Inhibícia krvných doštičiek zabraňuje aktivácii zápalu NLRP3 a poraneniu obličiek vyvolanému sepsou

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Marivee Borges-Rodriguez a kol

Abstrakt:

Krvné doštičky, bunkové mediátory trombózy, sa aktivujú počas sepsy a sú čoraz viac uznávané ako mediátory imunitnej odpovede. Aktivácia krvných doštičiek je významne zvýšená u pacientov so sepsou v porovnaní s kontrolnými pacientmi na JIS. Napriek tejto korelácii zostáva úloha aktivovaných krvných doštičiek v prispievaní k patofyziológii sepsy nejasná. Predtým sme demonštrovali aktiváciu zápalu zápalu receptora proteínu 3 (NLRP3) podobného NOD u krvných doštičiek vyvolaných sepsou z potkanov s punkciou slepého čreva (CLP). Aktivované krvné doštičky boli spojené so zvýšeným pľúcnym edémom a glomerulárnym poškodením u CLP vs. SHAM kontrol. V tejto štúdii sme skúmali, či by inhibícia aktivácie krvných doštičiek oslabila aktiváciu NLRP3 a poškodenie obličiek a pľúc v reakcii na CLP. CLP sa uskutočnilo u samcov a samíc potkanov Sprague Dawley (SD) (n=10/skupina) na vyvolanie abdominálnej sepsy a potkany SHAM slúžili ako kontroly. Podskupina zvierat CLP bola liečená klopidogrelom (10 mg/kg/deň, CLP plus CLOP) na inhibíciu aktivácie krvných doštičiek. 72 hodín po CLP sa vyhodnotila aktivácia krvných doštičiek a zostavenie zápalu NLRP3, IL-1 a IL-18 sa merali v plazme a hodnotili sa tkanivá, obličková a pľúcna patológia a funkcia obličiek. Počet aktivovaných krvných doštičiek bol 7,8 ± 3,6 percent v Sham, 22 ± 6 percent v CLP a významne sa znížil na 14,5 ± 0,6 percent v CLP plus CLOP (n=8-10/skupina, p < 0,05)="" .="" zostava="" zápalu="" nlrp3="" bola="" inhibovaná="" v="" krvných="" doštičkách="" zvierat="" clp="" plus="" clop="" vs.="" clp.="" významné="" zvýšenia="" il-1="" a="" il-18="" v="" plazme="" a="" obličkách="" ako="" odpoveď="" na="" clp="" sa="" pri="" liečbe="" klopidogrelom="" znížili.="" poškodenie="" obličiek,="" ale="" nie="" histológia="" pľúc="" alebo="" funkcia="" obličiek="" sa="" zlepšili="" v="" clp="" plus="" clop="" vs.="" clp.="" tieto="" údaje="" poskytujú="" dôkaz,="" že="" aktivované="" krvné="" doštičky="" môžu="" prispievať="" k="" poškodeniu="" obličiek="" vyvolanému="" sepsou,="" pravdepodobne="" prostredníctvom="" aktivácie="" nlrp3="" v="" krvných="" doštičkách.="" krvné="" doštičky="" môžu="" byť="" terapeutickým="" cieľom="" na="" zníženie="" poškodenia="" obličiek="" u="" septických="">

Kľúčové slová:sepsa; NLRP3; krvné doštičky; clopidogrel; poškodenie viacerých orgánov; aktivácia endotelu;zápal

Extrakt z cistanche tubolosa: protizápalový

1. Úvod

Sepsa je život ohrozujúca dysregulovaná zápalová reakcia hostiteľa na infekčné činidlo [1] a je jednou z hlavných príčin smrti vo svete. Najmenej 1,7 milióna dospelých v Amerike ochorie na sepsu a takmer 270{5}} Američanov ročne zomrie na následky sepsy [2]. Sepsa vedie k multiorgánovej dysfunkcii vrátane akútneho poškodenia pľúc (ALI) [3],akútnaobličkyzranenie(AKI) [4,5], okrem iného hematologická dysfunkcia a dysfunkcia centrálneho nervového systému. Zvyšujúci sa počet orgánov zapojených do sepsy je spojený so zvýšenou mortalitou [6]. Súčasné liečebné modality sa zameriavajú na podpornú starostlivosť; úmrtnosť však zostáva vysoká. Uvádza sa, že približne 35 až 50 percent úmrtí v nemocnici je spôsobených sepsou [7]. Je dôležité identifikovať terapeutický cieľ, ktorý môže zlepšiť úmrtnosť v dôsledku sepsy.

Bolo uznané, že krvné doštičky majú úlohu v imunite [8,9], okrem ich úlohy pri hemostáze a trombóze. Trombocytopénia sa často pozoruje pri sepse a predpokladá sa, že sa vyskytuje v dôsledku aktivácie a spotreby krvných doštičiek; jeho úloha v chorobnom procese však zostáva nejasná. Trombocytopénia je spojená s rozvojom (multiorgánového zlyhania) MOF a zvýšenou 90-dňovou mortalitou [10–14]. Krvné doštičky môžu byť integrálnou súčasťou zápalovej odpovede na sepsu. Potenciálny mechanizmus, ktorým môžu krvné doštičky prispievať k poškodeniu viacerých orgánov, je prostredníctvom aktivácie zápalu NOD-podobného receptorového proteínu 3 (NLRP3). NLRP3 je cytosolický imunitný signalizačný receptor, ktorý vedie k kaspázou{11}} sprostredkovanému štiepeniu a aktivácii IL-1B a IL-18 a podieľa sa na patogenéze procesov zápalových ochorení, ako je astma [15 ], Parkinsonova choroba [16], zápalové ochorenie čriev [17] a sepsa [18]. Ukázalo sa, že inhibícia zostavy zápalu NLRP3 chráni pred poškodením orgánov vyvolaným sepsou [19–23]. Už sme predtým demonštrovali, že zápal NLRP3 je aktivovaný v krvných doštičkách v reakcii na punkciu slepého čreva (CLP) a je spojený s poškodením viacerých orgánov v reakcii na polymikrobiálnu sepsu v 72-hodinovom modeli potkanov CLP. V tejto štúdii sme predpokladali, že blokovanie aktivácie krvných doštičiek klopidogrelom (CLOP) by znížilo aktiváciu zápalu NLRP3, poškodenie obličiek a pľúc v reakcii na polymikrobiálnu sepsu.

