Ochranné humorálne a bunkové imunitné reakcie na SARS-CoV-2 pretrvávajú až 1 rok po zotavení

Očkovanie proti SARS-CoV-2 bolo spustené na celom svete s cieľom vybudovať účinnú imunitu na úrovni populácie s cieľom obmedziť šírenie tohto vírusu. Účinnosť a trvanie ochrannej imunity sú rozhodujúce faktory pre verejné zdravie. Tu uvádzame kinetiku imunitnej odpovede špecifickej pre SARS-CoV-2 u 204 jedincov do 1-roka po uzdravení z COVID-19. Koncentrácie RBD-IgG a spike-IgG s plnou dĺžkou a sérová neutralizačná kapacita klesajú počas prvých 6 mesiacov, ale udržiavajú sa stabilne až 1 rok po prepustení z nemocnice. Dokonca aj jedinci, ktorí vytvorili vysoké hladiny IgG počas skorých štádií rekonvalescencie, mali hladiny IgG, ktoré sa o rok neskôr znížili na podobnú úroveň.

Stádová imunita označuje účinnú ochranu neočkovaných alebo neinfikovaných ľudí v spoločnosti, keď stále viac ľudí v spoločnosti získalo imunitu voči určitej chorobe očkovaním alebo prirodzenou infekciou. Tým sa znižuje možnosť šírenia a výskytu epidémie. Vo všeobecnosti, keď 70 až viac ako 90 percent populácie v spoločnosti získalo imunitu voči chorobe, populačná imunita spoločnosti môže dosiahnuť dostatočnú úroveň na ochranu neočkovaných alebo neinfikovaných ľudí. Infikovaní ľudia sú voči chorobe imúnni.

Zároveň si musíme zlepšiť aj imunitu, čo si vyžaduje správne životné návyky ako zdravá strava a dostatok pohybu. Okrem toho sme zistili, že Cistanche dokáže zlepšiť aj imunitu. Cistanche je bohatá na antioxidačné látky, ktoré dokážu redukovať voľné radikály v ľudskom tele. úlohu, čím sa zvyšuje imunita.

Kliknite na výhody cistanche tubulosa

Najmä hladina RBD-IgG pozitívne koreluje so sérovou neutralizačnou kapacitou, čo naznačuje reprezentatívnu úlohu RBD-IgG pri predpovedaní sérovej ochrany. Okrem toho vírusovo špecifická bunková imunitná ochrana, vrátane hrotovej a nukleoproteínovej špecifickej, pretrvávala medzi 6 mesiacmi a 12 mesiacmi. Naša štúdia celkovo podporuje pretrvávanie vírusovo špecifickej ochrannej imunity počas 1 roka.

Imunitné reakcie špecifické pre vírusy závažného akútneho respiračného syndrómu koronavírusu 2 (SARS-CoV-2) sú rozhodujúce pre potlačenie replikácie vírusu, zmiernenie závažnosti ochorenia a prevenciu reinfekcie1–4. Jednotlivci, ktorí sa zotavili z infekcie SARS-CoV-2 divokého typu, by mohli krížovo chrániť pred reinfekciou mutantom D614G1. Deng a kol. preukázali, že primáty (okrem človeka) vystavené SARS-CoV-2 vyvíjajú silné protilátkové reakcie v modeli infekcie makaka rhesus a sú väčšinou imúnne voči reinfekcii2.

In a clinical trial testing the protective effect of neutralizing antibodies, outpatients who received neutralizing antibody therapy were less likely to have a COVID-19–related hospitalization or visit to an emergency department and were less likely to develop severe symptoms3. A two-dose regimen of BNT162b2 elicited robust immune protection against COVID-19 in persons aged >16 rokov 4. U pacientov v rekonvalescencii a príjemcov vakcíny SARS-CoV-2 sa zvyčajne vytvárajú silné imunitné reakcie. Ochranné imunitné odpovede proti infekcii SARSCoV-2 pozostávajú z dvoch hlavných častí, z humorálneho imunoglobínu (IgA a IgG) a z odpovedí T-buniek.

Ideálnym cieľom je dosiahnuť sterilnú infekciu; väčšina štúdií sa preto zameriava na ochrannú analýzu IgG v sére pre jeho ľahkú dostupnosť1,2,4,5. Silná imunitná ochrana T buniek sa zameria na bunky obsahujúce vírus, obmedzí šírenie vírusu in vivo, urýchli odstraňovanie vírusu a zmierni záťaž chorobou. Vírusovo špecifické humorálne odpovede a odpovede T-buniek môžu s miernym poklesom trvať až 6 až 8 mesiacov u zotavujúcich sa jedincov so SARS-CoV-25,6. To, či možno ochrannú imunitnú pamäť udržať dlhodobo a či protilátky alebo T bunky môžu poskytnúť trvalú ochranu, si vyžaduje ďalšie skúmanie a pochopenie tejto oblasti bude prínosom aj pre vývoj vakcín.

