Štúdia o ochrannej funkcii Cistanche na obličkách: Androgénne závislé rozdiely v množstvách CYP MRNA v obličkách ošípaných

Androgénne závislé rozdiely v množstvách CYP mRNA v obličkách ošípaných

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Už predtým sme uviedli rozdiely medzi pohlaviami a plemenami závislými od androgénov v množstvách mRNA izoforiem CYP v pečeni ošípaných. Objasniť, či existujú také rozdiely medzi pohlaviami a plemenamiobličkyskúmali sme množstvo niekoľkých CYP mRNA v obličkách pomocou oboch pohlaví 5-mesačných prasiatok Landrace, Meishan a/alebo ich krížencov F1 (LM a ML). Zistili sa významné rozdiely medzi pohlaviami v množstvách niekoľkých CYP mRNA: muž < žena="" pre="" cyp2a19="" a="" cyp3a29;="" a="" samec=""> samica pre CYP4A24/25 u všetkých plemien. Pohlavné rozdiely v množstve mRNA CYP2B22 (samec < samica)="" av="" mrna="" cyp2c33="" a="" cyp2c49="" (samec=""> samica) boli tiež pozorované u všetkých plemien okrem ošípaných Landrace. Okrem toho sa signifikantný pohlavný rozdiel (samec < samica)="" v="" mrna="" cyp3a46="" zistil="" len="" u="" ošípaných="" lm="" a="" ml.="" u="" ošípaných="" landrace="" alebo="" meishan="" sa="" nezistili="" žiadne="" významné="" rozdiely="" medzi="" pohlaviami="" pre="" mrna="" cyp1a1,="" cyp1a2="" a="" cyp4b1.="" množstvo="" mrna="" cyp2c33="" a="" cyp4a24/25="" u="" samcov="" bolo="" vyššie="" u="" ošípaných="" meishan="" ako="" u="" ošípaných="" landrace.="" ďalšie="" experimenty="" s="" použitím="" ošípaných="" liečených="" kastráciou="">testosterónupropionát naznačil, že rozdiely medzi pohlaviami a plemenami v množstvách týchto CYP mRNA boli, aspoň čiastočne, závislé od hladín sératestosterónu. Okrem toho účinky androgénu na množstvá CYP mRNA v obličkách nemusia nevyhnutne korelovať s účinkami v pečeni, čo naznačuje, že existuje tkanivovo selektívny faktor zodpovedný za expresiu génov CYP súvisiacu s androgénom. OchranaCistanchenaobličkyje všestranný, čo sa pripisuje prvkom ako echinakozid, verbaskozid, flavonoidy a celkové glykozidy fenetylalkoholu obsiahnuté vCistanche. Cistanchedokáže nielen chrániťobličkypred väčším poškodením, ale aj opraviť existujúce poškodenieobličky. pretoCistancheje najčastejšie používanou bylinkou v receptoch tradičnej čínskej medicíny.Cistanchemá mimoriadne vysokú liečivú hodnotu.

Kľúčové slová:testosterónu; CYP;obličky; rozdiel medzi pohlaviami; rozdiel plemena; prasa;obličkybunka;Cistanche

Misaki Kojima a Masakuni Degawab

Jednotka živočíšneho genómu, Inštitút vedy o hospodárskych zvieratách a pasienkoch, Národná organizácia pre výskum poľnohospodárstva a potravín (NARO); 2 Ikenodai, Tsukuba, Ibaraki 305–0901, Japonsko: a bLaboratórium molekulárnej toxikológie, Fakulta farmaceutických vied, Univerzita v Shizuoka; 52–1 Yada, Suruga-Ku, Shizuoka 422–8526, Japonsko. Prijaté 16. apríla 2021; prijaté 19. mája 2021

ÚVOD

Enzýmy metabolizujúce lieky (DME), ako sú CYP, sulfotransferázy (SULT) a uridín-5′-difosfát (UDP)-glukuronozyltransferázy (UGT), hrajú dôležitú úlohu v metabolizme xenobiotík, vrátane liekov a endogénnych zlúčenín, ako sú steroidné hormóny a lipidy.1,2) Domáce ošípané (Sus scrofa domesticus), vrátane mini ošípaných, sú dôležité vo farmakologických a toxikologických štúdiách z dôvodu podobnosti funkcie DME medzi ľuďmi a ošípanými, najmä CYP.3–7) Už predtým sme uviedli pohlavie a rozdiely medzi plemenami v množstvách pečeňových DME mRNA, vrátane izoforiem CYP, medzi ošípanými Landrace a Meishan, a ďalej sme preukázali, že hladina androgénov v sére je jedným z kritických faktorov, ktoré spôsobujú tieto rozdiely.8)

Cistanchetubulosazabraňujeochorenie obličiek,kliknite sem a získajte vzorku

Theobličkyako aj pečeň je dôležitým tkanivom zodpovedným za metabolizmus a vylučovanie xenobiotík vrátane liečiv a endogénnych zlúčenín a je jedným z najčastejších cieľov toxicity vyvolanej liekmi.9,10) Uvádza sa, že izoformy CYP patriace medzi tzv. V ošípaných existujú rodiny CYP1, CYP2, CYP3 a CYP4obličky.11–15) Väčšina týchto izoforiem CYP hrá dôležitú úlohu v metabolizme xenobiotík a/alebo lipidov u pokusných zvierat a ľudí.9,10,16,17) Okrem toho expresia izoforiem Cyp4a a Cyp4b u myšíobličkyje regulovaný androgénom.18–21)

V tejto štúdii sme najprv skúmali rozdiely medzi pohlaviami a plemenami v množstvách CYP mRNA (CYP1A1, CYP1A2, CYP2A19, CYP2B22, CYP2E1, CYP2C33, CYP2C49, CYP3A22, CYP3A29, CYP3A46, CYP4A24/25 a CYP4B1) vobličkyof Meishan, Landrace a ich krížencov F1 ošípaných. Ďalej sme skúmali, či je androgén kritickým faktorom určujúcim rozdiely medzi pohlaviami a plemenami v množstvách týchto CYP mRNA u ošípaných.obličkypokusmi s kastráciou a/alebo podávanímtestosterónupropionát (TP).