cistanche flavonoidy: protizápalové

2. Výsledky

2.1. Aktivácia platničky a zostavenie zápalu NLRP3

Pomocou prietokovej cytometrie sme určili percento aktivácie krvných doštičiek medzi skupinami. Zistili sme, že aktivácia krvných doštičiek bola zvýšená u potkanov CLP o 22 ± 6 percent v porovnaní s SHAM o 7,8 ± 3,6 percent (p < 0.{{10}}5)="" a="" oslabená="" pri="" clp="" plus="" clop="" potkanov="" o="" 14,5="" ±="" 0,6="" percent="" (p="">< 0,05,="" obrázok="" 1).="" zostava="" zápalu="" nlrp3="" v="" krvných="" doštičkách="" bola="" hodnotená="" vizualizáciou="" spoločnej="" lokalizácie="" nlrp3="" s="" apoptózou="" asociovaným="" škvrnitým="" proteínom="" (asc)="" pomocou="" imunocytochémie="" (obrázok="" 2).="" spoločná="" lokalizácia="" zápalových="" zložiek="" v="" krvných="" doštičkách="" clp="" bola="" 83-krát="" väčšia="" v="" porovnaní="" s="" falošnými="" krvnými="" doštičkami="" (obrázok="" 2c).="" okrem="" toho="" sa="" zostavenie="" zápalu="" znížilo="" v="" krvných="" doštičkách="" clp="" plus="" clop="" v="" porovnaní="" s="">

2.2. Cytokíny spojené s inflflammasómom

Aktivácia NLRP3 vedie k uvoľneniu prozápalových cytokínov IL-1 a IL-18 do ich aktívnych foriem. Zmerali sme oba cytokíny v plazme,pľúc, aobličkyhomogenátySHAM, CLP a CLP plus CLOP prostredníctvom ELISA. Plazmatická IL{{0}} sa výrazne zvýšila z 9 ± 21 pg/ml pri simulácii na 77 ± 31 pg/ml v CLP (p < {{10}}.0="" 5,="" obr.="" 3a).="" podávanie="" klopidogrelu="" ukázalo="" zníženie="" plazmatického="" il-1="" 48="" ±="" 38="" pg/ml;="" pokles="" však="" nebol="" štatisticky="" významný="" v="" porovnaní="" s="" clp="" (p="">< 0.05="" vs.="" sham).="" podobne="" renálny="" il-1="" bol="" zvýšený="" v="" clp="" 4="" ±="" 3="" pg/mg="" v="" porovnaní="" so="" simulovaným="" 2,5="" ±="" 0,9="" pg/mg="" (p="">< 0,05,="" obrázok="" 3b).="" liečba="" klopidogrelom="" významne="" znížila="" renálny="" il-1="" na="" 1,8="" ±="" 0,8="" pg/mg="" (p="">< 0,05).="" v="" pľúcach="" sa="" il-1="" významne="" zvýšil="" zo="" 70="" ±="" 16="" pg/mg="" pri="" simulácii="" na="" 106="" ±="" 36="" pg/mg="" pri="" clp="" (p="">< 0,05)="" a="" významne="" sa="" nelíšil="" u="" zvierat="" liečených="" klopidogrelom="" (80="" ±="" 23="" pg="" g,="" obrázok="">

Plazmatický IL {{0}} nebol detekovateľný u potkanov SHAM; avšak priemerný plazmatický IL-18 bol 26 ± 6 pg/ml v CLP. Dôležité je, že podávanie klopidogrelu viedlo k nižším hladinám plazmatického IL-18 (12 ± 9 pg/ml; p < 0.{{20}}5,="" obrázok="" 3d).="" podobne="" renálny="" il{{1{32}}}}="" bol="" zvýšený="" v="" clp="" (396="" ±="" 65="" pg/mg)="" v="" porovnaní="" s="" sham="" (317="" ±="" 73="" pg/mg;="" p="">< 0,05).="" liečba="" klopidogrelom="" znížila="" renálny="" il-18="" na="" 214="" ±="" 70="" pg/mg="" (p="">< 0,05,="" obrázok="" 3e).="" v="" pľúcach="" sa="" il-18="" významne="" zvýšil="" zo="" 704="" ±="" 219="" pg/mg="" u="" sham="" na="" 999="" ±="" 158="" pg/mg="" v="" clp="" (p="">< 0,05)="" a="" zostal="" zvýšený="" u="" zvierat="" liečených="" clopidogrelom="" 1014="" ±="" 235="" pg/mg="" (="" p="">< 0,05="" vs.="" sham,="" obrázok="">

2.3. Aktivácia endotelu

Pomocou ELISA sme merali plazmatické hladiny angiopoetínu{{0}} a endokánu ako markerov aktivácie endotelu v skupinách Sham, CLP a CLP plus CLOP. Plazmatický endokán sa významne zvýšil z 1234 ± 327 pg/ml v Sham na 1978 ± 306 pg/ml v CLP (p < {{20}},05="" vs.="" sham).="" endocan="" sa="" významne="" znížil="" na="" 1521="" ±="" 283="" pg/ml="" u="" potkanov="" clp="" liečených="" clopidogrelom="" (p="">< 0,05="" vs.="" clp,="" obrázok="" 4a).="" podobné="" výsledky="" sa="" našli="" pre="" angiopoetín{12}}.="" angiopoetín-2="" sa="" významne="" zvýšil="" z="" 5603="" ±="" 2142="" pg/ml="" pri="" simulácii="" na="" 56="" 767="" ±="" 40,{19}}="" pg/ml="" pri="" clp="" (p="">< 0,05="" vs.="" simulovaná)="" a="" významne="" sa="" znížil="" u="" potkanov="" liečených="" clopidogrelom="" na="" 22="" 486="" ±="" 13="" 616="" pg/ml="" (p="">< 0,05="" vs.="" clp,="" obrázok="">