Tu analyzujeme dynamické zmeny vírusovo špecifických humorálnych a bunkových imunitných odpovedí až do 1 roka v skupine dlhodobého sledovania COVID-19. V tejto reprezentatívnej skupine pacientov sa hladiny IgM a IgA špecifické pre SARS-CoV{5}} v priebehu 1 roka podstatne znížili na základné hodnoty. Špičková ochranná kapacita IgG a séra výrazne klesla počas prvých 6 mesiacov, ale udržala sa až 1 rok. Imunitné reakcie T-buniek špecifické pre SARS-CoV{11}} zostali stabilné až 1 rok po prepustení z nemocnice. Tieto zistenia naznačujú, že ochranné imunitné reakcie proti SARS-CoV-2 môžu trvať najmenej 1 rok.

Výsledky

charakteristiky kohorty COVID{0}}.

Na tejto následnej štúdii sa zúčastnila reprezentatívna kohorta 204 uzdravených jedincov (68,2 percenta) z 299 pacientov za rovnaké obdobie, ktorí boli prijatí do 8. ľudovej nemocnice Guangzhou, Guangzhou, Čína, od 20. januára do 29. februára 2020. Z týchto účastníkov bolo 29 diagnostikovaných ako s vážnymi symptómami, 162 ako stredne ťažké, 12 ako mierne a jeden ako asymptomatické (tabuľka 1). Ich vek a pohlavie boli reprezentatívne pre celú populáciu pacientov (dodatok obr. 1). Okrem jediného asymptomatického pacienta všetci jednotlivci darovali krvné vzorky vo viacerých časových bodoch; našťastie 50 jedincov (24,5 percenta z 204) absolvovalo celé kolo sledovania a prispeli vzorkami krvi vo všetkých štyroch časových bodoch sledovania. Bolo teda možné kinetické hodnotenie imunitnej pamäte. Stručne povedané, sledovaná kohorta predstavuje celú populáciu pacientov s COVID{20}} v Guangzhou na začiatku roka 2020.

Pozdĺžne zmeny humorálnych protilátok proti SARSCoV-2.

Doména viažuca receptor (RBD) vrcholového SARS-CoV-2 hrá zásadnú úlohu vo väzbe vírusu na jeho receptor, enzým konvertujúci angiotenzín 2 (ACE2), hladiny RBD-špecifickej protilátky korelujú a predstavujú jeho neutralizačná kapacita 7. Analyzovali sme kinetiku cirkulujúcich RBD-špecifických IgM, IgA a IgG protilátok v priebehu času s dvojstupňovými nepriamymi imunotestovými súpravami pre elektrochemiluminiscenčné imunotesty8.

First, all patients were positively seroconverted (at least one IgM >1 COI, IgA >1 COI, or IgG >1 COI) s aspoň jednorazovým bodom, čo potvrdzuje skutočnú infekciu SARS-CoV-2 u všetkých vybraných pacientov. Ťažkí pacienti generovali významne vyššie RBD-IgA, RBD-IgG a spike-IgG, ale nie RBD-IgM, ako stredne ťaží pacienti v štádiu nemocnice (obr. 1a–d a príloha obr. 2). Náš výsledok podporil, že dlhšie vystavenie imunitného systému vírusom zvýšilo tvorbu vírusovo špecifických protilátok.

Ďalej sme zistili, že hladina RBD-špecifických IgM sa dramaticky znížila z 4,669 (priemerné COI, ďalej) na 0,785 (negatívne) (asi šesťnásobne, p < 0.0 001, nepárový t-test s Welchovou korekciou) do 3 mesiacov po prepustení (obr. 1a). RBD-špecifické IgA tiež podstatne klesli z 9,283 na 3,234 (iba 2.{16}}krát, p < 0,0001, nepárový t-test s Welchovou korekciou) v priebehu 3 mesiacov, ale udržal sa až 6 mesiacov (3,491, p { {24}}.073, nepárový t-test s Welchovou korekciou). Nakoniec sa RBD-IgA stal negatívnym v 12-mesačnom bode (0,57) (p < 0,0001, nepárový t-test s Welchovou korekciou) (obr. 1b). Pretože IgA plní v sliznici neutralizačnú funkciu, očakávalo sa, že jeho sérové ​​hladiny budú nižšie dokonca aj na vrchole ako v tkanivách sliznice. To, či si tkanivá slizníc dokážu udržať stabilný IgA, si vyžaduje ďalšie skúmanie.

