Systémová analýza VEGFA pri karcinóme obličkových buniek: expresia, prognóza, sieť génovej regulácie a regulačné ciele

edmund.chen@wecistanche.com

Úvod

Renálny bunkový karcinóm (RCC), najčastejší malígny nádor vobličky, patrí medzi 10 najbežnejších druhov rakoviny na svete.1 Zodpovedá za približne 330000 prípadov rakoviny na celom svete a viac ako 140{5}} úmrtí ročne.2 Medzi heterogénnymi podtypmi RCC,obličky obličkovékarcinóm z papilárnych buniek (KIRP) je na druhom mieste z hľadiska výskytu, pričom predstavuje 10 až 15 percent RCC, pooblička obličkovájasnobunkový karcinóm (KIRC) s incidenciou 75 percent – ​​80 percent .3Obličkychromofób (KICH) je zriedkavý podtyp RCC, ktorý predstavuje približne 4 až 5 percent RCC.4 Pokročilý RCC je smrteľné ochorenie s 5-ročnou mierou prežitia iba 11,7 percenta.5 Chirurgia a cielená liečba sú primárnymi klinickými terapeutickými metódami RCC.6 Relevantné klinické štúdie ukázali, že použitie inhibítorov imunitných kontrolných bodov v kombinácii s antiangiogénnymi látkami je klinicky účinnejšie u pacientov s RCC.7,8 Nové metódy založené na imunoterapii však čelia aj mnohým výzvam v klinickej aplikácii. Existuje naliehavá potreba identifikovať sľubnejšie terapeutické ciele a prístupy na liečbu RCC.

Vaskulárny endoteliálny rastový faktor A (VEGFA), kritický angiogénny faktor, je dôležitým nádorovo špecifickým faktorom u pacientov s RCC a hrá kľúčovú úlohu v angiogenéze a progresii nádoru.9 VEGFA indukuje adhéziu a migráciu rakovinových buniek väzbou na integrín 9 1.10 Niekoľko inhibítorov VEGFA je klinicky užitočných.11,12 Sunitinib, inhibítor avaskulárnej tyrozínkinázy VEGF, bol schválený na liečbu prvej a druhej línie pokročilého RCC. Sunitinib však môže potenciálne spôsobiťpoškodenie obličieka kardiovaskulárne poškodenie.11 Hoci sa VEGFA považuje za základný nádorovo špecifický faktor u pacientov s RCC, úroveň expresie, génová regulačná sieť, prognostická hodnota a regulačný cieľ VEGFA u pacientov s heterogénnymi podtypmi RCC (KIRC, KICH, a KIRP) zostávajú neobjasnené. Preto je potrebné získať užitočnejšie informácie o vzťahu medzi expresiou VEGFA a výskytom RCC. V tejto štúdii sme použili viaceré bezplatné online databázy na identifikáciu úrovne expresie, siete regulácie génov, prognostickej hodnoty a cieľa regulácie VEGFA u pacientov s RCC. Okrem toho sa táto štúdia zamerala na ďalšie skúmanie vzťahu medzi expresiou VEGFA a výskytom RCC a na poskytnutie nových poznatkov o cieľovej liečbe pacientov s RCC.

Kľúčové slová:Renálny bunkový karcinóm, obličkový obličkový čistý karcinóm, obličkový chromofób, obličkový obličkový papilárny karcinóm, VEGFA, génová regulačná sieť, cieľová predpoveď