2.4. Poranenie pľúc

Histologická analýza pľúc z každej skupiny preukázala významný nárast infiltrácie neutrofilov s priemerným skóre {{0}},6 ± 0,2 u potkanov CLP v porovnaní so skóre {{6} }.10 ± {{10}}.10 u falošných potkanov (p < 0.05).="" tiež="" sme="" pozorovali,="" že="" podávanie="" klopidogrelu="" clp="" potkanom="" nezmenilo="" infiltráciu="" neutrofilov="" (skóre="" 0,5="" ±="" 0,4,="" obrázok="" 5a).="" podobné="" výsledky="" sa="" našli="" v="" hrúbke="" alveolárnej="" steny="" s="" významným="" zvýšením="" clp="" s="" priemernou="" hrúbkou="" 1,2="" ±="" 0,1="" µm="" v="" porovnaní="" s="" 0,8="" ±="" 0,3="" µm="" u="" potkanov="" sham="" (p="">< 0,05).="" podávanie="" klopidogrelu="" clp="" potkanom="" nezlepšilo="" hrúbku="" alveolárnej="" steny="" (obrázok="">

2.5. Poranenie obličiek

Ako sme už predtým publikovali, GFR sa výrazne znížila z 2,1 ± 0,8 ml/min/100 g, ale u potkanov Sham na {{10}} 0,7 ± 0,2 ml/min/100 g, ale u potkanov CLP (p < 0,05).="" podávanie="" klopidogrelu="" ukázalo="" zlepšenie="" gfr="" na="" 1,3="" ±="" 0,5="" ml/min/100="" g,="" ale="" v="" porovnaní="" s="" clp,="" nie="" však="" štatisticky="" významné="" (obrázok="" 6a).="" histologická="" analýza="" preukázala="" zvýšené="" glomerulárne="" poškodenie="" v="" skupine="" clp="" v="" porovnaní="" so="" skupinou="" sham.="" liečba="" klopidogrelom="" významne="" zlepšila="" glomerulárne="" poškodenie="" u="" zvierat="" clp="" (obrázok="">

cistanche zdravotné prínosy: lepšia funkcia obličiek

3. Diskusia

Sepsa je dysregulovaná imunitná odpoveď na infekčný agens, často spojená s multiorgánovým zlyhaním a známa vysokou mortalitou. Existuje potreba identifikácie novej terapie, ktorá môže modulovať zápalovú odpoveď a znižovať mortalitu. Predpokladá sa, že krvné doštičky zohrávajú úlohu v imunomodulácii. Prirodzene, koagulačná kaskáda a aktivácia krvných doštičiek boli hlavným zameraním výskumu. Podávanie proteínu C, antikoagulačného endogénneho enzýmu, bolo spojené so zlepšením prežitia u pacientov s ťažkou sepsou [24]. V Japonsku usmernenia pre sepsu zahŕňajú použitie časovaného podávania antitrombínu u septických pacientov s DIC a preukázali zlepšené výsledky [25]. To naznačuje, že inhibícia aktivácie krvných doštičiek môže zlepšiť výsledky pri sepse. Zápalová odpoveď počas sepsy je určite zložitá a môže zahŕňať viac ako jednu dráhu. Už sme predtým publikovali, že krvné doštičky z modelu CLP polymikrobiálnej sepsy majú zvýšenú zostavu/aktiváciu NLRP3 krvných doštičiek a sú spojené s poškodením pľúc a obličiek [26]. V tejto štúdii sme sa rozhodli určiť úlohu inhibície krvných doštičiek v zápalovej odpovedi v rovnakom modeli s použitím inhibítora P2Y12, Clopidogrelu.

Ako už bolo publikované, aktivácia krvných doštičiek bola zvýšená v reakcii na polymikrobiálnu sepsu v modeli CLP v porovnaní s potkanmi Sham. Zistili sme, že podávanie klopidogrelu znížilo aktiváciu krvných doštičiek u potkanov CLP a zaujímavé je, že sa tiež pozoroval pokles v zostavovaní zápalu NLRP3 v krvných doštičkách. Zistili sme tiež trend v znižovaní cirkulujúceho IL-1B a IL-18 v plazme zvierat liečených klopidogrelom v porovnaní so skupinou CLP. V predtým publikovanej štúdii sme uviedli, že priama inhibícia zápalu NLRP3 pomocou MCC950 viedla k zníženiu IL-1B a IL-18 v plazme [27]. To naznačuje, že inhibícia aktivácie krvných doštičiek klopidogrelom a pokles zápalových cytokínov v tomto modeli sepsy je čiastočne sprostredkovaný mechanizmami NLRP3. Preto je potrebné vykonať ďalšie štúdie, aby sa jasnejšie definovali zápalové dráhy sprostredkované NLRP3 v krvných doštičkách.