RBD-IgG bol považovaný za kritický indikátor imunitnej ochrany proti vírusovej infekcii. Naša analýza ukázala, že RBDIgG mal 2.{2}}násobné zníženie z 825 na 287 AU/ml počas prvých 3 mesiacov (p < 0,0001, nepárový t-test s Welchovou korekciou) a ďalej na 153 AU/ml v 6-mesačných časových bodoch (p=0,0033) (obr. 1c, nepárový t-test s Welchovou korekciou), čo bolo v súlade s predchádzajúcimi správami5,6 .

Pozoruhodné je, že hladiny RBD-IgG sa stabilne udržiavali až 1 rok (170 AU/ml v priemere, obr. 1c). Hladina spike-IgG s plnou dĺžkou, meraná nezávisle, vykazovala podobný vzor ako RBD-IgG (obr. 1d), čo ďalej potvrdzuje vyššie uvedené pozorovanie, že protilátka zostane stabilná od 6 mesiacov do 1 roka po rýchlom poklese.

Hladiny RBD-IgG a spike-IgG plnej dĺžky vykazovali silnú pozitívnu koreláciu (r=7411, p < 0.0001,n=474, Pearsonova korelácia, obr. 1e). Silná pozitívna korelácia medzi RBD-IgG a spike-IgG plnej dĺžky bola pozorovaná vo viacerých časových bodoch (obr. 1e a príloha obr. 3).

Thus, RBD-IgG was used in the following analysis. To investigate what kind of patients tends to maintain long-term RBD-IgG-producing capacity, we test the influence of initial antibody titers on antibody persistence. We divided the follow-up individuals with at least the first three follow-up visits into high RBD-IgG (maximal titer >1000 AU/ml) a nízke (100 < maximálny titer<1000 AU/ml) groups. We observed that the high group had significantly higher RBD-IgG levels at the in-hospital stage (p = 0.0004, an unpaired t-test with Welch's correction), 1-month (p = 0.0026, an unpaired t-test with Welch's correction), and 3-month (p = 0.0363, an unpaired t-test with Welch's correction) visits. But the difference diminished at the 6-month visit (p = 0.2212, an unpaired t-test with Welch's correction) and the 12-month visit (p = 0.7074) (Fig. 1f). Next, we demonstrated that disease severity does not necessarily contribute to higher RBD-IgG maintenance with individuals with at least three continuous follow-up serum samples (Fig. 1g). Therefore, our results showed that neither the antibody levels nor the disease severity would affect the RBD-specific IgG antibody persistence.

Fig. 1 Kinetics of SARS-CoV-2 viral-specific antibodies up to 1 year. SARS-CoV-2-infected individuals who attended the follow-up program were included in this analysis. a–c RBD-IgM, IgA, and IgG changes since symptom onset. x-axis, follow-up time (day). y-axis, antibody titer (COI cut-off index; or arbitrary unit, AU/ml). The shaded regions represent the in-patient stage. The average values in the 1-month, 3-month, 6-month, and 12-month stages were labeled. P values (two-tailed) were shown. Mild (black dots), moderate (blue dots), and severe (red dots) symptoms. d Full-length spike-IgG changes since symptom on-set. x-axis, follow-up time (day). y-axis, antibody titer (AU/ml). e Correlation of RBD-IgG and Spike-IgG. In-hospital stage (black), 1-month follow-up (red), 3-month follow-up (blue), 6-month follow-up (purple), and 12-month follow-up (green). Pearson r number and p-value (two-tailed) were shown. f Longitudinal analysis of RBD-specific IgG between patients with high titer (RBD-IgG >1000 AU/ml, oranžový kruh) a pacienti s nízkym titrom (RBD-IgG<1000 AU/ml, empty circle). g Longitudinal analysis of RBD-specific IgG between severe patients (red circle) and moderate patients (pink circle). Lines in the x-axis and y-axis in a–e indicate the cut-off values. a–d, Mean values were labeled for each column. f, g, Data were presented as median with interquartile range. An unpaired t-test with Welch's correction analysis was applied, and p-values (two-tailed) were labeled. Source data are provided as a Source Data file.

Kinetika sérovej ochrany proti SARS-CoV-2.

Uskutočnili sme test mikroneutralizácie séra pomocou živého infekčného systému SARSCoV{0}}, zlatého štandardu na vyhodnotenie ochrany séra pred vírusovou infekciou, aby sme zistili, či sérum stále chráni pred infekciou SARS-CoV-2. Zistili sme, že sérové ​​neutralizačné titre sa znížili z 1 mesiaca na 3 mesiace (p=0,0024, nepárový t-test s Welchovou korekciou) a 6 mesiacov (p=0,0168, nepárový t- test s Welchovou korekciou), podobným spôsobom ako RBD-IgG a Spike-IgG (obr. 2a). Následne zostali stabilné až do 12-mesiaca (p=0 0,591, nepárový t-test s Welchovou korekciou), čo naznačuje, že špecifická humorálna ochrana SARSCoV{19}} môže pretrvávať dlhodobo.