CISTANCHE ZLEPŠÍ OCHORENIE OBLIČIEK/OBLIVÍN

Materiály a metódy

Analýza UALCANUALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html) je online databáza používaná ako nástroj na expresiu génov podskupiny nádorov a analýzy prežitia.13,Modul "Analýza expresie" databázy ALCAN sa použil na analýzu údajov o expresii génu TCGA a skríningové kritériá boli nastavené nasledovne: (a) gén: VEGFA; (b) súbor údajov: KIRC, KICH a KIRP; (c) podmienky nastavenia prahu: medzná hodnota P-hodnoty =0.05. Na porovnávaciu analýzu sa použil Studentov t-test.Analýza profilovania génovej expresieAnalýza profilovania génovej expresie (GEPIA) (http://gepia.cancer-pku.cn/index.html) je bezplatná online platforma, ktorá poskytuje údaje o expresii sekvenovania RNA 9736 nádorov a 8587 normálnych vzoriek na analýzu14 diferenciálnej expresie mRNA, metylácie promótora, patologického štádia a korelatívnej prognózy v tejto štúdii. Skríningové kritériá boli nasledovné: (a) gén: VEGFA; (b) súbor údajov: KIRC, KICH a KIRP; (c) podmienky nastavenia prahu: medzná hodnota P-hodnoty =0.05. Na analýzu expresie VEGFA a patologického štádia RCC sa použil Studentov t-test. Na analýzu prognózy pacientov s RCC sa použila Kaplan-Meierova krivka.cBioPortal analýzacBioPortal (http://cbioportal.org) je otvorená online databáza používaná na vizualizáciu, štúdium a analýzu genetických údajov o rakovine.15 V našej štúdii je analýza genetických zmien VEGFA a jeho susedných génov (5 najlepších{{ 9}} zmenené susedné gény VEGFA) sa uskutočnilo pomocou databázy cBioPortal. Skríningové kritériá boli nasledovné: (a) analyzovalo sa 446, 66 a 274 vzoriek KIRC, KICH a KIRP; (b) Z-skóre expresie mRNA relatívne ku všetkým vzorkám (log RNA Seq V2 RSEM) sa získali s použitím prahu z-skóre ± 2,0; (c) gén: VEGFA.Analýza STRINGSTRING (https://string-db.org/cgi/input.pl) je online bezplatná databáza používaná na vytvorenie sietí interakcie proteín-proteín (PPI) medzi cieľovými proteínmi.16 V tejto štúdii sme vytvorili interakciu siete PPI skríningové podmienky s nízkou spoľahlivosťou (0.150) a definované druhy ako Homo sapiens.Analýza GeneMANIAGeneMANIA (http://www.genemania.org) je analytický nástroj na vytváranie PPI, generovanie hypotéz o funkcii génov, analýzu zoznamov génov a sekvenovanie génov na určenie funkcie.17 V tejto štúdii sme vytvorili interakčné siete na skúmanie úlohy VEGFA a top 50 zmenených susedných génov.Metascape analýzaMetascape (https://metascape.org) je jednoduchý a výkonný nástroj na anotáciu a analýzu funkcie génu, ktorý môže používateľom pomôcť použiť v súčasnosti populárne metódy bioinformatickej analýzy na analýzu vsádzkových génov a proteínov na pochopenie funkcie génov alebo proteínov. Štúdia, funkcia génovej ontológie (GO) a analýza obohatenia dráhy VEGFA a jeho zmenených susedných génov v RCC v Kjótskej encyklopédii génov a genómov (KEGG) sa skúmali pomocou Metascape.Analýza DÔVERYTRUST (https://www.grnpedia.orgtrrust/) je manuálne spravovaná databáza ľudských transkripčných regulačných sietí, ktoré obsahujú 8444 a 6552 regulačných vzťahov transkripčného faktora a cieľa 800 ľudských transkripčných faktorov.19 V tejto štúdii sme sa pokúsili identifikovať kľúčový faktor regulujúci expresiu VEGFA a jeho zmenených susedných génov u pacientov s RCC pomocou databázy TRUST.Analýza LinkedOmicsLinkedOmics (http://www.linkedomics.org) je verejná online platforma, ktorá zahŕňa multi-omické údaje zo všetkých 32 typov rakoviny TCGA.20 Poskytuje metódy na analýzu a porovnávanie multiomických údajov o rakovine v rámci a medzi typmi nádorov. V našej štúdii sa kinázové cieľové obohatenie, miRNA cieľové obohatenie a gény odlišne exprimované v korelácii s VEGFA uskutočnili pomocou modulu „LinkInterpreter“ LinkedOmics. Skríningové kritériá boli stanovené nasledovne: (a) minimálny počet troch génov (veľkosť); (b) typ rakoviny: KIRC, KICH a KIRP; c) simulácia 500; (d) priradenie vyhľadávania: VEGFA a 50 najlepších zmenených susedných génov; e) cieľový súbor údajov: RNA-seq (typ údajov).Analýza časovačaTIMER (https://cistrome.shinyapps.io/timer/) je komplexný zdroj pre systematickú analýzu imunitných buniek infiltrujúcich nádor, vrátane B buniek, CD4 plus T buniek, CD8 plus T buniek, neutrofilov, makrofágov a dendritických buniek. V našej štúdii bola korelácia medzi úrovňou expresie VEGFA a infiltráciou imunitných buniek hodnotená „génovým modulom“ TIMER.

Výsledky

Expresia VEGFA u pacientov s RCCPorovnali sme hladiny expresie VEGFA u pacientov s RCC s normálnymi ľudskými tkanivami a zistili sme, že transkripčné hladiny VEGFA stratifikované podľa typu vzorky, pohlavia a patologického štádia KIRC boli významne upregulované (P < {{0}}}="" .001)="" (obrázok="" 1(a)="" až="" (c)).="" podobne="" sa="" zvýšila="" hladina="" expresie="" vegfa="" v="" tkanivách="" kich="" na="" základe="" typu="" vzorky,="" pohlavia="" a="" štádia="" kich="" 2="" (p="">< 0,05)="" (obrázok="" 1="" (d)="" až="" (f)).="" avšak="" hladina="" expresie="" vegfa="" v="" tkanivách="" kirp="" bola="" znížená="" na="" základe="" typu="" vzorky="" a="" mužského="" pohlavia="" (p="">< 0,05)="" (obrázok="" 1="" (g)="" a="" (h)).="" ďalej="" sme="" hodnotili="" koreláciu="" medzi="" diferenciálnou="" expresiou="" vegfa="" a="" patologickým="" štádiom="" u="" pacientov="" s="" rcc.="" naše="" výsledky="" ukázali="" významnú="" koreláciu="" medzi="" expresiou="" vegfa="" a="" patologickým="" štádiom="" u="" pacientov="" s="" kirc="" (p="0.0471)" a="" kirp="" (p="4.36e-6)" (obrázok="" 2)="" .="" okrem="" toho="" sme="" použili="" gepia="" na="" vyhodnotenie="" prognostickej="" hodnoty="" expresie="" vegfa="" u="" pacientov="" s="" rcc.="" celkové="" prežitie="" bolo="" dlhšie="" u="" pacientov="" s="" kirp,="" ktorí="" mali="" skôr="" nízke="" ako="" vysoké="" hladiny="" expresie="" vegfa="" (p="0.00044)" (obrázok="" 3(c)).="" percento="" prežitia="" bolo="" vyššie="" u="" pacientov="" s="" kirp,="" ktorí="" mali="" pred="" 100="" mesiacmi="" nízke="" ako="" vysoké="" hladiny="" expresie="" vegfa="" (p="0.0016)" (obrázok="" 3(f)).="" opačný="" výsledok="" sa="" však="" zistil="" po="" 100="" mesiacoch="" u="" pacientov="" s="" kirp="" (obrázok="" 3="">