MATERIÁLY A METÓDY

Zvieratá

Použili sa ošípané Landrace, Meishan a ich kríženci F1 (LM, samica Landrace × samec Meishan; ML, samica Meishan × samec Landrace), rovnaké ako tie, ktoré boli použité v našich predchádzajúcich štúdiách.22) Stručne povedané, ošípané boli chované v Národnom inštitúte vedy o hospodárskych zvieratách a pastvinách, Tsukuba, Japonsko. Všetky ošípané boli kŕmené komerčnou obilnou stravou a bola im poskytnutá voda ad libitum. Ošípané boli zabité elektrickým omráčením, po ktorom nasledovalo vykrvácanie medzi 10:00 a 11:00 ráno. Niektoré samce prasiat Landrace a Meishan boli kastrované vo veku 1 mesiaca a usmrtené vo veku 5 mesiacov. Z každého prasaťa sa rýchlo odobrala časť obličky alebo pečene, zmrazila sa v tekutom dusíku a udržiavala sa pri teplote -80 stupňov až do ďalších analýz.

Táto štúdia bola schválená Výborom pre starostlivosť o zvieratá Národného inštitútu pre vedu o chove dobytka a pasienkov (č. 1711B060, 1811B032, 1911B068, 20B005NILGS). So všetkými zvieratami sa zaobchádzalo humánne podľa pokynov výboru.

Androgénna liečba

Ako je uvedené v predchádzajúcich správach,23,24)testosterónupropionát (TP, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) rozpustený v kukuričnom oleji bol injikovaný intramuskulárne päťkrát v 48- hodinových intervaloch do zadnej nohy každej ošípanej v dávke 10 mg/kg telesná hmotnosť; ošípané boli usmrtené 24 hodín po poslednej injekcii.

Množstvo séraTestosterón

Množstvo sératestosterónuu jednotlivých samcov ošípaných bola meraná pomocouTestosterónSúprava ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) (Enzo Life Sciences Inc., NY, USA) podľa pokynov výrobcu, ako už bolo popísané.24) Okrem toho sa použili aj údaje získané v našich predchádzajúcich štúdiách.24,25)

Množstvo CYP mRNA

Celková RNA sa pripravila z jednotlivých tkanív pomocou TRIzol Reagent (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) a použila sa na stanovenie množstva CYP1A1, CYP1A2, CYP2A19, CYP2B22, CYP2E1, CYP2C33, CYP2C49, CYP3A22, CYP3A29, CYP3A4 mRNA CYP4A24/25 a CYP4B1. Množstvá týchto mRNA boli hodnotené pomocou RT-PCR v reálnom čase pomocou systému 7500 Real-Time PCR System a SYBR green master mix (PE Applied Systems, Tokio, Japonsko), ako už bolo opísané, 25) s výnimkou mRNA CYP3A. Množstvá mRNA CYP3A22, CYP3A29 a CYP3A46 sa skúmali pomocou Eagle Taq Master Mix s ROX (Roche Molecular Systems, Inc., Branch burg, NJ, USA), ako bolo uvedené vyššie.22) Sady primérov a sondy TaqMan používané v súčasnosti štúdie boli rovnaké ako tie v našich predchádzajúcich štúdiách22,25) s výnimkou CYP1A1, CYP1A2, CYP4A24/25 a CYP4B1, kde boli sekvencie primérov nasledovné: CYP1A1, 5′-ACT TCA TCC CTA TCC TCC GTT ACC{{53} }′ (dopredu) a 5′-GCA TTC TCG TCC ATC CTC TTG TC-3′ (späť); CYP1A2, 5′-GCT ATC GGG ACT TTG ACA AGA ACT-3′ (dopredu) a 5′-CCA GGA GAT GGC TGT GGT AAT TG-3′ (spätný); CYP4A24/25, 5′-CAC CGT GCC GCC AGG ATA-3′ (dopredný) a 5′-CAA GGA GGA GGA TGT CCA GGA A-3′ (spätný); CYP4B1; 5′-GAG CAC CAG CAT CGT TGT CG-3′ (dopredu) a 5′-TCC CCA GAT CCT CCC CCT G-3′ (späť). Ako vnútorný štandard sa použil ribozomálny proteín L7 (RPL7). Množstvo každej cDNA bolo hodnotené metódou relatívnej štandardnej krivky podľa PE Applied Biosystems User Bulletin #2 (1997). Štandardné krivky na určenie množstva mRNA CYP boli vytvorené pomocou RT-reakčnej zmesi s celkovou RNA z pečene 5-mesačných samíc ošípaných Landrace alebo z obličiek 5-mesačných samice ošípaných Landrace alebo Meishan, podľa účelu

Štatistické analýzy

Štatisticky významné rozdiely boli hodnotené Tukeyho post hoc testom po ANOVA alebo Studentovom t-teste. Korelácie medzi uvedenými parametrami boli stanovené regresnou analýzou.

VÝSLEDKY

Množstvo CYP mRNA v obličkách ošípaných Landrace a Meishan

Množstvá CYP mRNA sa prvýkrát merali v obličkách oboch pohlaví 5-mesačných prasiat Landrace a Meishan. Na porovnanie množstva každej CYP mRNA medzi obličkami a pečeňou bolo množstvo každej CYP mRNA v obličkách vyjadrené ako relatívny pomer k zodpovedajúcemu množstvu v pečeni 5-mesačných samíc ošípaných Landrace, a výsledky sú uvedené v tabuľke 1.

U všetkých skúmaných ošípaných boli množstvá mRNA CYP4A24/25 a CYP4B1 v obličkách oveľa vyššie ako v pečeni, zatiaľ čo množstvá ostatných CYP boli opačné (tabuľka 1). Okrem toho, hoci mRNA CYP2E1 a CYP3A22 boli detegované v obličkách, tieto množstvá boli u každého plemena nižšie ako jedna tisícina množstiev v pečeni (údaje nie sú uvedené).