Keďže závažní pacienti vytvárali vysoké hladiny protilátok ako stredne závažní pacienti, stále nebolo známe, či vysoké hladiny môžu poskytnúť účinnejšiu ochranu. Zistili sme, že závažné symptómy viedli iba k prechodne vyššej neutralizačnej kapacite v skoršom štádiu rekonvalescencie (p=0,020, nepárový t-test s Welchovou korekciou), ktorá sa od 3-mesiaca zmenšila na { {4}}ročná návšteva (doplnok obr. 4).

Potom sme analyzovali koreláciu RBD-IgG so sérovou mikroneutralizáciou. Zistili sme, že medzi RBD-IgG a neutralizáciou existuje významná pozitívna korelácia (r=0.4070, p < 0.0001, n {{6} }, Pearsonova korelácia) (obr. 2b). Nie je prekvapujúce, že hladiny Spike-IgG mali pozitívnu koreláciu so sérovou neutralizačnou kapacitou (Suppp. Obr. 4). Je potrebné poznamenať, že korelácia medzi RBD-IgG a neutralizáciou séra nedosiahla štatistickú významnosť počas štádia hospitalizácie (r=0.2101, p=0.0905, Pearsonova korelácia, príloha Obr. 5a), zatiaľ čo pozitívne udržiavané na 1-mesiaci (r=0,3952, p < 0,0001, Pearsonova korelácia), 3-mesiac (r=0,2769, p=0. 0135, Pearsonova korelácia), 6-mesiac (r=3846, p=0,0005, Pearsonova korelácia) a 12-mesiac (r=0,5216, p < 0,0001, Pearsonova korelácia) návštev (Suppp. Obr. 5b–e).

Kinetika imunitnej odpovede T-buniek špecifickej pre SARS-CoV-2.

Vírusovo špecifické pamäťové T bunky môžu nakoniec znížiť závažnosť ochorenia odstránením buniek infikovaných vírusom9, čím sa vytvorí ďalšia životne dôležitá vetva v boji proti vírusovej infekcii, keď k nej dôjde. Aby sme zistili, či ochranná T bunková imunitná odpoveď môže pretrvávať, vytvorili sme nukleoproteínový (N) peptidový pool kvôli jeho najhojnejším vírusovým proteínom10 a Spike peptidové pooly kvôli ich dôležitosti pri vírusovej infekcii a širokej aplikácii6. Peptidy s hrotmi sa použili na vytvorenie zásob peptidov S1 a S2 na pohodlnú manipuláciu. Použili sme tri peptidové skupiny na analýzu imunosorbentných škvŕn s enzýmom spojeným s gama interferónom (IFN- ) (ELISPOT) vírusovo špecifických T buniek pomocou čerstvých izolovaných PBMC z 6-mesačných a 12-mesačných návštev. Boli zobrazené výsledky detekcie ELISPOT od jedného reprezentatívneho jedinca (obr. 3a).

V porovnaní s pacientmi v rekonvalescencii v nemocnici sa celkový počet buniek vylučujúcich IFN špecifický pre vírus znížil pri 6-mesačných návštevách a zostal stabilný počas 12-mesačných návštev (obr. 3b). Podobné zmeny boli pozorované pre proteíny N, S1 a S2 (obr. 3c). Zdá sa, že u ťažkých pacientov vzniká pretrvávajúca silná T bunková imunita proti Spike proteínu (Suppp. Obr. 7). Analýza zloženia bunkovej odpovede SARSCoV-2 T odhalila, že percentá N, S1 a S2 sú dobre udržiavané len s miernym poklesom (obr. 3d), čo naznačuje možnú existenciu dlhotrvajúcej pamäte T just ako infekcia SARS v roku 200311.

Diskusia

V jednom aspekte naša štúdia preukázala, že obe humorálne imunitné reakcie špecifické pre SARS-CoV{1}} možno udržať až 1 rok. Pozorovali sme, že vírusovo špecifické RBD-IgG, Spike-IgG a sérová neutralizačná kapacita rýchlo klesli v priebehu 6 mesiacov, podobne ako v predchádzajúcich správach5, 6, 12, 13. Našťastie tri parametre zostávajú stabilné po dobu 1 roka. Zdá sa, že vírusovo špecifický IgG by mohol chvíľu udržať súčasné hladiny.

Obr. 2 Pozdĺžna analýza sérovej ochrany proti SARS-CoV-2 infekcii. Séra zozbierané z viacerých časových bodov boli testované na infekciu živým vírusom SARS-CoV-2. bol vykonaný mikroneutralizačný test s použitím živého kultivačného systému infekčných buniek SARS-CoV{6}}. os y, záhyby riedenia séra. Údaje boli prezentované ako priemerná hodnota ± SEM. Farebné bodky predstavujú závažnosť ochorenia. Mierne (prázdne bodky), stredné (modré bodky) a závažné (červené bodky) príznaky. Použil sa nepárový t-test s Welchovou korekčnou analýzou a označili sa p-hodnoty (obojstranné). b Korelácia mikroneutralizácie (násobky riedenia) a RBD-IgG (ľubovoľná jednotka, AU/ml). Celkovo sa analyzovalo 475 párov a ukázali sa hodnoty Pearson r a p (obojstranné). Čiary na osi x a os y v aab označujú medzné hodnoty. Zdrojové údaje sa poskytujú ako súbor zdrojových údajov.