Genetická zmena a hladina metylácie promótora expresie VEGFA u pacientov s RCCGenetické zmeny VEGFA u pacientov s RCC boli hodnotené pomocou TCGA. Naše výsledky ukázali, že expresia VEGFA sa u pacientov s KIRC zmenila o 4 percentá (doplnkový obrázok 1(a)). Úroveň metylácie promótora expresie VEGFA však bola nižšia u pacientov s KIRC ako u normálnych ľudí (doplnkový obrázok 1 (b)). Okrem toho sme zistili 8-percentnú zmenu úrovne expresie VEGFA u pacientov s KICH (doplnkový obrázok 1 (c)). Podobne sa expresia VEGFA zmenila o 4 percentá u pacientov s KIRP (doplnkový obrázok 1(e)). Úroveň metylácie promótora expresie VEGFA však bola vyššia u pacientov s patologickým štádiom 1 KIRP ako u normálnych jedincov (doplnkový obrázok 1 (f))

Zmena susedných génov a sieť interakcií VEGFA u pacientov s RCCSusedná génová zmena expresie VEGFA u pacientov s RCC bola analyzovaná pomocou softvéru cBioPortal. Zistili sme frekvencie zmien susedných génov VEGFA vyššie alebo rovné 11,11 percenta, väčšie alebo rovné 20 percentám a väčšie alebo rovné 9,09 percentám (50 najčastejšie zmenených susedných génov) u pacientov s KIRC, KICH a KIRP, (doplnkové tabuľky 1–3). Najčastejšie zmenené susedné gény VEGFA u pacientov s KIRC boli VHL (72,22 percenta), PBRM1 (33,33 percenta) a MUC16 (22,22 percenta) (doplnková tabuľka 1). Navyše TRRAP (60.{18}} percent), PABPC1 (60.{21}} percent) a MUC5B (60.00 percent) boli najčastejšie zmenené susedné gény VEGFA u pacientov s KICH (doplnková) tabuľka 2). Tri najčastejšie zmenené susedné gény VEGFA u pacientov s KIRP boli BAP1 (27,27 percenta), MS4A15 (18,18 percenta) a TGM7 (18,18 percenta) (doplnková tabuľka 3).

Potom sme skúmali potenciálne interakcie medzi VEGFA a jeho susednými génmi. Sieť PPI bola vytvorená pomocou softvéru STRING. Získali sme 43 uzlov a 95 hrán v sieťach PPI u pacientov s KIRC (doplnkový obrázok 2 (a)). Navyše, trimetylácia peptidyl lyzínu, metylácia peptidyl-lyzínu, extracelulárna matrica a glykozylácia s proteínom O boli primárnymi funkciami VEGFA a jeho susedných génov u pacientov s KIRC (doplnkový obrázok 2 (b)). Získali sme tiež 44 uzlov a 125 hrán v sieťach PPI u pacientov s KICH (doplnkový obrázok 2 (c)). VEGFA a jej susedné gény mali u pacientov s KICH nasledujúce funkcie: spracovanie O-glykánov, Golgiho lumen, glykozylácia b proteín O-viazaná, udržiavanie epitelovej štruktúry a organizácia cytoskeletu stredného vlákna (doplnkový obrázok 2 (d)). Okrem toho sa v sieťach PPI u pacientov s KIRP získalo 30 uzlov a 57 hrán (doplnkový obrázok 2 (e)). Vývoj svalovej štruktúry, diferenciácia svalových buniek, vývoj svalového tkaniva a vývoj štrukturálnej zložky svalového tkaniva boli primárnymi funkciami VEGFA a jeho susedných génov u pacientov s KIRP (doplnkový obrázok 2 (f)). VEGFA je pripojený k svojim susedným génom do komplexnej interakčnej siete koexpresiou, fyzickými interakciami, predpovedanými zdieľanými proteínovými doménami a spoločnou lokalizáciou (doplnkový obrázok 2 (b) až (f))