U oboch plemien ošípaných boli množstvá mRNA CYP2A19 a CYP3A29 nižšie u samcov ako u samíc (tabuľka 1, obr. 1). Naopak, množstvo CYP4A24/25 mRNA u oboch plemien ošípaných bolo signifikantne vyššie u samcov ako u samíc. Okrem toho u ošípaných Meishan boli množstvá mRNA CYP2C33 a CYP2C49 významne vyššie u samcov ako u samíc. Žiadne takéto rozdiely medzi pohlaviami v množstvách mRNA CYP2C33 a CYP2C49 neboli pozorované u ošípaných Landrace. U žiadneho z plemien ošípaných neboli pozorované žiadne významné rozdiely medzi pohlaviami v množstvách mRNA CYP1A1, CYP1A2, CYP2B22 a CYP4B1, hoci rozdiel medzi pohlaviami v množstve mRNA CYP2B22 u ošípaných Meishan bol podľa Studentovho t-testu významný. Okrem toho bola mRNA CYP3A46 detegovaná u oboch pohlaví ošípaných Landrace, zatiaľ čo u oboch pohlaví ošípaných Meishan bola pod detekčným limitom.

Breed  differences  in  the  amounts  of  several  CYP mRNAs were also found. The amounts of CYP2B22 and CYP4B1 mRNAs in Landrace pigs were signifificantly higher than those  in sex-matched Meishan pigs, while those of CYP2C49 and CYP3A29  mRNAs  were the  opposite.  A  significant  breed  difference (Meishan > Landrace) in the amounts of CYP2C33 and CYP4A24/25  mRNA  was  also  observed in  males,  but  no  such  difference  was  found in  females.  Furthermore, the  breed  differences  (Landrace >Meishan) v množstvách mRNA CYP1A1, CYP1A2 a CYP2A19 medzi ošípanými Landrace a Meishan rovnakého pohlavia.

Účinok androgénu na génovú expresiu reprezentatívnych pohlavne príbuzných CYP Na objasnenie androgénovej závislosti génovej expresie CYP (CYP2A19, CYP2B22, CYP2C33, CYP2C49 a CYP3A29) v obličkách boli účinky kastrácie a/alebo liečby TP skúmali pomocou 5-mesačných ošípaných Meishan a Landrace (obr. 1). U kastrovaných samcov oboch plemien bolo množstvo mRNA CYP2A19 vyššie ako u zodpovedajúcich intaktných samcov. Okrem toho liečba TP kastrovaných samcov a intaktných samíc oboch plemien ošípaných viedla k zníženiu množstva mRNA. Množstvo mRNA CYP2B22 a CYP3A29 sa zvýšilo u kastrovaných ošípaných Meishan, ale nie u kastrovaných ošípaných Landrace v porovnaní so zodpovedajúcimi intaktnými samcami. Liečba TP kastrovaných samcov a intaktných samíc oboch plemien ošípaných viedla k zníženiu množstva týchto mRNA, aj keď sa nepozorovali žiadne významné účinky TP na mRNA CYP2B22 u kastrovaných ošípaných Meishan a mRNA CYP3A29 u kastrovaných ošípaných Landrace. individuálny rozdiel.

Tabuľka 1. Relatívne množstvá mRNA renálnych izoforiem CYP u 5-mesačných prasiat Landrace a Meishan

Obr. 1. Účinky kastrácie a/alebo podávania TP na množstvo mRNA CYP v obličkách 5-mesačného prasaťa

TP bol intramuskulárne injikovaný {{0}}mesačným kastrovaným samcom a intaktným samiciam prasiat Landrace a Meishan, ako je opísané v časti Materiály a metódy. Množstvo každej CYP mRNA v obličkách sa určilo pomocou RT-PCR v reálnom čase a normalizovalo sa na množstvo RPL7 ako vnútorného štandardu. Štandardné krivky boli vytvorené pomocou RT-reakčnej zmesi s celkovou RNA z obličiek 5-mesačných samíc ošípaných Landrace, s výnimkou stanovenia množstva mRNA CYP2C49, kde boli štandardné krivky vytvorené pomocou RT-reakčnej zmesi s celkovou RNA z obličiek 5-mesačných samíc ošípaných Meishan. Každý stĺpec predstavuje priemer každej experimentálnej skupiny a každý stĺpec predstavuje štandardnú odchýlku (SD) priemeru (n= 6 pre intaktné samce a samice prasiat Landrace a Meishan; n= 3 pre ostatné). a,b Významné rozdiely od zodpovedajúcich intaktných samcov ošípaných boli hodnotené Tukeyho post hoc testom: ap < 0.{{20}}5,="" bp="">< 0,01.="" c,d="" signifikantné="" rozdiely="" od="" zodpovedajúcich="" tp="" neošetrených="" ošípaných,="" ako="" sa="" stanovilo="" studentovým="" t-testom:="" cp="">< 0,05,="" dp="">< 0,01.="" štvorce="" v="" cyp2b22="" a="" cyp3a29="" označujú="" ošípané="" meishan="" a="" landrace="" so="">

Množstvo mRNA CYP2C33 sa znížilo u kastrovaných ošípaných Meishan, ale nie u kastrovaných ošípaných Landrace, v porovnaní so zodpovedajúcimi intaktnými samcami a liečba TP kastrovaných samcov a intaktných samíc oboch plemien ošípaných viedla k zvýšeniu množstva mRNA. U ošípaných Meishan sa kastráciou znížilo aj množstvo mRNA CYP2C49 a liečba TP kastrovaných samcov a intaktných samíc viedla k zvýšeniu jej množstva. Žiadne takéto účinky kastrácie alebo liečby TP neboli pozorované u ošípaných Landrace.

