Tetrandrín zmierňuje poranenia podocytov prostredníctvom kalpaínovej blokády-1 závislej od vápnika

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Yin Ding, Xuanli Tang, Yuhui Wang, Dongrong Yu, Caifeng Zhu a Jin Yu*

Abstraktné

Pozadie:Podocyty sa stali kľúčovým cieľom intervencií v proteinuriiobličkychoroby. Mnohé štúdie uviedli, že nadmerná expresia katiónového kanála proteínu 6 (TRPC6) s prechodným potenciálom receptora pri poškodení podocytov zvyšuje intracelulárny prítok Ca2 plus a stimuluje signalizáciu proteázy calpain-1 závislú od Ca2. Tradičný čínsky liek, tetrandrín, neselektívny blokátor Ca2 plus kanálov, sa dlho používa na liečbu chronických ochoreníobličkychoroba. Cieľom tohto výskumu bolo preskúmať možné mechanizmy, ktoré sú základom antiproteinurických vlastností tetrandrínu.

Metódy:Skúmali sme zapojenie tetrandrínu do signalizácie Ca2 plus dependentnej calpain-1 u myších podocytov a potkanov s nefropatiou vyvolanou adriamycínom. Cyklosporín A (CsA) a U73122 sa použili ako pozitívne kontroly. Skúmala sa životaschopnosť buniek, cytotoxicita, koncentrácia Ca2 plus, aktivita calpainu a hladiny expresie mRNA a proteínov signálnych dráh calpainu-1. Merali sa klinické a patologické zmeny.

Výsledky:Tetrandrín znížil intracelulárny Ca2 plus influx v kultivovaných TRPC6-nadmerne exprimujúcich podocytoch. V štúdiách in vitro aj in vivo podávanie tetrandrínu znížilo aktivitu calpaínu a expresiu calpaínu-1 a obnovilo expresiu downstream Talinu-1 a nefrínu. V porovnaní s CsA liečba tetrandrínom vykazovala vynikajúce inhibičné účinky na aktivitu calpainu a expresiu calpainu{4}}.

Závery:Tetrandrín má terapeutický potenciál pri poškodení podocytov tým, že blokuje od Ca2 plus závislú aktiváciu signalizačnej dráhy calpain-1. Tetrandrín znížil proteinúriu, zlepšil funkciu obličiek a zmiernil patologické poškodenie obličiek.

Kľúčové slová:Tetrandrín, poškodenie podocytov, katiónový kanál 6 s prechodným potenciálom receptora, calpaín-1

Cistanche tubulosa zabraňuje ochoreniu obličiek, kliknite sem a získajte vzorku

Pozadie

Podocyty sú predpokladom zachovania selektívnej permeability glomerulárnej filtračnej bariéry a glomerulárnej štrukturálnej integrity. Poškodenie podocytov je typicky spojené s proteinurickými ochoreniami obličiek, vrátane fokálnej segmentálnej glomerulosklerózy (FSGS), membránovej nefropatie, ochorenia s minimálnymi zmenami a diabetickejobličkyochorenie [1–4]. Ochrana a obnova podocytov pred škodlivými faktormi predstavuje hlavnú výzvu pri úspešnej liečbe ochorenia obličiek.