Analýza obohatenia dráhy GO a KEGGPomocou softvéru Metascape sa skúmala funkcia GO a analýza obohatenia KEGG dráhy VEGFA a top 50 zmenených susedných génov u pacientov s RCC. Naše výsledky ukázali, že bunkové zložky súvisiace s VEGFA a jej susednými génmi u pacientov s KIRC sa podieľali hlavne na bazálnej membráne, caveola, adhéznom spojení, časti spermií a časti kontraktilných vlákien (doplnkový obrázok 3 (a)). Okrem toho morfogenéza koronárnej vaskulatúry, vývoj kardiomyocytov, pozitívna regulácia predlžovania axónov a adhézia heterofilných buniek prostredníctvom adhéznych molekúl buniek plazmatickej membrány boli hlavnými biologickými procesmi expresie VEGFA a jej zmenených susedných génov u pacientov s KIRC (doplnkový obrázok 3(b)). Molekulárne funkcie VEGFA a jeho top 50 zmenených susedných génov u pacientov s KIRC zahŕňali najmä štrukturálnu zložku extracelulárnej matrice, väzbu molekúl bunkovej adhézie a katalytickú aktivitu, ako aj pôsobenie na RNA (doplnkový obrázok 3 (c)). KEGG dráha VEGFA a jej susedné gény v KIRC sa podieľali hlavne na signálnej dráhe AGE-RAGE pri diabetických komplikáciách a signálnej dráhe PI3K-Akt (doplnkový obrázok 3 (d)). Golgiho lumen, extracelulárna matrica, komplex ATPázy a Z disk boli bunkové zložky súvisiace s expresiou VEGFA a jeho susedných génov u pacientov s KICH (doplnkový obrázok 3(e)). Okrem toho hlavné biologické procesy zahŕňajúce expresiu VEGFA a jeho top 50 zmenených susedných génov u pacientov s KICH boli udržiavanie gastrointestinálneho epitelu, negatívna regulácia organizácie bunkových zložiek a hojenie rán (doplnkový obrázok 3 (f)) . Molekulárnymi funkciami VEGFA a jeho susedných génov u pacientov s KICH boli aktivita ATPázy, väzba aktínového vlákna a väzba proteázy (doplnkový obrázok 3 (g)). Transportéry ATP-väzbovej kazety (ABC) a infekcia vírusom ľudskej T-bunkovej leukémie 1 boli zapojené do analýzy KEGG dráhy VEGFA a jej top 50 zmenených susedných génov u pacientov s KICH (doplnkový obrázok 3(h)). Okrem toho sa bunkové zložky súvisiace s VEGFA a jeho susednými génmi u pacientov s KIRP podieľali hlavne na Golgiho lúmene a centriole (doplnkový obrázok 3 (I)). Okrem toho, tkanivová homeostáza, homeostáza myeloidných buniek, spracovanie O-glykánu a bunková odpoveď na lipidy boli hlavnými biologickými procesmi zapojenými do expresie VEGFA a jeho zmenených susedných génov u pacientov s KIRP (doplnkový obrázok 3 (j)). Molekulárne funkcie VEGFA a jeho top 50 zmenených susedných génov u pacientov s KIRP zahŕňali najmä aktivitu transkripčného koaktivátora, aktivitu peptidázy cysteínového typu a väzbu kalmodulínu (doplnkový obrázok 3 (k)). Infekcia Vibrio cholerae, dilatovaná kardiomyopatia a infekcia ľudským cytomegalovírusom sa podieľali na analýze KEGG dráhy VEGFA a jej zmenených susedných génov u pacientov s KIRP (doplnkový obrázok 3 (l)).

CISTANCHE ZLEPŠÍ INFEKCIU OBLIČIEK/OBLIVÍN

Ciele transkripčného faktora VEGFA u pacientov s RCCPotenciálne ciele transkripčného faktora, kinázy a miRNA VEGFA u pacientov s RCC sa získali pomocou softvéru TRRUST (tabuľka 1). Hypoxiou indukovateľný faktor 1 alfa podjednotka (HIF1A), transkripčný faktor AP-2 alfa (TFAP2A) a estrogénový receptor 1 (ESR1) boli kľúčovými transkripčnými faktormi zapojenými do siete VEGFA a jeho susedných génov u pacientov s KIRC (P < 0.05).="" rora,="" setd2,="" vegfa="" a="" vhl="" majú="" regulované="" gény="" hif1a.="" okrem="" toho="" tfap2a="" reguloval="" funkcie="" adra1a="" a="" vegfa.="" nr5a2="" a="" vegfa="" majú="" regulované="" gény="" esr1.="" ešte="" viac,="" kľúčové="" ciele="" transkripčného="" faktora="" zapojené="" do="" siete="" vegfa="" a="" jeho="" susedných="" génov="" boli="" prevodník="" signálu="" a="" aktivátor="" transkripcie="" 3="" (stat3),="" jadrový="" faktor="" zosilňovača="" génu="" kappa="" ľahkého="" polypeptidu="" v="" b-bunkách="" 1="" (nfkb1)="" a="" homeodoména.="" interagujúca="" proteínkináza="" 2="" (hipk2)="" u="" pacientov="" s="" kich="" (p="">< 0.01).="" regulované="" gény="" stat3="" boli="" a2m,="" muc4,="" muc5b,="" tp53="" a="" vegfa.="" okrem="" toho="" nfkb1="" reguloval="" funkcie="" a2m,="" muc5b,="" muc6,="" tnc,="" tp53="" a="" vegfa.="" tp53="" a="" vegfa="" majú="" regulované="" gény="" hipk2.="" okrem="" toho,="" forkhead="" box="" o3="" (foxo3),="" tfap2a="" (aktivačný="" enhancer="" viažuci="" proteín="" 2="" alfa)="" a="" homológ="" 1="" onkogénu="" e26="" vírusu="" erytroblastózy="" v-ets="" (ets1)="" boli="" kritickými="" cieľmi="" transkripčného="" faktora="" vegfa="" a="" jeho="" susedných="" génov="" u="" pacientov="" s="" kirp="" (="" p="">< 0,05).="" okrem="" toho="" bcl2l11="" a="" vegfa="" regulovali="" gény="" foxo3.="" okrem="" toho="" tfap2a="" reguloval="" funkcie="" muc4="" a="" vegfa.="" casp1="" a="" muc4="" boli="" gény="" regulované="">