Multi-organ failure (MOF) occurs frequently in sepsis. Previously published studies reported that in mice, the CLP model caused significant pulmonary damage; and depletion of platelets reduced CLP-induced edema and neutrophil recruitment in the bronchoalveolar space by >60 percent [28]. Už sme predtým publikovali, že zvýšená aktivácia krvných doštičiek bola spojená s dysfunkciou viacerých orgánov a poranením v modeli potkanov CLP [26]. Naše údaje ukazujú významný pokles IL-1 a IL-18 vobličkyzvierat liečených klopidogrelom. Kombinácia akútneho zlyhania obličiek a sepsy je spojená so 70-percentnou mortalitou v porovnaní so 45-percentnou mortalitou u pacientov so samotným akútnym zlyhaním obličiek [29]. Rýchlosť glomerulárnej filtrácie (GFR) je indikátoromobličkyfunkciua klesá so zvýšeným poškodením obličiek. Liečba klopidogrelom zlepšila poškodenie obličiek u potkanov CLP, čo naznačuje, že aktivácia krvných doštičiek môže hrať úlohu pri rozvoji AKI vyvolanej sepsou.

Výhody extraktu z cistanche: zlepšuje funkciu obličiek

V súlade s jeho úlohou pri spôsobovaní MOF je vývoj ALI a syndrómu akútnej respiračnej tiesne (ARDS) bežný u pacientov so sepsou a často vedie k potrebe mechanickej ventilácie v tejto populácii pacientov. Dôkazy naznačujú, že aktivácia krvných doštičiek hrá dôležitú úlohu vo vývoji MOF u septických pacientov [8,30]. Predchádzajúce štúdie to podporili znížením infiltrácie neutrofilov v pľúcach septických myší vyvolaných CLP po deplécii krvných doštičiek [28]. Okrem toho Liverani a kol. uviedli, že myši vopred liečené klopidogrelom boli rezistentné na ALI vyvolanú sepsou [31]. Súčasná štúdia však nedokázala preukázať žiadny významný dôkaz zníženia IL- 1, infiltrácie neutrofilov alebo hrúbky alveolárnej steny v pľúcach. Môže to byť spôsobené použitím iného živočíšneho druhu, dávkou klopidogrelu a inými rozdielmi v experimentálnom usporiadaní.

Kapilárny únik je prominentným znakom sepsy. Je známe, že proteíny, ako je vaskulárny rastový faktor angiopoetín-2, podporujú zápal, endoteliálnu dysfunkciu a sú spojené so zvýšenou nemocničnou mortalitou u pacientov so sepsou [32]. Endocan je ďalším markerom dysfunkcie endotelových buniek a súvisí so závažnosťou ochorenia a výsledkom u septických pacientov [33]. Zistili sme tiež, že tieto markery aktivácie a dysfunkcie endotelu boli zvýšené v modeli CLP a znížené v skupine liečenej klopidogrelom. Podobne sme pozorovali mierne, ale nevýznamné zvýšenie GFR v skupine liečenej klopidogrelom. To naznačuje, že aktivácia krvných doštičiek má určitý modulačný účinok na zápalovú odpoveď na sepsu.

V tejto štúdii sa inhibícia aktivácie krvných doštičiek nepremietla do významného zlepšenia funkcie orgánov. Je možné, že zvolená dávka 10 mg/kg/deň bola dostatočná na zmiernenie aktivácie krvných doštičiek, aktivácie NLRP3, cytokínov a markerov aktivácie endotelu, ale nepremietla do oslabenia poškodenia pľúc alebo zlepšenia funkcie obličiek. Liverani a kol. predtým používali počiatočnú dávku 30/mg/kg/deň u myší divokého typu a myší s knock-outom P2Y12, čo sa premietlo do inhibície poškodenia pľúc vyvolaného sepsou [31]. V tej istej štúdii sa klopidogrel podával pred vyvolaním sepsy. Tento hlavný rozdiel môže vysvetliť nedostatok významných zlepšení funkcie pľúc alebo obličiek pozorovaných v našej štúdii.

Zatiaľ čo súčasná štúdia naznačuje úlohu aktivácie krvných doštičiek pri prispievaní k zápalu a aktivácii endotelu v reakcii na sepsu, existujú obmedzenia, ktoré je potrebné poznamenať. Po prvé, zatiaľ čo sa merali markery aktivácie endotelu, sú potrebné ďalšie experimenty na posúdenie funkcie endotelu. Okrem toho príspevok iných faktorov odvodených od krvných doštičiek nebol v tejto štúdii kontrolovaný. Stále teda existujú nezodpovedané otázky týkajúce sa toho, ako krvné doštičky prispievajú k patológii vyvolanej sepsou a zlyhaniu orgánov.

Úloha klopidogrelu pri znižovaní mortality pri sepse bola kontroverzná so správami o znížení incidencie ARDS a mechanickej ventilácie, ale bez zníženia mortality [34]. Je potrebné vykonať ďalšie štúdie, aby sa určil presný mechanizmus, ktorým krvné doštičky prispievajú k poškodeniu orgánov a dysfunkcii pri sepse. Táto štúdia podporuje ďalšie skúmanie krvných doštičiek ako terapeutického cieľa u septických pacientov.

cistanche tubolosa zdravotné prínosy: zlepšuje funkciu obličiek

4. Materiály a metódy

4.1. Zvieratá

Boli použité samice a samce potkanov Sprague Dawley zakúpené od Envigo (Indianapolis, IN, USA). Všetky experimentálne postupy vykonané v tejto štúdii boli v súlade s usmerneniami Národného inštitútu zdravia pre používanie zvierat a starostlivosť o ne. Všetky protokoly boli schválené Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie na University of Mississippi Medical Center. Starostlivosť a zaobchádzanie so zvieratami boli v súlade s usmerneniami Národného inštitútu zdravia pre etické zaobchádzanie so zvieratami.