Podocyty sú vysoko špecializované, terminálne diferencované bunky umiestnené mimo glomerulárnej bazálnej membrány a charakterizované výbežkami chodidiel. Dysfunkcia regulácie kalciovej signalizácie v podocytoch vedie k dezorganizácii podocytového aktínového cytoskeletu, k poškodeniu výbežku chodidla, narušeniu štrbinovej bránice a proteinúrii. Proteín 6 katiónového kanála s prechodným receptorovým potenciálom (TRPC6), nový proteín v podocytoch spojený so štrbinou diafragmy, bol identifikovaný ako nešpecifický Ca2 plus vodivý iónový kanál [5–8]. Glomerulárna expresia TRPC6 je zvýšená pri mnohých dedičných a získaných proteinurických ochoreniach. Predchádzajúce štúdie uvádzali, že nadmerná expresia TRPC6 v podocytoch spúšťa vynikajúce zvýšenie intracelulárneho Ca2 plus prílev, o ktorom sa predpokladá, že je zodpovedný za poškodenie buniek podocytov. Zvýšené zaťaženie vápnikom v podocytoch aktivuje downstream signálne dráhy vrátane calpainu{10}}, Talinu{11}}, nefrínu a kalcineurínu, aby sa modulovala aktivita alebo expresia cieľových génov [9–12]. Fangji Huangqi Tang je klasická tradičná čínska medicína (TCM) na liečbu nefrotického syndrómu [13]. Skladá sa zo šiestich bylín: Radix Stephania Tetrandra (korene Stephania tetrandra), Radix Astragali (korene Astragalus membranaceus), Rhizoma Atractylodis Macrocephalae (korene Atractylodes macrocephaly), Radix Glycyrrhizae (korene Glycyrrhiza Zuralensis), Rhizoma Atractylodis Macrocephalae (korene Zingiber Officinale) a Fructus Ziziphi Jujubae (Fructus Ziziphus jujuba) [1]. Tetrandrín, jedna z hlavných aktívnych zložiek Radix Stephania Tetrandra, neselektívny blokátor Ca2 plus kanálov, bol testovaný v klinických štúdiách a bol indikovaný na zmiernenie proteinúrie a zlepšenie funkcie obličiek [14, 15]. Predchádzajúca štúdia preukázala blokujúce účinky tetrandrínu na signalizáciu RhoA závislú od Ca2 plus v podocytoch [16], ale základné mechanizmy neboli objasnené. V tomto dokumente boli vyvinuté modely nadmernej expresie TRPC{22}} in vitro a in vivo. Po podaní tetrandrínu sa vyhodnotili zmeny v TRPC6-závislej signalizácii Ca2 plus, vrátane downstream cieľov, calpainu-1, Talinu-1, nefrínu a kalcineurínu. Cyklosporín A (CsA), inhibítor kalcineurínu, široko používaný pri liečbe ochorení s proteinúriou [17] a U73122, inhibítor otvárania kanála TRPC6 [18] sa použili ako pozitívne kontroly.

Metódy

Bunková kultúra a konštrukcia plazmidov

Podmienečne imortalizované bunky myšacej podocytovej bunkovej línie (MPC5), získané od profesora Petra Mundela (Mount Sinai School of Medicine, USA), sa udržiavali pri teplote 33 stupňov kvôli proliferácii a potom sa posunuli na 37 stupňov kvôli diferenciácii. Expresný plazmid Te TRPC6 sa skonštruoval klonovaním celej dĺžky kódujúcej sekvencie DNA génu TRPC6 do miest EcoRI/BamHI vektora pCDH-GFP-PURO a zbalil sa do lentivírusu. Po diferenciácii a pestovaní do približne 80-percentnej konfluencie sa podocyty vysiali pri hustote buniek 4 x 104 na cm2 a inkubovali sa v kombinácii s lentivírusom nadmerne exprimujúcim TRPC{11}}. Na ďalšie experimenty sa použila stabilná bunková línia TRPC6 overená pomocou expresie proteínu TRPC6 a mRNA. Podocyty Tus, MPC5 boli rozdelené do troch skupín, do skupiny s normálnou kontrolou (NC), skupiny s prázdnym lentivírusom (Lv-NC) a skupiny s nadmernou expresiou TRPC{16}} (OverTRP).