Obr. 3 Odpoveď T-buniek špecifická pre SARS-CoV-2 u uzdravených pacientov s COVID-19. Reprezentatívne snímky jamiek ELISpot zobrazujúce bunky vylučujúce IFN. N, S1 a S2, syntetický prekrývajúci sa peptidový pool nukleokapsidu (N), Spike 1 podjednotka (S1) a 2 (S2). Con A, Concanavalin A pozitívna kontrola. b Bodové počty buniek vylučujúcich IFN naznačujúce zníženie imunitnej odpovede špecifickej pre SARS-CoV-2 v priebehu času. Čísla sú súčtom N, S1 a S2-stimulovaných jamiek. Údaje boli prezentované ako medián s medzikvartilovým rozsahom. c Grafy Raincloud ukazujú rôzne úrovne odozvy T-buniek medzi tromi súbormi peptidov v rôznych časových bodoch sledovania. d Waffle bodový graf zobrazujúci percento zloženia odozvy SARS-CoV-2 počas 1-ročného sledovania. Štatistika Mann–Whitney U-test. Bola ukázaná hodnota P (obojstranná). b, c Údaje boli reprezentované ako krabicové grafy (medián s medzikvartilovou, hornou hranicou a dolnou hranicou). Zdrojové údaje sa poskytujú ako súbor zdrojových údajov.

V druhom aspekte naša štúdia ukázala, že odpoveď T-buniek špecifická pre SARS-CoV{1}} by tiež mohla byť relatívne stabilná z dlhodobého hľadiska (obr. 3). Toto pozorovanie je v súčasnej situácii veľmi dôležité. Viaceré notoricky známe kmene14–18, ako napríklad B.1.1.7 (tiež 501Y.V1, britský kmeň), B.1.351 (tiež 501Y.V2, kmeň južnej Afriky), B.1.617.1 a B.1.617.2 (India kmeň), B.1.525 (tiež 20 A, kmeň Nigeria) a B.1.1.28.1 (tiež 501Y.V3, kmeň Brazil) sa objavili buď s väčšou infekčnosťou alebo patogenézou, alebo oboje. Nové mutanty, ktoré sa vyskytujú najmä v doméne RBD, by mohli potenciálne uniknúť neutralizačnej ochrane získanej buď prirodzenou infekciou alebo očkovaním proti SARS-CoV-215,17,18.

Na rozdiel od neutralizačných protilátok nemohli vírusovo špecifické T bunky blokovať vstup vírusu do buniek, ale stále mohli zabiť intracelulárny vírus priamym zničením buniek infikovaných vírusom, ktoré prezentujú vírusové peptidy2,11. Keďže početné vírusové epitopy19 môžu byť produkované z akýchkoľvek vírusových proteínov okrem Spikeho proteínu na prezentáciu hlavného histokompatibilného komplexu, nové mutácie nemohli ľahko prelomiť imunitný dohľad T buniek. Z tohto hľadiska budú vakcíny, ktoré by mohli indukovať trvalé vírusovo špecifické T bunkové imunitné reakcie, sľubné na vybudovanie účinnej populačnej imunity proti SARS-CoV-2.

Metódy

Informácie pre pacienta.

Ôsma ľudová nemocnica Guangzhou, oficiálna nemocnica vymenovaná vládou Guangzhou, prijímala a liečila pacientov s COVID-19 počas prvej vlny endemického šírenia SARS-CoV-2 od januára 2020 do marca 2020. Prijatých bolo 299 pacientov Do tejto retrospektívnej štúdie bola zaradená ôsma ľudová nemocnica v Guangzhou. Do následnej štúdie sa zapojilo dvestoštyri pacientov poskytnutím aspoň raz. Všeobecné informácie o pacientovi vrátane veku, pohlavia a klinickej diagnózy boli zhromaždené z nemocničného informačného systému. Všetci pacienti boli diagnostikovaní podľa kritérií v novom pláne diagnostiky a liečby koronavírusovej pneumónie (skúšobná verzia 7), ktorú vydala Národná komisia pre zdravie a zdravie. Diagnóza závažných symptómov bola podľa nasledujúcich kritérií:

1. Respiračná tieseň, frekvencia dýchania (RR) Väčšia alebo rovná 30-krát/min v pokojovom stave.

2. Nasýtenie kyslíkom Menej alebo rovné 93 percentám v kľudovom stave.

3. Parciálny tlak kyslíka v arteriálnej krvi (PaO2)/koncentrácia kyslíka (FiO2) Menší alebo rovný 300 mmHg).

4. Zhoršené rádiologické zobrazenie hrudníka (röntgenové a CT zobrazenie s vysokým rozlíšením) ako pomôcka.

Stredný symptóm bol diagnostikovaný, keď pacienti mali viditeľný zápal pľúc, horúčku a/alebo iné respiračné symptómy. Mierny symptóm bol diagnostikovaný, keď bol mierne nepohodlný, ale bez príznakov zápalu pľúc. Asymptomatické prípady boli diagnostikované, keď pacienti nemali žiadne známky klinických symptómov, ale bolo potvrdené, že majú SARS-CoV-2 vírusovú RNA pozitívnu počas fázy sledovania po vírusovej expozícii alebo blízkom kontakte s potvrdenými prípadmi.

Definície.

Všetci jednotlivci, ktorí sa zúčastnili tohto následného programu, boli rozdelení do dvoch etáp: hospitalizácia a fáza sledovania. Ten bol ďalej zoskupený ako 1-mesiac (do 60 dní po prepustení), 3-mesiac (70 až 135 dní), 6-mesiac (150 až 220 dní) a {{11 }}mesiac (280 až 360 dní).

Meranie vírusovo špecifických IgA, IgG a IgM protilátok.

Vzorky plazmy alebo séra boli pred testovaním inaktivované pri 56 stupňoch počas 30 minút a skladované pri -80 stupňoch. Protilátky IgA, IgG a IgM proti vrcholovému proteínu SARS-CoV-2 RBD vo vzorkách plazmy sa testovali pomocou dvojkrokových súprav na nepriame imunoanalýzu elektrochemiluminiscenčných imunoanalýz (Kangrun Biotech Co., Ltd.), podľa pokynov výrobcu. Stručne, vzorky séra sa najskôr inkubovali s modifikovanými mikročasticami. Mikročastice boli potiahnuté RBD spike proteínu SARS-CoV-2 a protilátkami značenými akridínesterom proti Fc doméne ľudských protilátok. Po niekoľkých kolách odmytia nenaviazaných látok sa uskutočnila detekcia signálu na automatickom chemiluminiscenčnom imunitnom analyzátore (KAESER1000, Chongqing Cosmax Biotech Co., Ltd.).

Podobne boli IgG protilátky proti SARS-CoV-2 kompletnému Spike proteínu vo vzorkách plazmy testované pomocou dvojkrokových súprav pre nepriame imunoanalýzu elektrochemiluminiscenčných imunoanalýz (Mairui Biotech Co., Ltd.), podľa pokynov výrobcu. Všetky testy boli vykonané za prísnych podmienok biologickej bezpečnosti. Titer protilátky sa testoval raz na vzorku séra. Hladiny protilátok sú prezentované ako namerané hodnoty chemiluminiscencie delené medznou hodnotou (index hraničnej hodnoty, COI). COI<1 was regarded as negative, and COI >1 bol hodnotený ako pozitívny.

Mikroneutralizačný test.

Teplom inaktivované sérum bolo sériovo štvornásobne nariedené (od 1:4 do 1:1024) a potom zmiešané s rovnakým objemom (125 ul) vírusového roztoku obsahujúceho 100 TCID50 SARS-CoV-2. Ďalej sa zmesi sérum-vírus najprv inkubovali počas 2 hodín pri 37 stupňoch a potom sa aplikovali na polokonfluentnú monovrstvu VERO E6 v duplikáte. Po 4-dňovej inkubácii sa vyhodnotili vírusom infikované jamky. Jamky s viditeľným cytopatogénnym účinkom boli definované ako pozitívna vírusová infekcia.