4.2. Ligácia a punkcia céka

Všetky naše experimenty in vivo sa uskutočnili na 12- až 13-týždňových samcoch a samiciach potkanov s hmotnosťou približne 225 – 325 g. Zvieratá boli náhodne rozdelené do dvoch skupín: skupina s falošnou operáciou (SHAM, n=10) a skupina s punkciou slepého čreva (CLP, n=10). V anestézii izofluránom sa operácia CLP uskutočnila na podskupine potkanov na vyvolanie abdominálnej polymikrobiálnej sepsy, ako sme už opísali [26,27]. Predhriaty fyziologický roztok (20 ml/kg, 37 ◦C) bol subkutánne injikovaný bezprostredne po operácii na resuscitáciu. Falošne operované zvieratá podstúpili rovnaký chirurgický zákrok bez podviazania slepého čreva alebo punkcie. Potkany sa po operácii umiestnili späť do klietok a potrava a voda sa im poskytli ad libitum. 24 hodín po CLP sa predchádzajúci rez znovu otvoril a nekrotické cékum sa opatrne vyrezalo. Brušná dutina bola premytá 10 ml teplého sterilného fyziologického roztoku. Brušný rez bol opäť uzatvorený vo vrstvách. Zvieratám sa denne podávalo širokospektrálne antibiotikum (Naxcel 5 mg/kg) a analgézia sa dosiahla buprenorfínom SR (1,2 mg/kg) počas 72-hodinového experimentálneho obdobia. Agregácia krvných doštičiek bola blokovaná denným podávaním klopidogrelu (10 mg/kg/deň) počas 3 dní u podskupiny potkanov CLP (CLP plus CLOP; n=12) cez pažerákovú sondu počas 3 dní. Na konci protokolu boli zvieratá usmrtené v hlbokej anestézii. Krv a tkanivá sa odobrali na ďalšiu analýzu.

4.3. Izolácia krvných doštičiek

Arteriálna krv sa odobrala do vákuových skúmaviek kyselina-citrát-dextróza a centrifugovala sa pri 200x g počas 20 minút, aby sa získala plazma bohatá na krvné doštičky. Plazma bohatá na krvné doštičky (PRP) sa zmiešala s rovnakým objemom HEP pufra (140 mmol/1 NaCI, 2,7 mmol/1 KCI, 3,8 mmol/1 HEPES, 5 mmol/1 EGTA, pH 7,4) obsahujúceho 1 uM PGE1. Táto zmes sa potom centrifugovala pri 100 x g počas 20 minút, aby sa peletovali zvyšné RBC a WBC, v ktorých sa 40 ul supernatantu použilo na počítanie krvných doštičiek. PRP sa potom centrifugoval pri 800 x g počas 20 minút, supernatant sa zlikvidoval a peleta sa resuspendovala v Tyrodovom pufri (134 mmol/l NaCl, 12 mmol/l NaHC03, 2,9 mmol/l KCl, 0,34 mmol/l Na2HPO4,1 mmol/l MgCl2, 10 mmol/l HEPES) obsahujúcich 5 mmol/l glukózy a 3 mg/ml BSA.

4.4. Prietoková cytometria

Čerstvo izolované krvné doštičky (106) sa resuspendovali v 50 ul Tyrodovho pufra. Krvné doštičky boli inkubované (RT počas 30 minút) s fluoresceín izotiokyanátom (FITC) konjugovaným anti-myším CD41 (klon MWReg30, BioLegend, San Diego, CA, USA) a alofykokyanínom (APC) konjugovaným anti-myším/potkaním CD62P (klon RMP{ {9}}, Biolegend). Minimálne 10{11}} udalostí na bránu bolo získaných pomocou MACsQuant Analyzer 10 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA) a analyzovaných pomocou softvéru FlowLogic (Innovation, Sydney, Austrália). Krvné doštičky sa odlišovali špecifickou väzbou anti-CD41 a charakteristickým dopredným a bočným rozptylom. Krvné doštičky zafarbené pozitívne na CD41 a CD62P boli označené ako aktivované krvné doštičky.

4.5. Konfokálna a svetelná mikroskopia

Krvné doštičky (10}7) z potkanov Sham alebo CLP alebo stimulované s LPS alebo bez neho sa nechali priľnúť na permanoxové sklíčka (Lab-Tek, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Adherované bunky boli fixované v 10% formalíne počas 30 minút, premyté 3x PBS počas 10 minút pri teplote miestnosti a permeabilizované ľadovo studeným 100% metanolom počas 10 minút. Sklíčka boli blokované v PBS s 10 percentným kozím a králičím sérom počas 1 hodiny, premyté a inkubované s králičou anti-NLRP3 protilátkou (NBP2-12446, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA) počas 2 hodín pri teplote miestnosti. Sklíčka sa potom premyli a inkubovali s anti-králičím Alexa Fluor 488 (A11070, Thermo FisherScientific) počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Sklíčka sa znova premyli a inkubovali sa s Alexa Fluor647-konjugovanou králičou anti-ASC protilátkou (NBP1-78977AF647, Novus Biologicals) počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Kontroly boli spracované identicky, s výnimkou vynechania primárnych protilátok. Prípravky boli namontované v Cytoseal 60 (Thermo Fisher Scientific) a analyzované na konfokálnom skenovacom mikroskope Nikon C1 (Nikon Inc., Melville, NY, USA). Obrázky boli zachytené pomocou mikroskopu Nikon Eclipse 55i vybaveného farebnou kamerou Nikon-Fi1 (Nikon) a analyzované pomocou softvéru NIS-Elements D 3.0.

4.6. Kvantifikácia biomarkerov endotelovej aktivácie a cytokínov

Plazmatické hladiny angiopoetínu-2 (MANG20, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) a Endocan-1 (MBS039900, MyBioSource, San Diego, CA, USA) sa merali ako markery endoteliálnej dysfunkcie pomocou testu ELISA podľa podľa protokolu výrobcu. plazma,obličkya pľúcna IL-1 (RLB{1}}, R&D Systems) a IL-18 (ab213909, Abcam, Boston, MA, USA) boli kvantifikované pomocou ELISA podľa protokolu výrobcu.Obličkya pľúcne lyzáty sa pripravili pomocou súpravy BioPlex Cell Lysis Kit (171304011, BioRad, Hercules, CA, USA) podľa protokolu výrobcu.