In vitro bunková medikamentózna liečba a test cytotoxicity

Životaschopnosť buniek bola stanovená pomocou testu Cell Counting kit{{0}} (CCK-8) podľa pokynov výrobcu. Celkovo 5000 MPC5 podocytov na jamku bolo pestovaných v troch opakovaniach na 96-jamkových doštičkách. Bunky boli ošetrené sériou CsA (0–2 μmol/l; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) a tetrandrínom (0–40 μmol/l; Sigma Aldrich) pri 37 stupňoch počas 48 hodín. CCK-8 sa potom pridal do platní (10 μl/jamka), ktoré sa potom inkubovali v tme počas 2 hodín. Absorbancia pri 450 nm sa merala pomocou čítačky mikrodoštičiek (BioTek Instruments, USA). Cytotoxicita sa testovala kvantifikáciou uvoľňovania laktátdehydrogenázy (LDH) pomocou súpravy Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST (Dojindo Laboratories, Japonsko). Ako pozitívna kontrola boli bunky ošetrené 10 μmol/LU73122 (Cal biochem, USA) pri 37 stupňoch počas 10 minút.

Extrakcia RNA a kvantitatívna reverzná transkriptáza-polymerázová reťazová reakcia (qRT-PCR)

Celková RNA bola pripravená z kultivovaných buniek aobličkytkanivách s použitím činidla RNAiso Plus (Takara, Japonsko) a reverzne prepísané do cDNA PrimeScript™ RT Master Mix kit (Takara) podľa protokolu výrobcu. qRT-PCR sa uskutočnilo s použitím Power SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Nemecko). Sekvencie primérov cieľových a referenčných génov sú uvedené v doplnkovej tabuľke S1. Údaje boli zhromaždené pomocou systému ABI Prism 7900HT FAST Real-Time PCR. Relatívna kvantifikácia expresie cieľového génu bola normalizovaná pomocou porovnávacej metódy 2-ΔACt. Glyceraldehyd 3-fosfátdehydrogenáza (GAPDH) sa použila ako vnútorná kontrola.

Western blotting

vzorky celkového proteínu boli extrahované z kultivovaných buniek aobličkytkanív. Koncentrácie proteínov sa stanovili pomocou súpravy na testovanie proteínov BCA (Thermo Fisher Scientific). Vzorky boli oddelené na 10 percentnom dodecylsulfátovo-polyakrylamidovom géli a prenesené na polyvinylidéndifluoridovú membránu. Membrána bola potom cez noc blokovaná pri 4 stupňoch primárnymi protilátkami, menovite anti-TRPC6 (Santa Cruz, USA), anti-cal pain-1 (Abcam, UK), anti-Talin-1 (Abcam) , anti-nefrín (Santa Cruz) a anti-kalcineurín (Abcam). Po premytí bola membrána inkubovaná s kozím antikráličím IgG (H plus L; Jackson ImmunoResearch Laboratories, USA). Membrána bola tiež spracovaná na detekciu GAPDH (Abcam) pre rovnaké zaťaženie. Pásy Te rozpoznávané primárnou protilátkou sa vizualizovali a optické hustoty proteínových pásov sa analyzovali pomocou softvéru TanonImage (Tanon, Čína).

Stanovenie cytosolického Ca2 plus v kultivovaných podocytoch Podocyty MPC5 boli naočkované a ošetrené tetrandrínom, CsA a U73122 počas 48 hodín, 48 hodín a 10 minút. Podocyty sa potom inkubovali s RPMI-1640 doplneným 10 μM Fluo{8}}AM (Dojindo Laboratories) počas 30 minút v tme. Potom sa ihneď premyli fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom, v ktorom sa udržiavali a excitovali pri 488 nm. Relatívna koncentrácia cytosolického Ca2 plus iónu bola hodnotená meraním intenzity fluorescencie pomocou laserového konfokálneho zobrazovacieho systému Zeiss (Zeiss, USA).

Meranie aktivity calpainu

Aktivita calpainu bola stanovená pomocou súpravy Calpain Activity Assay Kit od Abcam Inc. podľa protokolu výrobcu. Supernatant (150 ul) podocytov respobličkytkanivá sa odobrali do vhodného tlmivého roztoku (145 mmol/l Nacl, 100 mmol/l Tris-HCL, pH 7,3) a 0,15 ml-sukcinyl-Leu-Tyr-AMC (500 umol/l). Po 1-hodinovej inkubácii pri 37 stupňoch v tme boli vzorky odčítané pomocou fluorometra vybaveného 360 nm excitačným filtrom a 440 nm emisným filtrom.