Ľudské IFN-ELISPOT testy

Testy IFN-ELISPO sa uskutočňovali tak, ako bolo opísané vyššie (1) Stručne, filtračné platne MultiScreen 96-jamkové filtre (Merck Millipore, Darmstadt, Nemecko) boli potiahnuté antihumánnou IFN-monoklonálnou protilátkou (U-Cytech, Holandsko, č. CT{101} {5}}) cez noc pri 4 stupňoch C. Jamky boli premyté PBS a blokované R10 médiom (RPMI-1640, 0,05 mM, 2-merkaptoetanol, 1 mM pyruvát sodný, 2 mM L-glutamát, 10 mM 4-(2-hydroxyetyl)-1-kyselina piperazínetánsulfónová [HEPES], 10 % fetálne hovädzie sérum [FBS] a penicilín/streptomycín (1×)) pre 2 h pri 37 stupňoch C. Čerstvo izolované PBMC boli nanesené a stimulované v prítomnosti SARSCOV-2 S1 alebo S2 alebo N peptidových poolov (GenScript, Čína) počas 24 h pri 37 stupňoch C. SARS-COV{{29 }} peptidy majú dĺžku 20 aminokyselín, pričom desať aminokyselín sa prekrýva medzi sekvenčnými peptidmi. Platne sa premyli s PBS-Tween 20 (PBST), nasledovala inkubácia s biotinylovanou antihumánnou IFN-detekčnou protilátkou (U-Cytech, Holandsko, č. CT640-10) a streptavidínom konjugovaným s alkalickou fosfatázou (AKP) (BD , USA, č. 554065). Škvrny boli vyvinuté inkubáciou v NBT/BCIP (Pierce, USA) počas 10 minút. Škvrny sa spočítali pomocou čítačky ELISPOT (Bioreader 4000, BIOSYS, Nemecko). Počet buniek tvoriacich škvrnu (SFC) sa uvádza ako počet buniek vylučujúcich IFN- - špecifických pre antigén na milión PBMC.

Štatistická analýza.

Na analýzu údajov v softvéri GraphPad PRISM (verzia 5.01) sa použil nepárový t-test s Welchovou korekciou, chí-kvadrát test a Pearsonov korelačný test. Rozdiely medzi skupinami sa porovnávali pomocou Mann-Whitneyho U-testu a Kruskal-Wallisovho poradového súčtu testu pre viacnásobné porovnania s R studio (verzia 4.0.2).

Etické schválenie.

Štúdiu schválila lekárska etická komisia Ôsmej ľudovej nemocnice v Guangzhou (č. 202001134 a 202020153). Od dobrovoľníkov sa získal písomný súhlas.

Súhrn prehľadov.

Ďalšie informácie o dizajne výskumu sú k dispozícii v súhrne správ o výskume prírody, ktorý je prepojený s týmto článkom.

Dostupnosť údajov

Autori vyhlasujú, že všetky údaje, ktoré podporujú zistenia tejto štúdie, sú dostupné v rámci článku a jeho doplnkových informačných súborov. Zdrojové údaje sú zahrnuté ako súbor zdrojových údajov. Zdrojové údaje sú uvedené v tomto dokumente.

Referencie

1. Garcia-Beltran, WF a kol. COVID-19-neutralizujúce protilátky predpovedajú závažnosť ochorenia a prežitie. Cela 184, 476 – 488 (2020).

2. Deng, W. a kol. Primárna expozícia SARS-CoV-2 chráni pred reinfekciou u makakov rhesus. Science 369, 818–823 (2020).

3. Chen, P. a kol. SARS-CoV-2 neutralizačná protilátka LY-CoV555 u ambulantných pacientov s Covid-19. N. Engl. J. Med 384, 229-237 (2020).

4. Polack, FP a kol. Bezpečnosť a účinnosť vakcíny BNT162b2 mRNA Covid-19. N. Engl. J. Med. 383, 2603 – 2615 (2020).

5. Huang, C. a kol. 6-mesačné následky COVID-19 u pacientov prepustených z nemocnice: kohortová štúdia. Lancet 397, 220–232 (2021).

6. Dan, JM a kol. Imunologická pamäť na SARS-CoV-2 hodnotená až 8 mesiacov po infekcii. Science 371, eabf4063 (2021).

7. Tan, CW a kol. Neutralizačný test náhradného vírusu SARS-CoV-2 založený na protilátkou sprostredkovanej blokáde ACE2-špičkovej interakcie proteín-proteín. Nat. Biotechnol. 38, 1073 – 1078 (2020).

8. Hu, F. a kol. Zhoršená špecifická humorálna imunitná odpoveď proti väzbovej doméne SARS-CoV-2 receptora súvisí s pretrvávaním vírusu a periodickým vylučovaním v gastrointestinálnom trakte. Cell Mol. Immunol. 17, 1119 – 1125 (2020).

9. Lukacs, NW & Malinczak, CA Využitie bunkovej imunity na očkovanie proti respiračným vírusom. Vakcíny 8, 783 (2020).

10. Kim, D. a kol. Architektúra prepisu SARS-CoV-2. Cela 181, 914–921 (2020).

11. Le Bert, N. a kol. T bunková imunita špecifická pre SARS-CoV-2- v prípadoch COVID-19 a SARS a neinfikované kontroly. Príroda 584, 457–462 (2020).

12. He, Z. a kol. Séroprevalencia a humorálna imunitná trvanlivosť protilátok anti-SARSCoV-2 vo Wuhan, Čína: longitudinálna prierezová štúdia na úrovni populácie. Lancet 397, 1075–1084 (2021).

13. Figueiredo-Campos, P. a kol. Séroprevalencia protilátok proti SARS-CoV-2 u pacientov s COVID-19 a zdravých dobrovoľníkov do 6 mesiacov po nástupe ochorenia. Eur. J. Immunol. 50, 2025 – 2040 (2020).