Obr. 2. Účinky kastrácie a/alebo podávania TP na množstvo mRNA CYP4A24/25 a CYP4B1 v obličkách a pečeni 5-mesačných ošípaných

TP bol intramuskulárne injikovaný {{{{10}}}}mesačným kastrovaným samcom a intaktným samiciam ošípaných Landrace a Meishan, ako je opísané v časti Materiály a metódy. Množstvo každej CYP mRNA v obličkách a pečeni sa určilo pomocou RT-PCR v reálnom čase a normalizovalo sa na množstvo RPL7 ako vnútorného štandardu. Štandardné krivky boli vytvorené pomocou RT-reakčnej zmesi s celkovou RNA z obličiek 5-mesačných samíc ošípaných Landrace. Každý stĺpec predstavuje priemer v každej experimentálnej skupine a každý stĺpec predstavuje SD priemeru (n= 6 pre intaktné samce a samice prasiat Landrace a Meishan; n= 3 pre ostatné). Významné rozdiely od zodpovedajúcich intaktných samcov ošípaných boli hodnotené Tukeyho post hoc testom: ap < 0,01.="" b,c="" signifikantné="" rozdiely="" od="" zodpovedajúcich="" tp="" neošetrených="" ošípaných,="" ako="" sa="" stanovilo="" studentovým="" t-testom:="" bp="">< 0,05,="" cp=""><>

To date, there are no reports concerning the constitutive amounts of CYP4A24/25  and  CYP4B1 mRNAs and sex differences in their amounts in the pig liver, although a clear sex  difference  (male >samice) v množstve mRNA CYP4A24/25 sa tu pozoruje v obličkách ošípaných (tabuľka 1). Preto, aby sme objasnili účinky androgénu na expresiu týchto mRNA v obličkách a pečeni ošípaných Landrace a Meishan, skúmali sme nielen účinky kastrácie, ale aj účinky liečby TP kastrovaných samcov a intaktných samíc ( Obr. 2). Množstvo CYP4A24/25 mRNA v obličkách bolo znížené u ošípaných Landrace aj Meishan kastráciou a liečba TP kastrovaných samcov a intaktných samíc oboch plemien ošípaných viedla k zvýšeniu jeho množstva. V pečeni oboch plemien ošípaných sa však takéto účinky kastrácie nepozorovali a tiež sa nepozoroval rozdiel medzi pohlaviami v množstve mRNA CYP4A24/25. Podobne nebol pozorovaný žiadny významný vplyv liečby TP na množstvo pečeňovej mRNA CYP4A24/25 u oboch plemien ošípaných, hoci zvýšenie jej množstva liečbou TP bolo pozorované len u kastrovaných samcov ošípaných Landrace. Okrem toho mRNA CYP4B1 nevykazovala žiadny rozdiel medzi pohlaviami v obličkách (obr. 2 a tabuľka 1) ani v pečeni pre každé plemeno ošípaných. U oboch plemien ošípaných sa množstvo mRNA CYP4B1 významne nezmenilo kastráciou a/alebo liečbou TP (obr. 2).

Už skôr sme zistili, že liečba TP viedla k zvýšeniu množstva mRNA CYP3A46 v pečeni ošípaných Landrace.22) Účinky liečby TP a kastrácie na množstvo mRNA v obličkách sa preto ďalej skúmali pomocou {{3} }mesačné ošípané Landrace (obr. 1). Hoci kastrácia samcov nemala významný vplyv na množstvo mRNA CYP3A46 v obličkách, liečba TP kastrovaných samcov a intaktných samíc viedla k zníženiu množstva mRNA CYP3A46. Okrem toho mRNA CYP3A46 bola pod detekčným limitom v obličkách aj pečeni všetkých ošípaných Meishan liečených kastráciou a/alebo TP.22)

Genetické faktory zodpovedné za expresiu CYP mRNA súvisiacu s pohlavím

We have previously reported that sex-related expression of CYP mRNAs in the pig liver is, at least in part, dependent on the amount of serum testosterone,8) and  that  the  amount  is  determined  by  autosomal  dominant  inheritance.25) Therefore, using F1 progeny (LM and ML) of Landrace and Meishan pigs, the amounts of sex-related CYP mRNAs in the kidney were measured (Fig. 3). Incidentally, the amounts of serum testosterone in 5-month-old male LM and ML pigs, as well as Meishan pigs, were >40 ng/ml a tie u 5-mesačných samcov ošípaných Landrace boli<23 ng>

In both LM and ML pigs, the mRNA amounts of CYP2A19, CYP2B22, and CYP3A29 in males were much lower than those in  females,  while  the  converse  was  observed  for  CYP2C33 and CYP4A24/25.  For CYP2C49 mRNA,  a  significant  sex  difference (males >samíc) bol pozorovaný u ML ošípaných, ale nebol pozorovaný žiadny významný rozdiel u LM ošípaných z dôvodu značných interindividuálnych rozdielov medzi samcami LM ošípaných. mRNA CYP3A46 bola zistená u ošípaných LM a ML, ako aj ošípaných Landrace a rozdiel medzi pohlaviami (samci< females)="" in="" the="" amount="" of="" cyp3a46 mrna was observed in lm and ml pigs ="">

Obr. 3. Pohlavné rozdiely v množstve CYP mRNA v obličkách 5-mesačných LM a ML ošípaných

Množstvo mRNA každého CYP v obličkách sa určilo pomocou RT-PCR v reálnom čase a normalizovalo sa na množstvo RPL7 ako vnútorného štandardu. Štandardné krivky boli vytvorené pomocou RT-reakčnej zmesi s celkovou RNA z obličiek 5-mesačných samíc ošípaných Landrace, s výnimkou stanovenia množstva mRNA CYP2C49, kde boli štandardné krivky vytvorené pomocou RT-reakcie zmes s celkovou RNA z obličiek 5-mesačných samíc ošípaných Meishan. Každý kruh zobrazuje jednotlivé prasa (n= 6 a 9 pre samcov a samice LM ošípaných, v tomto poradí; n= 7 a 10 pre samce a samice ML ošípaných, v tomto poradí). Stĺpec označuje priemer v každej skupine. a,b Signifikantné rozdiely medzi samcami a samicami v každom plemene boli hodnotené Studentovým t-testom: ap < 0,05,="" bp=""><>

Vzťah medzi množstvom sérového testosterónu a expresiou pohlavne súvisiacich CYP mRNA v obličkách