Model potkanov adriamycínom indukovanej nefropatie (ADRN) Na základe Fermiho aproximácie veľkosti vzorky [19] a rozdielu proteinúrie medzi kontrolnou a modelovou skupinou v našich predbežných experimentoch bol stanovený celkový počet potkanov požadovaných v našej štúdii. Celkovo 56 zdravých samcov potkanov Sprague–Dawley s hmotnosťou približne 200 g a vo veku približne 8 týždňov (Inštitút Zhejiang TCM) bolo náhodne rozdelených do siedmich skupín (n =8 potkanov/skupina), konkrétne do skupiny ADR, ADR plus skupina s nízkou dávkou tetrandrínu (4 mg/kg/deň), skupina ADR plus tetrandrín so strednou dávkou (8 mg/kg/d), skupina ADR plus tetrandrín s vysokou dávkou (16 mg/kg/d), skupina liečená ADR plus CsA (30 mg /kg/d), ADR plus stredná dávka tetrandrínu (8 mg/kg/d) v kombinácii so skupinou CsA (30 mg/kg/d) a skupinou NC. Potkany v modelovej skupine a skupinách liečených liekom boli anestetizované intraperitoneálnou injekciou hydrochloridu ketamínu (50 mg/kg) a dve dávky ADR (4 mg/kg) boli injikované do kaudálnej žily, aby sa vyvinul model potkana FSGS. Po 12 týždňoch sa pomocou metabolických klietok odoberali vzorky moču potkanov počas 24 hodín, potom nasledoval odber krvi a zber krvi.obličky. Pozorovala sa klinická účinnosť a zmeny hladín 24-h proteínu v moči, plazmatického albumínu, sérového kreatinínu (Scr) a dusíka v krvi v moči (BUN) sa merali pomocou komerčne dostupných diagnostických súprav s automatickým chemickým analyzátorom (HITACHI 7180 ).

Všetky experimentálne postupy zahŕňajúce použitie zvierat boli schválené Etickou komisiou pre pokusy na zvieratách v Zhejiang Institute of TCM (Tianmushan Road č. 132) a boli prísne vykonávané podľa zásad uvedených v príručke NIH pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat. .

Histologické farbenie, elektrónová mikroskopia a analýza

Potkanobličkyboli fixované v paraformaldehyde, dehydratované s použitím odstupňovanej série etanolu a zaliate do parafínu. Rezy (hrubé 5- μm) boli zafarbené hematoxylínom a eozínom (H&E) a Massonovým trichrómom a skúmané pod optickým mikroskopom. Obličky boli perfundované a fixované glutaraldehydom a potom narezané na 1-mm3 tkanivové bloky na zaliatie epoxidom. Elektrónová mikroskopia sa uskutočnila pomocou štandardných postupov. Z každej vzorky sa náhodne získalo päť ultramikrografií. Rýchlosť fúzie výbežkov na nohách podocytov (PFR) sa vypočítala pomocou nasledujúceho vzorca: PFR ( percentá )=∑LFP / ∑LBM×100 percent , kde ∑LFP je celková dĺžka zrasteného výbežku nohy a ∑LBM je celková dĺžka periférnej kapilárnej bazálnej membrány (BM).

Štatistická analýza

Údaje sú vyjadrené ako priemer ± štandardná chyba merania a analyzované pomocou SPSS 20.0 (IBM Statistics SPSS, USA) a GraphPad Prism 6 pre Windows (GraphPad Software Inc., USA). Normálna distribúcia bola hodnotená pomocou qq grafov a SW testu. Dáta ukázali normálne rozdelenie. Keď sa porovnávali dve skupiny údajov, použil sa t-test nezávislých vzoriek. Rozdiely medzi tromi alebo viacerými nezávislými skupinami sa porovnávali pomocou jednosmernej analýzy rozptylu, po ktorej nasledoval Tukeyho post hoc test. Štatistická významnosť bola stanovená na str<>