4.7. Posúdenie poškodenia pľúc

Histological evaluation was performed on the lungs via hematoxylin and eosin (H&E)staining. A lung lobe was formalin-fixed. The tissue was subsequently paraffin-embedded and 5-µm sections were stained with (H&E). Sections were evaluated for neutrophil infiltration into the alveolar space. Five sections were scored in a blinded fashion on a scale of0–2 with 0 representing o neutrophils in the alveolar space, 1 representing 1–5 neutrophils in the alveolar space, and 2 representing >5 neutrofilov v alveolárnom priestore. Snímky boli zachytené pomocou mikroskopu Nikon Eclipse 55i vybaveného farebnou kamerou Nikon DS-Fi1 (Nikon Inc.) pri 40X pomocou softvéru NIS-Elements D 3.{10}}. Hrúbka alveolárnej steny bola meraná pomocou softvéru NIS-Elements D 3.0. Údaje boli normalizované na simulované hodnoty.

4.8. Hodnotenie renálneho glomerulárneho poškodenia

Obličkywere collected, weighed, and fixed in a 10% buffered formalin solution. Paraffin sections (3 µm) were prepared and stained with Periodic acid-Schiff to assess the degree of glomerular injury on approximately 30 images per section, per rat. Thirtyglomeruli per section were scored in a blinded fashion on a 0–4 scale with 0 representing a normal glomerulus, 1 representing a 25% loss, 2 representing a 50% loss, 3 representing a 75% loss, and 4 representing >75-percentná strata kapilár v chumáčiku. Obrázky boli zachytené pomocou rovnakého mikroskopu, fotoaparátu a softvéru, ako bolo uvedené vyššie.

4.9. Meranie funkcie obličiek

Počas procedúry CLP bol katéter zavedený do jugulárnej žily a subkutánne vyvedený na zadnej strane krku. Katéter sa preplachoval heparinizovaným fyziologickým roztokom každý deň až do konca trojdňového protokolu. V posledný deň protokolu sa potkany podrobili krátkej anestézii izofluránom, aby mohli zostaviť zariadenie NIC-Kidney (MediBeacon; Mannheim, Nemecko) vyrobené z dvoch diód vyžarujúcich svetlo, ktoré excitujú FITC sinistrín pri 480 nm, fotodiódu, ktorá vyžaruje svetlo pri 531 nm, mikroprocesor a batéria. Toto zariadenie bolo pripevnené na chrbát potkana pomocou obojstrannej lepiacej náplasti (MediBeacon) a pripevnené plášťom pre hlodavce k oholenej oblasti na chrbte potkana. Potkany sa nechali zotaviť v oddelených klietkach počas 15 minút a zaznamenalo sa základné meranie. Po základných meraniach bola cez jugulárnu žilu podaná bolusová injekcia FITC-sinistrín (5 mg/100 g telesnej hmotnosti; FTC-FS001, MediBeacon), po ktorej nasledovala bolusová injekcia sterilného fyziologického roztoku. Počas dvoch hodín po bolusovej injekcii sa transkutánne merala kinetika vylučovania FITC-sinistrín a použila sa na výpočet eliminačného polčasu (t1/2) FITC-sinistrín pomocou jednokompartmentového modelu s vyhodnocovacím softvérom MDPLab (MediBeacon) na výpočet GFR z validovaného empiricky odvodeného konverzného faktora [35,36].

cistanche recenzia: zlepšuje funkciu obličiek

4.10. Štatistická analýza

Analýza sily určuje, že n z 10–12 zvierat/skupina by dosiahlo mocninu (1- ) 0.80 a pravdepodobnosť chyby typu 1 ( ) 0,05, aby sa zistil rozdiel aspoň 5–10 percent v aktivácii krvných doštičiek medzi potkanmi Sham a CLP. Všetky údaje sú vyjadrené ako priemer ± SD. Všetky údaje boli skontrolované, aby boli konzistentné s Gaussovým rozdelením pomocou D'Agostino-Pearsonovho testu normality. Štatistické analýzy sa uskutočňovali pomocou jednosmernej ANOVA s Tukeyho testom viacnásobného porovnávania ako post hoc analýza. Hodnota p < 0,05="" sa="" považovala="" za="" štatisticky="">

Príspevky autora:

Konceptualizácia, CAS, JMW a DCC; metodika, JMW a D.CC; validácia, OKT, JMW a DCC; formálna analýza, MB-R., CAS, OKT, JMW a D.CC; vyšetrovanie, MB-R., CAS, OKT, RWT, CHB, CAG, GAT, JMW a DCC; zdroje, JMW a DCC; spravovanie údajov, MB-R., CAS a DCC; písanie – príprava pôvodného návrhu, MB-R. a CAS; písanie – recenzia a úprava, MB-R., CAS, OKT, RWT, CHB, CAG, GAT, JMW a DCC; vizualizácia, MB-R., CAS, JMW a DCC; dohľad, OKT a DCC; administrácia projektu, DCC; získanie financovania, DCC Všetci autori si prečítali a súhlasili s publikovanou verziou rukopisu.

Financovanie:

Výskum uvedený v tejto publikácii podporil Národný inštitút všeobecných lekárskych vied Národného inštitútu zdravia pod číslom ocenenia P20GM104357 a P30GM103328. Tento výskum bol financovaný Národným inštitútom srdca, pľúc a krvi Národných inštitútov zdravia pod číslami ocenenia F31HL149257 (OKT), R00HL130456 (DCC) a R01HL151407 (DCC) a Národným inštitútom pre diabetes a trávenie aObličkyChorobyNárodného inštitútu zdravia pod číslom ocenenia R01DK109133 (JMW) Za obsah sú výlučne zodpovední autori a nemusí nevyhnutne predstavovať oficiálne názory Národného inštitútu zdravia.