Predpokladá sa, že koncentrácia sérového androgénu je jedným z kritických faktorov, ktoré spôsobujú rozdiely medzi pohlaviami a plemenami v množstvách niekoľkých CYP mRNA v obličkách ošípaných. Preto sa vzťah medzi koncentráciou androgénu v sére a expresiou CYP mRNA (CYP2A19, CYP2B22, CYP2C33, CYP2C49, CYP3A29, CYP3A46 a CYP4A24/25) v obličkách ďalej skúmal pomocou 1-, { {17}} a 5-mesačné ošípané. Niektoré z 1-mesačných ošípaných (nezrelé,< 10 ng  testosterone/ml ="" serum) ="" were ="" treated ="" with ="" tp="" and="" used="" as="" samples="" for="" the="" present="" experiments.="" the="" concentrations="" of="" serum="" testosterone="" in="" the="" tp-treated="" pigs="" were ="" 28–59 ng/ml. ="" in ="" addition, ="" serum ="" testosterone ="" amount ="" increased="" in="" an="" age-dependent="" manner="" in="" males25) ="" but ="" not ="" in ="" females="" of="" all="" the="" pigs=""><7 ng  testosterone/ml ="" serum) ="" used. ="" therefore,="" as="" representative="" samples="" of="" females,="" 1-month-old="" and ="" 5-month-old ="" pigs ="" but ="" not ="" 3-month-old ="" pigs ="" were ="" used ="" for ="" the="" present="">

The mRNA amounts of CYP2A19, CYP2B22, CYP3A29, and CYP3A46 in all the pigs with high concentrations (>približne. 30 ng/ml) sérového testosterónu boli nízke v porovnaní s hladinami u všetkých ošípaných s nízkymi koncentráciami sérového testosterónu (<30 ng l). ="" in ="" particular, ="" the ="" amount ="" of ="" cyp3a29="" mrna="" decreased="" in="" a="" serum="" testosterone="" concentration-dependent ="" manner ="" in ="" all ="" the ="" breeds ="" of ="" pig ="" examined ="" (fig. ="" 4). ="" furthermore,="" a="" serum="" testosterone="" concentration-dependent="" decrease="" in="" the="" amount="" of="" cyp3a46 mrna was also observed ="" in="" all="" the="" pigs="" except="" meishan="">

Množstvo mRNA CYP2C33 a CYP4A24/25 sa však zvýšilo v závislosti od koncentrácie testosterónu v sére u všetkých skúmaných plemien ošípaných (obr. 5). Množstvo mRNA CYP2C49 sa zvýšilo v závislosti od koncentrácie testosterónu v sére u ošípaných Meishan, LM a ML, ale nie u ošípaných Landrace. Okrem toho bolo pozorované malé zvýšenie množstva mRNA CYP2C49 u 1-mesačných prasiat Landrace a Meishan liečených TP. To naznačuje, že expresia takéhoto účinku spojeného s TP je závislá od úrovne expresie transkripčného faktora (faktorov) reagujúceho na TP pre génovú expresiu CYP2C49, ktorá sa podieľa na dozrievaní.

DISKUSIA

V tejto štúdii sme spočiatku zistili rozdiely medzi pohlaviami a plemenami v množstvách niekoľkých mRNA CYP v obličkách pomocou 5-mesačných prasiat Landrace a Meishan a ich potomkov F1 (LM a ML). Následne, aby sme objasnili účinok androgénu na množstvá renálnych CYP mRNA, skúmali sme účinky kastrácie a / alebo liečby TP na tieto množstvá. Tieto výsledky sú zhrnuté v tabuľke 2. Analýzou takýchto rozdielov medzi pohlaviami a plemenami vo vzťahu ku koncentrácii testosterónu v sére sme preukázali, že testosterón v sére je aspoň jedným z kritických faktorov, ktoré spôsobujú tieto rozdiely v množstve každej mRNA CYP v obličky.

Obr. 4. Negatívne korelácie medzi koncentráciami testosterónu v sére a množstvom mRNA CYP2A19, CYP2B22, CYP3A29 a CYP3A46 v obličkách ošípaných

Sérové ​​koncentrácie testosterónu a množstvá CYP mRNA sa merali tak, ako je opísané v časti Materiály a metódy. Niektoré zo sérových koncentrácií testosterónu jednotlivých ošípaných boli prevzaté z predtým získaných údajov.24,25) Každý symbol predstavuje každú jednotlivú ošípanú. Otvorené štvorce a kosoštvorce, 1-mesačné samce a samice ošípaných Landrace a Meishan (n= 3 pre obe pohlavia ošípaných Landrace a Meishan); sivé štvorce, 3-mesačné samce ošípaných Landrace a Meishan (n= 4 pre ošípané Landrace a n{8}} pre ošípané Meishan); uzavreté štvorce a kosoštvorce, 5-mesačné samce a samice ošípaných Landrace a Meishan (n{11}} pre obe pohlavia ošípaných Landrace a Meishan); uzavreté a otvorené trojuholníky, 5-mesačné samce a samice LM ošípaných (n= 6 pre samcov a n{15}} pre samice); uzavreté a otvorené reverzné trojuholníky, 5-mesačné samce a samice ML ošípaných (n= 7 pre samcov a n{19}} pre samice); uzavreté a otvorené kruhy, 1-mesačné samce a samice ošípaných Landrace a Meishan liečených TP (n= 3 pre obe pohlavia ošípaných Landrace a Meishan). Korelácie sa skúmali s použitím údajov zo všetkých testovaných zvierat a určili sa regresnou analýzou, kde r je korelačný koeficient.