Výsledky

Výber optimálnych koncentrácií a cytotoxicity tetrandrínu, CsA a U73122

Na detekciu životaschopnosti buniek sa použil test CCK{{0}}. Ako je znázornené na obr. 1a a b, maximálna koncentrácia 10μmol/l tetrandrínu a 0,1μmol/l CsA neovplyvnila životaschopnosť podocytov MPC5. Test uvoľňovania LDH ďalej potvrdil, že 10 μmol/l tetrandrín a 0,1 μmol/l CsA počas 48 hodín nevykazovali žiadnu toxicitu, zatiaľ čo 10 μmol/LU73122 počas 10 minút vykazovalo očakávanú toxicitu (obr. 1c). Preto nasledujúce bunkové experimenty využívali tetrandrín a CsA pri 10 μmol / l a 0, 1 μmol / l.

Tetrandrín znížil intracelulárny Ca2 plus infux v kultivovaných MPC5 bunkách nadmerne exprimujúcich TRPC6

Pomocou plazmidovej transfekcie sa úspešne vytvoril bunkový model nadmernej expresie TRPC6 v podocytoch MPC5. qRT-PCR a analýza western blot preukázali, že hladiny expresie TRPC6 v skupine Over-TRP sa významne zvýšili v porovnaní s hladinami v skupinách NC a Lv-NC (p<0.05; fig.="" 2a="" and="" b).="" and="" full-length="" gel="" and="" blot="" of="" trpc6="" were="" included="" in="" supplementary="" fig.="">

Fluorescenčné zobrazovanie (obr. 2c) a semikvantitatívna analýza (obr. 2d) ukázali, že nadmerná expresia TRPC6 zvyšuje intracelulárny prítok Ca2 plus, zatiaľ čo medzi skupinami NC a Lv-NC neboli žiadne zjavné rozdiely. Desať buniek skupiny OverTRP sa potom ošetrilo experimentálnymi liekmi. Skupiny pred liečbou liekom (tetrandrín, CsA a U73122) mali inhibičné účinky na intracelulárny Ca2 plus influx (P<0.05), while="" there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" among="" the="" three="" groups="" of="">

Účinky tetrandrínu na aktivitu a expresiu kalpaínu-1, kalcineurínu, Talinu-1 a nefrínu v bunkách MPC5

Ukázalo sa, že intracelulárny Ca2 plus aktivuje kalpaín, cysteínovú proteázu závislú od Ca2 plus, a kalcineurín, proteín fosfatázu závislú od Ca2 plus/kalmodulínu. V súlade s predchádzajúcimi pozorovaniami boli hladiny aktivity a expresie calpaínu a kalcineurínu v skupine Over TRP vyššie ako v skupinách NC a Lv-NC (p<0.05; fig.="" 3a-e,="" h="" and="" i).="" drop="" intervention="" in="" cultured="" trpc6-overexpressing="" podocytes="" established="" that="" tetrandrine="" inhibited="" calpain="" activity="" and="" calpain-1="" expression.="" te="" calpain="" activity="" and="" calpain-1="" mrna="" levels="" were="" significantly="" reduced="" in="" the="" tetrandrine-exposed="" group="" than="" in="" the="" csa="" intervention="" group=""><0.05; fig.="" 3a="" and="" d).="" western="" blotting="" results="" demonstrated="" a="" considerable="" decrease="" in="" calpain-1="" protein="" levels="" because="" of="" tetrandrine=""><0.05; fig.="" 3c="" and="" h).="" in="" addition,="" calcineurin="" activity="" was="" significantly="" reduced=""><0.05; fig.="" 3b)="" after="" tetrandrine="" exposure,="" but="" the="" mrna="" and="" protein="" expression="" levels="" of="" calcineurin="" remain="" unchanged="" (fig.="" 3e="" and="" i).="" treatment="" with="" csa="" did="" not="" block="" calpain="" activation="" (fig.="" 3a),="" and="" the="" effect="" was="" not="" as="" robust="" as="" that="" of="" tetrandrine="" in="" calpain-1="" mrna="" expression=""><0.05; fig.="" 3d).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 3b,="" e="" and="">