Ciele kinázy a miRNA VEGFA u pacientov s RCC Tiež sme získali tri najlepšie kinázové ciele a miRNA ciele siete VEGFA pomocou LinkedOmics (tabuľka 2). Cieľová sieť VEGFA miRNA v KIRC bola spojená s ATAAGCT MIR-21 (P < 0.05).="" okrem="" toho="" boli="" kinázovými="" cieľmi="" vegfa="" kináza="" atm="" u="" pacientov="" s="" kich="" (p="">< 0.05).="" okrem="" toho="" kináza="" cdk1="" a="" kináza="" aurkb="" boli="" kinázovými="" cieľmi="" vegfa="" u="" pacientov="" s="" kirp="" (p="">< 0,05).="" mirna="" ciele="" vegfa="" boli="" (tcgatgg)="" mir-213,="" (tctgatc)="" mir-383="" a="" (caggtcc)="" mir-492="" u="" pacientov="" s="" kirp="" (p=""><>

Korelácia rozdielne exprimovaných génov a expresie VEGFA u pacientov s RCCZískali sme údaje o sekvenovaní mRNA od 533 pacientov s KIRC v databáze TCGA LinkedOmics. Ako je znázornené na doplnkovom obrázku 4 (a), 2 0, 158 génov úzko súvisí s VEGFA. Spomedzi nich 11 417 a 8 741 génov vykazovalo pozitívne a negatívne korelácie s expresiou VEGFA. Okrem toho 50 významných génov pozitívne a negatívne korelovalo s expresiou VEGFA u pacientov s KIRC (P < 0,05)="" (doplnkový="" obrázok="" 4="" (b)="" a="" (c)).="" navyše="" expresia="" vegfa="" mala="" silnú="" pozitívnu="" asociáciu="" s="" notch4="" (pearsonov="" korelačný="" koeficient="0.7023," p="2.076e–80)" (doplnkový="" obrázok="" 5(a)),="" gpr4="" (pearsonova="" korelácia{="" {19}}.702,="" p="2.63e–80)" (doplnkový="" obrázok="" 5(b))="" a="" trib2="" (pearsonova="" korelácia="0.6972," p="8.902e–79" )="" (doplnkový="" obrázok="" 5(c))="" výrazy.="" ďalej="" sme="" analyzovali="" údaje="" o="" sekvenovaní="" mrna="" 66="" pacientov="" s="" kich="" v="" databáze="" tcga="" a="" zistili="" sme,="" že="" 19="" 216="" génov="" úzko="" súvisí="" s="" expresiou="" vegfa.="" medzi="" nimi="" 8="" 820="" a="" 10="" 396="" génov="" vykazovalo="" pozitívne="" a="" negatívne="" korelácie="" s="" expresiou="" vegfa="" (doplnkový="" obrázok="" 4="" (d)).="" identifikovali="" sme="" tiež="" 50="" významných="" génov,="" ktoré="" pozitívne="" a="" negatívne="" korelovali="" s="" expresiou="" vegfa="" u="" pacientov="" s="" kich="" (doplnkový="" obrázok="" 4="" (e)="" a="" (f)).="" okrem="" toho="" expresia="" vegfa="" bola="" pozitívne="" spojená="" s="" ckmt2="" (pearsonova="" korelácia="0.6474," p="4.236e–9)" (doplnkový="" obrázok="" 5(d)),="" rragd="" (pearsonova="" korelácia="0" .6279,="" p="1.673e–8)" (doplnkový="" obrázok="" 5(e))="" a="" ppargc1a="" (pearsonova="" korelácia="0.6086," p="5.93e–8)" (doplnkový="" obrázok="" 5(f)).="" nakoniec="" sme="" analyzovali="" údaje="" o="" sekvenovaní="" mrna="" 290="" pacientov="" s="" kirp="" v="" databáze="" tcga.="" okrem="" toho="" 20="" 023="" génov="" úzko="" súviselo="" s="" expresiou="" vegfa.="" medzi="" nimi="" 11="" 130="" a="" 8="" 893="" génov="" vykazovalo="" pozitívne="" a="" negatívne="" korelácie="" s="" expresiou="" vegfa="" vegfa="" (doplnkový="" obrázok="" 4="" (g)).="" identifikovali="" sme="" 50="" významných="" génov,="" ktoré="" pozitívne="" a="" negatívne="" korelovali="" s="" expresiou="" vegfa="" u="" pacientov="" s="" kirp="" (doplnkový="" obrázok="" 4="" (h)="" a="" (i)).="" expresia="" vegfa="" bola="" pozitívne="" spojená="" s="" flt1="" (pearsonova="" korelácia="0.8184," p="2.909e–71)" (doplnkový="" obrázok="" 5="" (g)),="" c6orf223="" (pearsonova="" korelácia="0." 7779,="" p="4.606e–60)" (doplnkový="" obrázok="" 5(h))="" a="" esm1="" (pearsonova="" korelácia="0.7602," p="6.983e–56)" (doplnkový="" obrázok="" 5="" i))="">