Predtým sme zistili rozdiely medzi pohlaviami (muž< female)="" in="" the="" amounts="" of="" cyp1a1="" and="" cyp1a2="" mrnas="" in="" the="" liver="" of="" meishan, lm, and ml pigs but not in landrace pigs.23–25) however, ="" no ="" such ="" sex ="" differences were ="" observed in the ="" kidney ="" of landrace="" and="" meishan="" pigs.="" on="" the="" contrary,="" there="" was="" a="" sex="" difference="" (male="" >="" female)="" in="" the="" amount="" of="" cyp4a24/25="" mrna="" in ="" the ="" kidney ="" but ="" not ="" in ="" the ="" liver. ="" sex ="" differences ="" in ="" the ="" amounts="" of="" cyp2a19,="" cyp2c33,="" and="" cyp2c49="" mrnas="" in="" the="" pig="" kidney,="" especially="" in="" meishan,="" lm,="" and="" ml="" pigs,="" correlated="" with="" the="" previous="" results="" in="" the="">< female="" for="" cyp2a19;="" male="" >="" female="" for="" cyp2c33="" and="" cyp2c49.="" interestingly, ="" sex ="" differences ="">< female)="" in="" the="" amounts="" of="" cyp2b22,="" cyp3a29, and/or cyp3a46="" mrnas="" in="" the="" kidney="" of="" meishan,="" lm,="" and="" ml="" pigs="" were="" the="" opposite="" of="" that="" previously obtained in the liver.22) sex differences in the amount of ="" cyp2a19,="" cyp3a29,="" and="" cyp4a24/25 ="" mrnas ="" were ="" observed ="" in the kidney of all the breeds of pig examined. although ="" sex ="" differences ="" in cyp2b22,="" cyp2c33, ="" and/or cyp2c49 ="" were ="" observed in meishan, lm, ="" and ml ="" pigs, ="" no ="" such ="" sex ="" differences ="">

Tabuľka 2. Súhrn androgénovo závislých rozdielov medzi pohlaviami a plemenami v génovej expresii izoforiem CYP v obličkách ošípaných

These  sex  and  breed  differences  can  be  explained  by  the  differences  in  the  concentration  of  serum  testosterone  in  male pigs. Male 5-month-old Meishan, LM, and ML pigs had high concentrations of serum testosterone (>približne. 40 ng/ml), zatiaľ čo ošípané Landrace mali nízke koncentrácie (<23 ng l). ="" because ="" the ="" amount ="" of ="" cyp2a19="" and="" cyp3a29 ="" mrnas ="" considerably ="" decreased ="" in ="" pigs ="" with ="">približne. 20 ng/ml sérového testosterónu, rozdiely medzi pohlaviami (muži< female)  in ="" their ="" amounts ="" were ="" observed ="" in ="" all ="" the ="" breeds ="" of ="" pig. ="" likewise, ="" since ="" the ="" amount ="" of ="" cyp4a24/25="" mrna="" increased="" in="" a="" serum="" testosterone="" concentration-dependent manner up to 80 ng/ml, a sex difference (male =""> female) was observed in all the breeds of pig. However, because  clear changes in the amount of CYP2B22, CYP2C33, and CYP2C49 mRNAs occurred at >30 ng/ml sérového testosterónu, rozdiely medzi pohlaviami v ich množstvách boli pozorované u ošípaných Meishan, LM a ML, ale nie u ošípaných Landrace. Preto sa predpokladá, že takéto rozdiely medzi pohlaviami a plemenami závisia od koncentrácie testosterónu v sére. Túto hypotézu ďalej podporujú experimenty s použitím kastrovaných a/alebo TP-liečených ošípaných. Konkrétne množstvá týchto mRNA u kastrovaných samcov (<12 ng  testosterone/ml ="" in ="" serum) ="" were ="" almost ="" the="" same="" as="" the="" corresponding="" females.="" serum="" concentrations="" of="" testosterone="" in="" 5-month-old="" castrated="" males="" and="" intact="" females="" rose="" to="">100 ng/ml pri liečbe TP. V dôsledku toho sa u ošípaných liečených TP množstvá mRNA CYP2C33 a CYP4A24/25, CYP2C33 a CYP4A24/25 mRNA zvýšili rovnako alebo vyššie ako u 5-mesačných samcov ošípaných Meishan a množstvá mRNA CYP2B22, CYP3A29 a CYP3A46 sa znížili rovnako ako u zodpovedajúcich samcov ošípaných.

Predpokladá sa, že rozdiel v profile sekrécie rastového hormónu (GH) medzi samcami a samicami u mnohých zvierat, najmä u hlodavcov, vedie k rozdielom medzi pohlaviami v množstvách niekoľkých enzýmov metabolizujúcich lieky, vrátane CYP, v pečeni.26) Napríklad rozdiely medzi pohlaviami v množstvách mRNA izoforiem Ugh, Sult a Cyp4a v pečeni myši sú ovplyvnené sekréciou GH mužského typu a/alebo androgénom, zatiaľ čo tieto rozdiely medzi pohlaviami sú primárne regulované androgénom v obličkách.21,27 ,28) Okrem toho sa navrhuje transakčný lokus, nazývaný GH-dependentná represia (GDR), na reguláciu génu pre steroidnú 15 -hydroxylázu špecifickú pre ženy (Cyp2a4) v pečeni myši, 29), ale tento gén sa uvádza byť recipročne regulované androgénom v pečeni a obličkách samcov myší.30) Naopak, predtým sme zistili, že u ošípaných Landrace s rozdielom medzi pohlaviami v profile sekrécie GH,31) neboli žiadne rozdiely medzi pohlaviami v množstvách hepatálnej mRNA niekoľko izoforiem CYP, SULT a UGT ktoré vykazujú rozdiely medzi pohlaviami u ošípaných Meishan.22–25,32) Preto sa predpokladá, že takéto rozdiely medzi pohlaviami u ošípaných závisia hlavne od rozdielov v koncentrácii testosterónu v sére. Avšak, pretože profil sekrécie GH je modifikovaný androgénom,33–35) možnosť, že zmeny v množstvách mRNA pozorované pri kastrácii a/alebo podaní TP nastanú, aspoň čiastočne, prostredníctvom androgénom sprostredkovanej zmeny v GH model sekrécie nemožno vylúčiť.