The podocyte cytoskeleton-associated anchoring protein Talin-1 and the slit diaphragm protein nephrin are two specific targets of calpain-1. When treated with tetrandrine, there was an increasing trend in mRNA and protein expression of Talin-1 (p >0.05) a nefrín (s<0.05), compared="" with="" that="" in="" the="" overtrp="" group,="" but="" this="" finding="" was="" not="" statistically="" significant="" among="" the="" three="" treatment="" groups="" (p="">0.05; Obr. 3f, g, j, a k).

Gély a bloty plnej dĺžky boli zahrnuté v doplnkovom obrázku S1.

Experimenty in vivo s použitím potkanieho modelu ADRN Aby sa charakterizovala odpoveď na tetrandrínom sprostredkovanú inhibíciu signalizácie TRPC6/calpain{2}} in vivo, bol vyvinutý model ADRN u potkanov. Profily expresie mRNA a proteínu TRPC6 boli významne zvýšené v skupine ADRN v porovnaní s profilmi u potkanov kŕmených normálnym jedlom (skupina NC; p<0.05; fig.="" 4a="" and="" b).="" consistent="" with="" the="" above="" studies="" in="" cell-based="" models,="" the="" activity="" and="" expression="" levels="" of="" calpain="" and="" calcineurin="" increased="" remarkably="" in="" the="" adrn="" group=""><0.05; fig.="" 4c-g,="" j,="" and="" k)="" than="" in="" the="" nc="">

Liečba CsA neblokovala aktiváciu calpainu indukovanú nadmernou expresiou TRPC6 (obr. 4c) a účinok nebol taký silný ako účinok tetrandrínu na expresiu proteínu cal pain-1 (p<0.05; fig.="" 4j).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 4d,="" g,="" and="" k).="" the="" tetrandrine="" group="" was="" down="" compared="" to="" the="" adr="" group="" (fig.="">

Liečba CsA neblokovala aktiváciu calpainu vyvolanú nadmernou expresiou TRPC6 (obr. 4c) a účinok nebol taký silný ako účinok tetrandrínu na expresiu proteínu calpain-1 (p<0.05; fig.="" 4j).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 4d,="" g,="" and="">

Ďalej sa hodnotila expresia Talinu-1 a nefrínu (obr. 4h, i, l a m). Hladiny Talinu-1 aj nefrínu boli znížené u ADRN potkanov v porovnaní s hladinami v skupine NC (p<0.05). upon="" treatment="" with="" tetrandrine,="" the="" mrna="" levels="" and="" protein="" expression="" of="" talin-1="" and="" nephrin="" were="" visibly="" increased.="" the="" high-dose="" group="" of="" tetrandrine="" recovered="" the="" expression="" of="" the="" two="" structural="" components,="" similar="" to="" the="" adr+csa="" group="" (p="">0.05).

Gély a bloty plnej dĺžky boli zahrnuté na doplnkovom obrázku S2.

Tetrandrín potlačil progresiu ADRN a zachránil histopatológiu Te efekt tetrandrínu naobličkyNásledne sa vyhodnotila funkcia u potkanov Sprague-Dawley liečených ADRN (obr. 5a-d). Medzi skupinami neboli žiadne počiatočné významné rozdiely v 24-h proteinúrii, hladinách Scr a BUN. O 12 týždňov neskôr boli hladiny 24-hodinovej proteinúrie, Scr a BUN v skupine ADRN štatisticky zvýšené, zatiaľ čo hladiny plazmatického albumínu boli výrazne znížené v porovnaní s hladinami v skupine NC (P<0.05). after="" treatment="" with="" tetrandrine,="" the="" levels="" of="" proteinuria,="" scr,="" and="" bun="" were="" markedly="" decreased,="" whereas="" the="" level="" of="" albumin="" was="" significantly="" improved="" compared="" to="" those="" in="" the="" adr="" group=""><0.05). among="" the="" three="" dose-response="" subgroups="" of="" tetrandrine,="" a="" significant="" difference="" was="" observed:="" the="" middle="" dose="" demonstrated="" considerably="" better="" efficacy="" than="" the="" other="" two="" doses=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" levels="" of="" serum="" alanine="" aminotransferase,="" before="" and="" after="" treatment="" among="" groups="" (p="">0.05; údaje nie sú zobrazené).