CISTANCHE ZLEPŠÍ BOLESŤ OBLIČIEK/OBLIVÍN

Infiltrácia imunitných buniek a expresia VEGFA u pacientov s RCCAby sme ďalej odhalili vzťah medzi infiltráciou imunitných buniek a expresiou VEGFA u pacientov s RCC, skúmali sme koreláciu medzi infiltráciou imunitných buniek a expresiou VEGFA pomocou softvéru TIMER. Úroveň expresie VEGFA u pacientov s KIRC bola pozitívne spojená s infiltráciou CD8 plus T buniek (Cor=0.197, P=3.36e-5), CD4 plus T buniek ( Cor= 0.301, P=4.41e-11) a neutrofily (Cor =0.223, P= 1.44e -6) (doplnkový obrázok 6(a)). Ďalej sme analyzovali koreláciu medzi infiltráciou imunitných buniek a expresiou VEGFA u pacientov s KICH. Infiltrácia B (Cor=0.349, P=4.39e-3), CD8 plus T (Cor= 0.398, P=1.03e -5) a dendritické bunky (Cor=0.253, P=4.18e-2) boli pozitívne spojené s expresiou VEGFA (doplnkový obrázok 6(b)) . Nakoniec hladina expresie VEGFA u pacientov s KIRC bola pozitívne spojená s infiltráciou B (Cor= 0.16, P=1.04e-2), CD8 plus T (Cor{ {41}}.179, P=0.384e-3) a CD4 plus T bunky (Cor=0.157, P=1.14e-2 ) (doplnkový obrázok 6(c)). Infiltrácia makrofágmi (Cor=-0,226, P=3.22e-4) však bola negatívne spojená s expresiou VEGFA (doplnkový obrázok 6 (c)).

Diskusia

VEGFA, člen rodiny VEGF, je dôležitým cytokínom a popredným induktorom angiogenézy.22 Predklinické štúdie uvádzajú, že VEGFA je nadmerne exprimovaný u pacientov s RCC.23,24 Avšak úroveň expresie VEGFA u pacientov s RCC zostáva kontroverzná 25,26 Nádorová angiogenéza hrá dôležitú úlohu v progresii RCC. Lieky zamerané na nádorovú angiogenézu sa v liečbe RCC používajú už takmer 20 rokov.27 Terapeutické účinky týchto liekov však stále nie sú ideálne a je potrebné znížiť ich vedľajšie účinky. Snažili sme sa odhaliť sieť regulácie génov, prognostickú hodnotu a cieľovú predikciu VEGFA u pacientov s RCC.

Okrem toho sme skúmali hladinu expresie VEGFA a koreláciu medzi diferenciálnou expresiou VEGFA a patologickým štádiom u pacientov s RCC. Expresia VEGFA bola upregulovaná skôr u pacientov s KIRC a KICH ako u normálnych jedincov. Napriek tomu pacienti s KIRP mali zníženú expresiu VEGFA. Tieto zistenia boli podobné zisteniam predchádzajúcej štúdie u pacientov s KIRC, KICH a KIRP26,28 a boli v rozpore s predchádzajúcimi zisteniami štúdie u pacientov s KICH.25 Pokúsili sme sa vysvetliť protichodné výsledky prostredníctvom zmeny génu a metylácie promótora u pacientov s RCC. Zistili sme, že genetické zmeny sa vyskytli u 4 percent, 8 percent a 4 percent pacientov s KIRC, KICH a KIRP. Navyše hladina metylácie promótora VEGFA bola nižšia u pacientov s rôznymi štádiami KIRC ako u zdravých jedincov; na rozdiel od toho hladina metylácie promótora VEGFA bola vyššia u pacientov s KIRP v štádiu 1. Medzi pacientmi s KICH a zdravými jedincami sa však nezistili žiadne rozdiely v úrovni metylácie promótora VEGFA. Preto predpokladáme, že genetická zmena a metylácia VEGFA môže byť hlavnou príčinou rôznych expresií VEGFA u pacientov s RCC. Expresia VEGFA a patologické štádiá KIRC a KIRP. Okrem toho prežitie pacientov s KIRP s nízkymi hladinami expresie VEGFA bolo dlhšie ako u pacientov s KIRP s vysokými hladinami expresie VEGFA. Predovšetkým sme získali opačné výsledky po 100 mesiacoch u pacientov s KIRP na základe kriviek prežitia bez ochorenia. Hladina expresie VEGFA teda môže byť prognostickým indikátorom u pacientov s KIRP. Niektoré štúdie naznačili, že expresia VEGF môže byť základným znakom pokročilého RCC. Detekcia koexpresie CD147/VEGF môže pomôcť predpovedať prognózu pacientov s pokročilým RCC.29