Breed  differences  in  amounts  of  the  mRNAs  of  CYP1A1, CYP1A2, CYP2A19, CYP2B22, and CYP4B1  between  sex-matched  Landrace  and  Meishan  pigs  were  also  observed  in  the  kidney  (Table  1),  while  no  such  clear  breed  differences  were  observed  in  the  liver.22,25) Additionally, as for CYP2C49 mRNA,  individual  differences  in  each  breed  of  pig  were  observed  regardless  of  serum  testosterone  concentration,  suggesting that these varieties have genetic diversity. Incidentally, pig  breeds  are  not  genetically  homogeneous.  Interestingly,  CYP3A46 mRNA was  clearly  detected in  both the  kidney  and  the liver of Landrace pigs but was below the detection limit in  both organs of Meishan pigs.22) Furthermore, CYP3A46 mRNA was  clearly  detected  in  both  the  kidney  and  the  liver  of  LM  and ML pigs, indicating that expression of CYP3A46 mRNA, as well as serum testosterone,25)  is  determined  by  autosomal  dominant inheritance. Because 5-month-old male LM and ML pigs, but not Landrace pigs, had high concentrations of serum  testosterone (>40 ng/ml), pohlavný rozdiel v množstve mRNA CYP3A46 sa pozoroval u ošípaných LM a ML, ale nie u ošípaných Landrace. Tieto zistenia silne naznačujú, že genetické (plemeno) a tkanivovo selektívne faktory spolu so sérovým testosterónom sa podieľajú na hladinách expresie niekoľkých génov CYP súvisiacich s pohlavím a plemenom. Bohužiaľ, tieto faktory zostávajú nejasné.

Na záver tu demonštrujeme, že existujú rozdiely medzi pohlaviami a plemenami v množstvách mRNA izoforiem CYP2, CYP3 a CYP4 rodiny v obličkách ošípaných a silne naznačujeme, že tieto rozdiely závisia od genetických faktorov hostiteľa, vrátane koncentrácie sérového androgénu. . Ďalej ukazujeme tkanivové rozdiely medzi obličkami a pečeňou v expresii génov CYP súvisiacej s pohlavím/androgénom a silne naznačujeme, že za expresiu génov CYP súvisiacu s androgénom je zodpovedný tkanivovo selektívny faktor. V budúcnosti je potrebný výskum na identifikáciu genetického hostiteľského faktora súvisiaceho s pohlavím a tkanivovo selektívneho faktora zodpovedného za reguláciu génov CYP. V každom prípade, keďže androgén je jedným z hostiteľských faktorov určujúcich hladiny expresie niekoľkých CYP zodpovedných za metabolizmus liečiva, meranie koncentrácie testosterónu v sére sa považuje za príspevok k vývoju vhodnej individuálnej medikamentóznej liečby.

Poďakovanie

Táto práca bola čiastočne podporená grantom na podporu vedeckého výskumu od Japonskej spoločnosti na podporu vedy (č. 19K06463, MK). Autori ďakujú Tsukuba Operation Unit 7, Technical Support Center of Central Region, NARO, Tsukuba, Japan za starostlivosť o zvieratá a za odber tkanív.

LITERATÚRA

1) Almazroo OA, Miah MK, Venkataramanan R. Metabolizmus liečiv v pečeni. Clin. Pečeň Dis., 21, 1–20 (2017).

2) Nebert DW, Wikvall K, Miller WL. Ľudské cytochrómy P450 v zdraví a chorobe. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci., 368, 20120431 (2013).

3) Burkina V, Rasmussen MK, Pilipenko N, Zamaratskaia G. Porovnanie xenobiotika metabolizujúceho ľudského, prasacieho, hlodavčieho a rybieho cytochrómu P450. Toxikológia, 375, 10–27 (2017).

4) Nielsen SD, Bauhaus Y, Zamaratskaia G, Junqueira MA, Blaabjreg K, Petrat-Melin B, Young JF, Rasmussen MK. Konštitutívna expresia a aktivita cytochrómu P450 u konvenčných ošípaných. Res. Vet. Sci., 111, 75-80 (2017).

5) Puccinelli E, Gervasi PG, Longo V. Xenobitotický metabolizujúci cytochróm P450 u ošípaných, sľubný zvierací model. Curr. Drug Metab., 12, 507-525 (2011).

6) Schelstraete W, Clerck LD, Govaert E, Millecam J, Devreese M, Deforce D, Bocxlaer JV, Croubels S. Charakterizácia bravčového pečeňového a intestinálneho liečiva metabolizujúceho CYP450: porovnanie s ľudskými ortológmi z hľadiska kvantitatívneho, aktívneho a selektívneho. Sci. Rep., 9, 9233 (2019).

7) Skaanild MT. Cytochróm P450 ošípaných a metabolizmus. Curr. Pharm. Des., 12, 1421 – 1427 (2006).

8) Kojima M. Rozdiely medzi pohlavím a plemenom v konštitutívnej génovej expresii pečeňových enzýmov metabolizujúcich lieky u ošípaných Meishan a Landrace: Rozdiely sprostredkované testosterónom. Jpn. Agric. Res. Otázka, 54, 7 – 12 (2020).

9) Bajaj P, Chowdhury SK, Yucha R, Kelly EJ, Xiao G. Nové modely obličiek na skúmaný metabolizmus, transport a toxicitu liečiv a xenobiotík. Drug Metab. Dispos., 46, 1692–1702 (2018).

10) Rytieri KM, Rowland A, Baníci JO. Renálny metabolizmus liekov u ľudí: potenciál liekových a endobiotických interakcií zahŕňajúcich cytochróm P450 (CYP) a UDP-glukuronozyltransferázu (UGT). Br. J. Clin. Pharmacol., 76, 587-602 (2013).

11) Kojima M, Morozumi T. Klonovanie šiestich kompletných cDNA kódujúcich enzýmy prasačieho cytochrómu P450 a génová expresia týchto enzýmov v pečeni a obličkách. J. Health Sci., 50, 518-529 (2004).

12) Lundell K. Klonovanie a expresia dvoch nových hydroxyláz mastných kyselín v pečeni a obličkách ošípaných [cytochróm P450 (CYP)4A24 a CYP4A25]. Biochem. J., 363, 297-303 (2002).

13) Nannelli A, Chirulli V, Longo V, Gervasi PG. Expresia a indukcia rifampicínom CAR- a PXR-regulovaných CYP2B a CYP3A v pečeni, obličkách a dýchacích cestách ošípaných. Toxikológia, 252, 105 – 112 (2008).