14. Marot, S. a kol. Neutralizačná heterogenita variantov SARS-CoV-2 v Spojenom kráľovstve a Južnej Afriky u BNT162b2-zaočkovaných alebo zotavujúcich sa COVID-19 zdravotníckych pracovníkov. Clin. Infikovať. Dis. ciab492 https://doi.org/ 10.1093/cid/ciab492 (2021). [Online pred tlačou].

15. Sabino, EC a kol. Obnovenie COVID-19 v Manaus v Brazílii napriek vysokej séroprevalencii. Lancet 397, 452 – 455 (2021).

16. Singh, J., Rahman, SA, Ehtesham, NZ, Hira, S. & Hasnain, SE SARS-CoV-2 varianty, ktoré vyvolávajú obavy, sa objavujú v Indii. Nat. Med. 27, 1131 – 1133 (2021).

17. Planas, D. a kol. Citlivosť infekčných variantov SARS-CoV-2 B.1.1.7 a B.1.351 na neutralizačné protilátky. Nat. Med. 27, 917-924 (2021).

18. Hacisuleyman, E. a kol. Prelomové infekcie vakcín s variantmi SARS-CoV-2. N. Engl. J. Med. 384, 2212 – 2218 (2021).

19. Kiyotani, K., Toyoshima, Y., Nemoto, K. & Nakamura, Y. Bioinformatická predpoveď potenciálnych T bunkových epitopov pre SARS-Cov-2. J. Hum. Genet. 65, 569 – 575 (2020).

Poďakovanie

Ďakujeme všetkým členom sledovacej skupiny COVID-19 za ich nepriame príspevky k tejto štúdii. Ďakujeme všetkým lekárom a sestrám, ktorí sa o týchto pacientov starali a odoberali vzorky na izolačnom oddelení. Ďakujeme aj všetkým laboratórnym technikom, ktorí narábali so vzorkami a vykonávali merania v Guangzhou Eighth People's Hospital. Túto prácu podporila Národná nadácia pre prírodné vedy Číny (č. 81670536, 81770593 a 82061138006), Národný veľký program na kontrolu kľúčových infekčných chorôb (2017ZX10202203-004-002 a 2018ZX10301404-003-002), provincia Guangdong Fondu vedy a techniky (č. 2020B1111330002), Guangzhou Health Science and Technology Program (20211A010029), výzva na financovanie rýchlej reakcie čínsko-nemeckého centra pre podporu výskumu (SGC) na bilaterálne návrhy spolupráce medzi Čínou a Nemeckom v súvislosti s ochorením COVID{14 }} Súvisiaci výskum (č. C-0032) a núdzový kľúčový program laboratória Guangzhou (EKPG21-29).

Autorské príspevky

XD, FH, CL, XT a FL boli zodpovedné za dizajn štúdie, dohľad nad štúdiou a analýzu údajov. FH a FL napísali prácu. CF, YW, HH, FC, GT, YL, JL, JC a MJ boli zodpovedné za nábor pacientov a zber vzoriek a klinických údajov. JS, PL, LF a LC vykonali sekvenačné a bioinformatické analýzy. QF, LG a SC vykonali detekciu vírusovej RNA a testy protilátok. CK vykonal mikroneutralizačný test.

Konkurenčné záujmy

Autori nedeklarujú žiadne konkurenčné záujmy.

Ďalšie informácie

Korešpondenciu a žiadosti o materiály by ste mali adresovať XD, FH, XT alebo FL

Informácie o recenziách Nature Communications ďakuje Bin Cao a ostatným, anonymným, recenzentom za ich príspevok k partnerskej recenzii tejto práce. K dispozícii sú prehľady odborných recenzentov.

Poznámka vydavateľa Springer Nature zostáva neutrálny, pokiaľ ide o jurisdikčné nároky v publikovaných mapách a inštitucionálnych pridruženiach.

Otvorený prístup

Tento článok je licencovaný na základe Creative Commons Attribution 4.{1}} Medzinárodná licencia, ktorá povoľuje používanie, zdieľanie, adaptáciu, distribúciu a reprodukciu na akomkoľvek médiu alebo formáte, ak uvediete pôvodného autora (autorov) ) a zdroj, uveďte odkaz na licenciu Creative Commons a uveďte, či boli vykonané zmeny. Obrázky alebo iný materiál tretích strán v tomto článku sú zahrnuté v licencii Creative Commons článku, pokiaľ nie je uvedené inak v úverovom limite k materiálu. Ak materiál nie je zahrnutý v licencii Creative Commons k článku a vaše zamýšľané použitie nie je povolené zákonnými predpismi alebo prekračuje povolené použitie, budete musieť získať povolenie priamo od držiteľa autorských práv.

For more information:1950477648nn@gmail.com