Okrem toho 50 najčastejších susedných génov VEGFA bolo zmenených u pacientov s RCC podľa nasledujúcich frekvencií: Väčšie alebo rovné 11,11 percenta (KIRC), väčšie alebo rovné 20 percentám (KICH) a väčšie alebo rovné 9,09 percent (KIRP). Potom sme skúmali potenciálne interakcie a funkcie VEGFA a jeho susedných génov; zistilo sa, že tieto majú zložité a tesné spojovacie siete. U pacientov s KIRC sa tieto gény podieľali hlavne na metylácii proteínov. U pacientov s KICH však susedné gény VEGFA fungovali pri glykozylácii proteínov a udržiavaní bunkovej štruktúry. Okrem toho susedné gény VEGFA súviseli hlavne s rastom svalových vlákien a diferenciáciou u pacientov s KIRP. Dynamické zmeny v metylácii proteínov sú nevyhnutné pre určenie bunkového osudu a vývoj buniek. K metylácii proteínov dochádza predovšetkým na bočných reťazcoch zvyškov Lys a Arg.30 Napríklad metylácia histónov sa bežne pozoruje pri rakovinách s metyláciou na zvyškoch Lys a Arg.31 Aberantná metylácia a O-glykozylácia sú bežné epigenetické modifikácie nádoru. Aberantná O-glykozylácia prispieva k rozvoju rakoviny prostredníctvom priamej indukcie onkogénnych vlastností v rakovinových bunkách.32 KIRP je malígny nádorobličkovéparenchým s papilárnou alebo tubulárnou papilárnou štruktúrou s vláknitou cievnou osou. Výskyt KIRP môže súvisieť s výskytom RCC so strómou podobnou angioleiomyómu (známou aj ako stróma hladkého svalstva alebo leiomyómu), vzhľadom na podstatnú podobnosť ich imunohistochemických fenotypov.33 Vyššie uvedené dôkazy odhaľujú, že susedné gény VEGFA môžu ovplyvniť výskyt a progresie RCC.

CISTANCHE ZLEPŠÍ DIALÝZU OBLIČIEK/RENÁL

Okrem toho analýza obohatenia GO odhalila, že funkcie VEGFA a jeho susedných génov u pacientov s KIRC súvisia hlavne s väzbou adhéznych molekúl buniek a katalytickou aktivitou, ako aj pôsobením na RNA. Adhézna molekula epitelových buniek (EPCAM) nedávno získala pozornosť ako kandidátsky proteín na diagnostiku, prognózu a liečbu rôznych nádorov. EPCAM je nezávislý prognostický molekulárny marker v RCC a môže poskytnúť pomocnú informáciu pre lepšiu prognózu.34 Zistili sme, že aktivita ATPázy, väzba na aktínové filamenty a väzba proteázy boli molekulárnymi funkciami VEGFA a jej susedných génov u pacientov s KICH. Je známe, že u pacientov s KICH35 sa vyskytujú mitochondriálne morfologické a funkčné zmeny; Zmena aktivity ATPázy môže byť potenciálnym patogénnym mechanizmom. Na potvrdenie tohto mechanizmu sú však potrebné ďalšie štúdie. V našej štúdii molekulárne funkcie VEGFA a jeho zmenených susedných génov u pacientov s KIRP zahŕňali hlavne aktivitu transkripčného koaktivátora, aktivitu peptidázy cysteínového typu a väzbu kalmodulínu. Kalmodulín je všadeprítomný intracelulárny proteín viažuci vápnik údajne spojený s bunkovým cyklom. Je známe, že pacienti s RCC vykazujú pozitívnu koreláciu medzi obsahom kalmodulínu v nádore a rýchlosťou rastu nádoru.36 Zistili sme, že signálna dráha AGE-RAGE pri diabetických komplikáciách, signálna dráha PI3K-Akt, pôsobenie transportéra ABC a vírus ľudskej T-bunkovej leukémie 1 infekcia sa podieľala hlavne na analýze KEGG dráhy VEGFA a jej susedných génov u pacientov s RCC; tieto procesy úzko súvisia s výskytom a progresiou rakoviny.37 Regulácia týchto signálnych dráh teda môže byť potenciálnym cieľom liečby RCC.