Zmeny v histomorfológii sú znázornené na obr. 6. U ADRN potkanov farbenie H&E a Masson ukázalo FSGS, tubulointersticiálnu fibrózu a infiltráciu obličkových intersticiálnych zápalových buniek. Okrem toho zobrazovanie glomerulov elektrónovou mikroskopiou odhalilo vysoko vymazané, vykrmované a fúzované procesy chodidiel podocytov s 80–100 percentami PFR podocytov. Potkany v podskupinách tetrandrínu (skupiny so strednou dávkou a skupinou s vysokou dávkou) vykazovali menej lézií ako skupina ADR s rôznym rozsahom a zlepšenie v skupine s vysokou dávkou prekonalo zlepšenie v skupine so strednou dávkou. V skupinách liečených nízkou, strednou a vysokou dávkou tetrandrínu boli PFR podocytov 70 – 80 percent, 50 – 60 percent a 30 – 40 percent, v uvedenom poradí. Tieto údaje naznačujú, že tetrandrín chránil pred štrukturálnym poškodením obličkových glomerulov vyvolaným podávaním ADR. Medzi skupinami neboli signifikantné rozdiely v patologických zmenách pod svetelným mikroskopom (vysokodávkovaný tetrandrín, CsA a tetrandrín v kombinácii s CsA). Okrem toho PFR podocytov v skupine ADRN liečenej CsA bola rovnaká ako v skupinách liečených vysokou dávkou tetrandrínu.

Diskusia

Podocyty sa stávajú čoraz dôležitejšími ako cieľ intervencií pri FSGS a súvisiacich nefrotických ochoreniach [20, 21]. Tu, na základe údajov in vitro a in vivo, to bolo

preukázali, že ochrana podocytov a antiproteinurický účinok tetrandrínu, neselektívneho blokátora Ca2 plus kanálov, boli sprostredkované inhibíciou intracelulárneho Ca2 plus influxu a Ca2 plus závislej calpain-1 signalizačnej kaskády, vrátane Talinu-1 nefrín a kalcineurín. Tetrandrín bol účinnejší ako pri bránení inhibícii kalpaínu-1.

Podľa doterajších zistení je podocyt TRPC6 kanálom, ktorý sa podieľa hlavne na zmenách Ca2 plus influxu za normálnych a patologických podmienok [7, 22]. Je všeobecne známe, že aktivita kalpaínu závisí od hladín vápnika a je spojená sobličkypoškodenie, najmä renálne antiglomerulárne poškodenie BM [10, 23]. Spomedzi 15 identifikovaných izoforiem kalpaínu sa nedávno ukázalo, že kalpaín-1 spája aktivitu TRPC6 s poškodením podocytov [24]. Uvádza sa, že kalpaín-1 štiepi kotviaci proteín Talin-1 spojený s cytoskeletom podocytov a proteín štrbinovej bránice, nefrín, ktorý narúša integritu podocytov a vyvoláva závažnú proteinúriu [8–12, 16]. Kalcineurín je fosfatáza závislá od Ca2 plus, o ktorej sa predtým preukázalo, že hrá úlohu v podocytoch aobličkyfunkciu. Hromadiace dôkazy čoraz viac naznačujú, že kalpaín môže štiepiť a aktivovať kalcineurín proteolytickým spôsobom [25, 26]. Táto štúdia vytvorila modely nadmernej expresie TRPC6 vírusovou infekciou v kultivovaných podocytoch a injekciou adriamycínu u SD potkanov. V súlade s tým sme ukázali, že TRPC6-sprostredkovaný prítok Ca2 plus aktivoval aktivitu calpainu a expresiu calpainu-1 člena rodiny calpainu. Zvýšený kalpaín-1 následne štiepil dolný Talin-1 a nefrín.