Vyhlásenie inštitucionálnej revíznej rady:

Všetky experimentálne postupy uskutočnené v tejto štúdii boli uskutočnené v súlade s usmerneniami Národného inštitútu zdravia pre používanie zvierat a starostlivosť o ne. Všetky protokoly boli schválené Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie na University of Mississippi Medical Center (protokol 1487A, schválený 07.02.2019). Starostlivosť a zaobchádzanie so zvieratami boli v súlade s usmerneniami Národného inštitútu zdravia pre etické zaobchádzanie so zvieratami.

Vyhlásenie o dostupnosti údajov:

Všetky údaje na podporu uvedených výsledkov sú uvedené v rukopise a sú voľne dostupné.

Konflikt záujmov:

Autori nevyjadrujú žiadny konflikt záujmov.

Referencie

1. Greco, E.; Lupia, E.; Bosco, O.; Vizio, B.; Montrucchio, G. Krvné doštičky a multiorgánové zlyhanie pri sepse. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18, 2200.
2. Rhee, C.; Dantes, R.; Epstein, L.; Murphy, DJ; Seymour, CW; Iwashyna, TJ; Kadri, SS; Angus, DC; Danner, RL; Fiore, AE; a kol. Výskyt a trendy sepsy v nemocniciach v USA s použitím údajov z klinických verzus tvrdení, 2009–2014. JAMA 2017, 318, 1241–1249.
3. Kim, WY; Hong, SB sepsa a syndróm akútnej respiračnej tiesne: Nedávna aktualizácia. Tuberc. Respir. Dis. (Soul) 2016, 79, 53–57.
4. Alobaidi, R.; Basu, RK; Goldstein, SL; Bagshaw, akútne poškodenie obličiek spojené so sepsou SM. Semin. Nephrol. 2015, 35, 2–11.
5. Umbro, I.; Gentile, G.; Tinti, F.; Muresan, P.; Mitterhofer, AP Nedávne pokroky v patofyziológii a biomarkeroch akútneho poškodenia obličiek vyvolaného sepsou. J. Infect. 2016, 72, 131–142.
6. Bilevicius, E.; Dragosavac, D.; Dragosavac, S.; Araujo, S.; Falcao, AL; Terzi, RG Viacnásobné orgánové zlyhanie u septických pacientov. Braz. J. Infect. Dis. 2001, 5, 103-110.
7. Liu, V.; Escobar, GJ; Greene, JD; Soule, J.; Whippy, A.; Angus, DC; Iwashyna, TJ Hospital úmrtia u pacientov so sepsou z 2 nezávislých kohort. JAMA 2014, 312, 90–92.
8. Katz, JN; Kolappa, KP; Becker, RC Beyond trombóza: Všestranné krvné doštičky pri kritickom ochorení. Truhlica 2011, 139, 658–668.
9. Smyth, SS; McEver, RP; Weyrich, AS; Morrell, CN; Hoffman, MR; Arepally, GM; Francúzština, PA; Dauerman, HL; Becker, RC; Doštičkové kolokvium, P. Doštičkové funkcie mimo hemostázy. J. Thromb. Haemost. 2009, 7, 1759–1766.
10. de Stoppelaar, SF; van 't Veer, C.; van der Poll, T. Úloha krvných doštičiek pri sepse. Thromb. Haemost. 2014, 112, 666–677.
11. Nawaz, M.; Dickfeld, T.; Bogner, C.; Fateh-Moghadam, S.; Neumann, FJ Funkcia krvných doštičiek pri syndrómoch septickej dysfunkcie viacerých orgánov. Intensive Care Med. 1997, 23, 379-385.
12. Layios, N.; Delierneux, C.; Hego, A.; Huart, J.; Gosset, C.; Lecut, C.; Maes, N.; Geurts, P.; Joly, A.; Lancellotti, P.; a kol. Predikcia sepsy u kriticky chorých pacientov pomocou markerov aktivácie krvných doštičiek pri prijatí na JIS: Prospektívna pilotná štúdia. Intensive Care Med. Exp. 2017, 5, 32.
13. Russwurm, S.; Vickers, J.; Meier-Hellmann, A.; Spangenberg, P.; Bredle, D.; Reinhart, K.; Losche, W. Aktivácia krvných doštičiek a leukocytov koreluje so závažnosťou dysfunkcie septických orgánov. Šok 2002, 17, 263–268.
14. Vanderschueren, S.; De Weerdt, A.; Malbrain, M.; Vankersschaever, D.; Frans, E.; Wilmer, A.; Bobbaers, H. Trombocytopénia a prognóza v intenzívnej starostlivosti. Crit. Care Med. 2000, 28, 1871–1876.
15. Theofanis, E.; Semitekolou, M.; Morianos, I.; Sanitas, K.; Xanthou, G. Zacielenie na aktiváciu zápalu NLRP3 pri ťažkej astme. J. Clin. Med. 2019, 8, 1615.
16. Haque, ME; Akther, M.; Jakaria, M.; Kim, IS; Azam, S.; Choi, DK Zacielenie na mikrogliálny zápal NLRP3 a jeho úloha pri Parkinsonovej chorobe. MOV. Porucha. 2020, 35, 20–33.
17. Liu, L.; Dong, Y.; Ty, M.; Jin, S.; Yang, J.; Joosse, ME; Sun, Y.; Zhang, J.; Lazarev, M.; Brant, SR; a kol. Patogénna úloha aktivácie zápalu NLRP3 pri zápalových črevných ochoreniach myší aj ľudí. J. Crohnova kolitída 2017, 11, 737–750.
18. Danielski, LG; Giustina, AD; Bonfante, S.; Barichello, T.; Petronilho, F. Inflammasóm NLRP3 a jeho úloha vo vývoji sepsy. Zápal 2020, 43, 24–31.
19. Luo, YP; Jiang, L.; Kang, K.; Fei, DS; Meng, XL; Nan, CC; Pan, SH; Zhao, MR; Zhao, MY Hemin inhibuje aktiváciu zápalu NLRP3 pri akútnom poškodení pľúc vyvolanom sepsou vrátane hemoxygenázy-1. Int. Immunopharmacol. 2014, 20, 24–32.