Analyzovali sme aj ciele a regulátory VEGFA u pacientov s RCC. Najprv sme skúmali ciele transkripčného faktora VEGFA a jeho susedných génov u pacientov s RCC a zistili sme, že HIF1A, TFAP2A a ESR1 boli rozhodujúce regulačné faktory u pacientov s KIRC. HIF-1 je kľúčový génový regulátor zapojený do bunkovej odpovede na hypoxiu. Nadmerná expresia HIF{4}} je spojená s patogenézou RCC; okrem toho funkčný polymorfizmus HIF1A môže viesť k náchylnosti na RCC a polymorfizmus HIF1A môže ovplyvniť recidívu, progresiu a prežitie RCC.38 Avšak TFAP2A a ESR1 neboli u pacientov s RCC hlásené. Zistili sme tiež, že STAT3, NFKB1 a HIPK2 boli významne regulované faktory u pacientov s KICH. Proteíny STAT3 sú kľúčové transkripčné faktory, ktoré sú abnormálne aktivované pri rôznych malignitách, vrátane RCC.39 Inhibícia STAT3 môže brániť migrácii a invázii buniek RCC.40

NFKB1 súvisí s patogenézou mnohých malígnych nádorov, vrátane RCC. Funkčný polymorfizmus promótora NFKB1 je spojený so zvýšeným rizikom RCC.41 HIPK2 hrá jedinečnú úlohu v regulácii bunkovej apoptózy a proliferácie, ako aj pri oprave poškodenia DNA a iných základných procesoch; HIPK2 teda priťahuje čoraz väčšiu pozornosť. Fosforylácia FOXM1 pomocou HIPK2 podporuje transkripčnú aktivitu a proliferáciu buniek FOXM1 u pacientov s RCC, čo môže byť potenciálny mechanizmus liečby RCC.42 V našej štúdii sa zistilo, že FOXO3, TFAP2A a ETS1 sú kritickými cieľmi transkripčného faktora VEGFA a jeho susedných génov. u pacientov s KIRP. FOXO3-sprostredkovaná expresia fosfofruktokinázy-M inhibuje rast, migráciu a inváziu buniek RCC43. remodelovanie matrice počas angiogenézy; môže sa podieľať na angiogenéze RCC.45 Ďalej sme skúmali ciele kinázy spojené s VEGFA (ATM v KICH, ako aj CDK1 a AURKB v KIRP) a miRNA ciele spojené s VEGFA (MIR-21 v KIRC; MIR{ {23}}, MIR-383 a MIR-492 v KIRP). Za posledné desaťročie mnohé štúdie ukázali, že poruchy alebo mutácie proteínkinázy zohrávajú kauzálnu úlohu pri výskyte rakoviny. Výskum rakoviny preukázal kritickú úlohu mnohých proteínkináz pri tumorigenéze a progresii rakoviny u ľudí, vďaka čomu sú tieto molekuly účinnými kandidátmi na nové cielené terapie.46 Inhibítory kináz spôsobili revolúciu v liečbe určitých typov malígnych nádorov.47 miRNA sú triedou kódujúce RNA, ktoré hrajú podstatnú úlohu pri regulácii génovej expresie. Inhibítory miRNA znižujú expresiu cieľových génov interakciou s 3′ nepreloženou oblasťou cieľových génov. Ich dôležitá úloha pri regulácii expresie tumor supresorových génov a expresie onkogénov zvyšuje ich úlohu pri tumorigenéze.48 Objav cieľov miRNA môže nakoniec objasniť mechanizmy, ktoré sú základom tumorigenézy a vývoja protirakovinových liekov.49 Táto štúdia poskytuje referenciu a zdôrazňuje dôležitosť ďalšej analýzy regulovaných faktorov, kináz a miRNA ako potenciálnych terapeutických cieľov pre liečbu RCC.

Skúmali sme koreláciu medzi rozdielne exprimovanými génmi a expresiou VEGFA u pacientov s RCC. Viac ako 10000 génov pozitívne a negatívne korelovalo s expresiou VEGFA u pacientov s RCC. Spomedzi nich boli u pacientov s RCC nájdené gény s najvyššou koreláciou s VEGFA: NOTCH4, GPR4 a TRIB2 v KIRC; CKMT2, RRAGD a PPARGC1A v KICH; a FLT1, C6orf223 a ESM1 v KIRP. Zacielenie na tieto gény súvisiace s rakovinou však môže poskytnúť adjuvantnú terapiu RCC. Imunoinfifiltrácia RCC úzko súvisí s klinickou prognózou.50 Transport imunitných buniek do rakovinových miest prebiehal hlavne cez krvné cievy. Ako sa očakávalo, zistili sme, že expresia VEGFA u pacientov s RCC bola pozitívne spojená s infiltráciou imunitných buniek, vrátane CD8 plus T buniek, CD4 plus T buniek, makrofágov, neutrofilov a dendritických buniek. Dúfame, že zlepšíme infiltráciu RCC imunitnými bunkami vývojom liekov pôsobiacich na VEGFA alebo regulačné ciele súvisiace s VEGFA. Na záver, skúmaním úrovne expresie a siete génovej regulácie VEGFA u pacientov s RCC sme poskytli viac informácií o štúdiu a liečbe RCC. Ďalej sme identifikovali nové terapeutické ciele a prognostické biomarkery na presnú predikciu prežitia pacientov s RCC.