14) Puccinelli E, Gervasi PG, La Marca M, Buffy P, Longo V. Expresia a indukovateľnosť CYP2C33, CYP2C42, CYP2C49, CYP2B22 a CYP3A fenobarbitalom v prasačej pečeni, obličkách, tenkom čreve a nazálnych tkanivách. Xenobiotica, 40, 525-535 (2010).

15) Shang H, Guo K, Liu Y, Yang J, Wei H. Konštitutívna expresia mRNA CYP3A v tkanivách miniatúrnych prasiat Bama. Gene, 524, 261-267 (2013).

16) Imaoka S, Hiroi T, Tamura Y, Yamazaki H, Shimada T, Komori M, Degawa M, Funai Y. Mutagénna aktivácia 3-metoxy-4-aminoazobenzénu myším obličkovým cytochrómom P450 CYP4B1: Klonovanie a charakterizácia myšacieho CYP4B1. Arch. Biochem. Biophys., 321, 255-262 (1995).

17) Jarrar YB, Lee SJ. Molekulárna funkčnosť genetických polymorfizmov cytochrómu P450 4 (CYP4) a ich klinické dôsledky. Int. J. Mol. Sci., 20, 4274 (2019).

18) Hiratsuka M, Matsuura T, Watanabe E, Sato M, Suzuki Y. Pohlavné rozdiely v konštitučnej úrovni renálnych aktivít hydroxylázy kyseliny laurovej a proteínov súvisiacich s CYP4A u myší. Biol. Pharm. Bull., 19, 512-517 (1996).

19) Degawa M, Miura S, Hashimoto Y. Androgén-dependentný renálny mikrozomálny cytochróm P-450 zodpovedný za N-hydroxyláciu a mutagénnu aktiváciu 3-metoxy-4-aminoazobenzénu v BALB/c myš. Cancer Res., 50, 2729-2733 (1990).

20) Isern J, Meseguer A. Hormonálna regulácia a charakterizácia 5'-priliehajúcej oblasti myšacieho génu Cyp4b1. Biochem. Biophys. Res. Commun., 307, 139-147 (2003).

21) Zhang Y, Klaassen CD. Hormonálna regulácia izoforiem Cyp4a v pečeni a obličkách myší. Xenobiotica, 43, 1055 – 1063 (2013).

22) Kojima M, Degawa M. Pohlavné rozdiely v konštitutívnych hladinách mRNA CYP2B22, CYP2C33, CYP2C49, CYP3A22, CYP3A29 a CYP3A46 v pečeni ošípaných: Porovnanie medzi ošípanými Meishan a Landrace. Drug Metab. Pharmacokinet., 31, 185-192 (2016).

23) Kojima M, Sekimoto M, Degawa M. Nový rozdiel súvisiaci s pohlavím v konštitutívnej expresii pečeňových enzýmov podrodiny cytochrómu P4501A u ošípaných Meishan. Biochem. Pharmacol., 75, 1076-1082 (2008).

24) Kojima M, Sekimoto M, Degawa M. Androgénom sprostredkovaná down-regulácia génov podrodiny CYP1A v prasacej pečeni. J. Endocrinol., 207, 203-211 (2010).

25) Kojima M, Degawa M. Hladina androgénu v sére je určená autozomálne dominantnou dedičnosťou a reguluje pohlavie súvisiace gény CYP u ošípaných. Biochem. Biophys. Res. Commun., 430, 833-838 (2013).

26) Waxman DJ, Holloway MG. Pohlavné rozdiely v expresii pečeňových enzýmov metabolizujúcich liečivá. Mol. Pharmacol., 76, 215-228 (2009).

27) Buckley DB, Klaassen CD. Mechanizmus expresie mRNA UDP glukuronozyltransferázy v závislosti od pohlavia v pečeni a obličkách myší. Drug Metab. Dispos., 37, 834-840 (2009).

28) Alnouti Y, Klaassen CD. Mechanizmy rodovo špecifickej regulácie myších sulfotransferáz (Sults). Xenobiotica, 41, 187–197 (2011).

29) Aida K, Negishi M. Trans-pôsobiaci lokus reguluje transkripčnú represiu génu steroidnej 15 -hydroxylázy špecifického pre samice u samcov myší. J. Mol. Endocrinol., 11, 213-222 (1993).

30) Squires EJ, Negishi M. Recipročná regulácia pohlavne závislej represie testosterónovej 15 -hydroxylázy (P-45015) v pečeni a obličkách samcov myší androgénom. Dôkaz pre jeden gén. J. Biol. Chem., 263, 4166-4171 (1988).

31) Arbona JR, Marple DN, Russell RW, Rahe CH, Mulvaney DR, Sartin JL. Sekrečné vzorce a rýchlosť metabolického klírensu bravčového rastového hormónu u ošípaných vybraných na rast. J. Anim. Sci., 66, 3068-3072 (1988).

32) Kojima M, Degawa M. Pohlavné rozdiely v konštitutívnej génovej expresii sulfotransferáz a UDP-glukuronozyltransferáz v prasacej pečeni: Androgénom sprostredkovaná regulácia. Drug Metab. Pharmacokinet., 29, 192-197 (2014).

33) Chowen JA, Frago LM, Argente J. Regulácia sekrécie GH pohlavnými steroidmi. Eur. J. Endocrinol., 151 (Suppl. 3), U95-U100 (2004).

34) Dubreuil P, Pelletier P, Couture Y, Lapierre H, Petitclerc D, Moris set J, Gaudreau P, Brazeau P. Kastrácia a účinky testosterónu na endogénne a somatokrinínom indukované uvoľňovanie rastového hormónu u intaktných a kastrovaných samcov ošípaných. Domest. Anim. Endocrinol., 6, 15-24 (1989).

35) Giustina A, Veldhuis JD. Patofyziológia neuroregulácie sekrécie rastového hormónu u pokusných zvierat a ľudí. Endokr. Rev., 19, 717-797 (1998).