20. Moon, JS; Lee, S.; Park, MA; Siempos, II; Haslip, M.; Lee, PJ; Yun, M.; Kim, CK; Howrylak, J.; Ryter, SW; a kol. UCP2-indukovaná syntáza mastných kyselín podporuje aktiváciu zápalu NLRP3 počas sepsy. J. Clin. Vyšetrovať. 2015, 125, 665–680.

[PubMed]21. Gong, Z.; Zhou, J.; Li, H.; Gao, Y.; Xu, C; Zhao, S.; Chen, Y.; Cai, W.; Wu, J. Kurkumín potláča aktiváciu zápalu NLRP3 a chráni pred septickým šokom vyvolaným LPS. Mol. Nutr. Food Res. 2015, 59, 2132–2142.
22. Wang, P.; Huang, J.; Li, Y.; Chang, R.; Wu, H.; Lin, J.; Huang, Z. Exogénny oxid uhoľnatý znižuje akútne poškodenie obličiek vyvolané sepsou a inhibuje aktiváciu zápalu NLRP3 u potkanov. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 20595–20608.
23. Kalbitz, M.; Fattahi, F.; Trailer, JJ; Jajou, L.; Malan, EA; Kameň, FS; Huber-Lang, M.; Russell, MW; Ward, komplement PA indukoval aktiváciu srdcového zápalu NLRP3 pri sepse. FASEB J. 2016, 30, 3997–4006.
24. Bernard, GR; Vincent, JL; Laterre, PF; LaRosa, SP; Dhainaut, JF; Lopez-Rodriguez, A.; Steingrub, JS; Garber, GE; Helterbrand, JD; Ely, EW; a kol. a rekombinantný ľudský proteín CWEiSSsg. Účinnosť a bezpečnosť rekombinantného ľudského aktivovaného proteínu C pri ťažkej sepse. N. Engl. J. Med. 2001, 344, 699-709.
25. Iba, T.; Thachil, J. Súčasnosť a budúcnosť antikoagulačnej terapie s použitím antitrombínu a trombomodulínu na diseminovanú intravaskulárnu koaguláciu spojenú so sepsou: perspektíva z Japonska. Int. J. Hematol. 2016, 103, 253–261.
26. Cornelius, DC; Baik, CH; Travis, dobre; biela, DL; Young, CM; Austin Pierce, W.; Shields, CA; Poudel, B.; Williams, JM Aktivácia zápalu NLRP3 v krvných doštičkách v reakcii na sepsu. Physiol. Rep. 2019, 7, e14073.
27. Cornelius, DC; Travis, dobre; Tramel, RW; Borges-Rodriguez, M.; Baik, CH; Greer, M.; Giachelli, CA; Tardo, GA; Williams, JM inhibícia zápalu NLRP3 zmierňuje aktiváciu krvných doštičiek vyvolanú sepsou a zabraňuje poškodeniu viacerých orgánov pri punkcii slepého čreva. PLoS ONE 2020, 15, e0234039.
28. Asaduzzaman, M.; Lavasani, S.; Rahman, M.; Zhang, S.; Braun, OO; Jeppsson, B.; Thorlacius, H. Krvné doštičky podporujú pulmonálny nábor neutrofilov pri abdominálnej sepse. Crit. Care Med. 2009, 37, 1389–1396.
29. Schrier, RW; Wang, W. Akútne zlyhanie obličiek a sepsa. N. Engl. J. Med. 2004, 351, 159–169.
30. Vincent, JL; Yagushi, A.; Pradier, O. Funkcia krvných doštičiek pri sepse. Crit. Care Med. 2002, 30, S313 – S317.
31. Liverani, E.; Rico, MC; Tsygankov, AY; Kilpatrick, LE; Kunapuli, SP P2Y12 receptor moduluje sepsou indukovaný zápal. Arter. Thromb. Vasc. Biol. 2016, 36, 961–971. [CrossRef]
32. Siner, JM; Bhandari, V.; Engle, KM; Eliáš, JA; Siegel, MD Zvýšené hladiny angiopoetínu 2 v sére sú spojené so zvýšenými
úmrtnosť pri sepse. Šok 2009, 31, 348–353.
33. Scherpereel, A.; Depontieu, F.; Grigoriu, B.; Cavestri, B.; Tsicopoulos, A.; Gentile, T.; Jourdain, M.; Pugin, J.; Tonnel, AB; Lassalle, P. Endocan, nový endoteliálny marker v ľudskej sepse. Crit Care Med. 2006, 34, 532–537.
34. Valerio-Rojas, JC; Jaffer, IJ; Kor, DJ; Gajič, O.; Cartin-Ceba, R. Výsledky pacientov so závažnou sepsou a septickým šokom na chronickej protidoštičkovej liečbe: Historická kohortová štúdia. Crit. Care Res. Prax. 2013, 2013, 782573.
35. Pill, J.; Issaeva, O.; Wonderer, S.; Sadick, M.; Kranzlin, B.; Fiedler, F.; Klotzer, HM; Kramer, U.; Gretz, N. Farmakologický profil a toxicita sinistrínu značeného fluoresceínom, nového markera pre merania GFR. Naunyn-Schmiedebergov oblúk. Pharmacol. 2006, 373, 204–211.
36. Pill, J.; Kraenzlin, B.; Jander, J.; Sattelkau, T.; Sadick, M.; Kloetzer, HM; Deus, C.; Kraemer, U.; Gretz, N. Fluoresceínom značený sinistrín ako marker rýchlosti glomerulárnej filtrácie. Eur. J. Med. Chem. 2005, 40, 1056-1061.