnených vajíčok sa meralo na celkovom počte vajíčok. Pravdepodobnosť oplodnených vajíčok je 3 504 u divokých zebričiek v porovnaní s ctns−/− 18-mesačnými zebričkami (pomer pravdepodobnosti=3 0,504); 95 percent CI (dolná hranica=2.005, horná hranica=6.124); Logistická regresná analýza; p < 0,001;="" neuvádza="" sa:="" neuplatňuje="">

2.3.4. Ctns−/− Zebrafish zobrazuje zníženú pohybovú aktivitu

Keďže úbytok svalov a slabosť boli diagnostikované vcystinózapacientov, spravidla od druhej dekády života [1,18], sme hodnotili lokomotorickú aktivitu v našom modeli zebričiek. Zistili sme, že zebrička ctns-/- z oboch pohlaví vykazovala zníženú lokomotorickú aktivitu v porovnaní s divokým typom zebričky, čo naznačuje zhoršenú funkciu svalov (obrázok 9). Histologická analýza tkaniva kostrového svalstva však neodhalila zjavné abnormality u ctns−/− zebrafish.