Tetrandrín je alkaloid extrahovaný z tradičnej čínskej liečivej rastliny a je to neselektívny blokátor Ca2 plus kanálov. V tomto dokumente bolo opätovne potvrdené, že tetrandrín inhiboval nadmernú expresiu TRPC6 a znižoval prítok Ca2 plus v bunkách aj u potkanov nadmerne exprimujúcich TRPC6, ako bolo zdokumentované skôr [16]. Ešte dôležitejšie je, že táto štúdia sa zameriava na intervenčný účinok tetrandrínu na od vápnika závislú downstream signálnu dráhu. Pozorovalo sa, že na rozdiel od CsA tetrandrín znižoval aktivitu neutrálnej proteázy (calpaínu) aktivovanej vápnikom. Okrem toho tetrandrín znížil expresiu rodiny proteáz aktivovaných vápnikom, calpain{9}}, a obnovil zníženú expresiu Talinu-1 a nefrínu. V porovnaní s CsA podávanie tetrandrínu vykazovalo lepšie účinky na inaktiváciu calpainu a zníženú expresiu calpainu-1. Tieto výsledky ukázali, že tetrandrín má terapeutický potenciál pri poškodení podocytov tým, že blokuje od TRPC6-závislú aktiváciu calpain{13}} signálnej dráhy.

Fosfolipáza C (PLC) bola identifikovaná ako TRPC6-väzbový partner [27]. U73122 inhibuje PLC, takže sa vytvára menej diacylglycerolu a znižuje sa otvorenie kanála TRPC6 [18, 24]. U73122 sa teda použil paralelne ako pozitívna kontrola a preukázal znateľný účinok pri znižovaní intracelulárneho Ca2 plus prítoku, inhibícii aktivity calpainu a expresie calpainu v podocytoch nadmerne exprimujúcich TRPC6. In vitro testy cytotoxicity však ukázali zjavnú toxicitu podocytov.

V tejto štúdii bola po 12 týždňoch injekcie ADR u potkanov liečených ADR-- evidentná závažná proteinúria, hypoalbuminémia a zvýšené hladiny BUN a Scr. Svetelná mikroskopia odhalila FSGS, tubulointersticiálnu fibrózu a infiltráciu obličkových intersticiálnych zápalových buniek u ADRN potkanov. Elektrónová mikroskopia preukázala rozsiahle vymazanie procesov chodidiel. Údaje in vivo ďalej ukázali, že terapia tetrandrínom môže znížiť proteinúriu, zlepšiť funkciu obličiek a zmierniť progresiu glomerulosklerózy. Po liečbe tetrandrínom sa patologické zmeny pod svetelným mikroskopom a elektrónovým mikroskopom, 24-h proteinúria, plazmatický albumín, Scr a BUN u ADRN potkanov významne zlepšili v porovnaní so zmenami v skupine NC.

Inhibítor kalcineurínu, CsA, sa už dlho používa na liečbu proteinurieobličkychoroby [28]. Kalcineurín je klinicky dôležitý ako priamy cieľ imunosupresíva CsA [17, 29]. CSA znižuje expresiu kalcineurínu a znižuje kalcineurínom sprostredkovaný jadrový faktor aktivovaných T-buniek [30–32]. Nedávne dôkazy podporujú stabilizačný účinok CsA na aktínový cytoskelet podocytov, ako je synaptopodín, blokovaním kalcineurínom sprostredkovanej defosforylácie synaptopodínu [17]. Bolo tiež preukázané, že kalpaín môže štiepiť a aktivovať kalcineurín proteolytickým spôsobom [25, 26]. Údaje z tejto štúdie opätovne potvrdili, že CsA inhiboval aktivitu a expresiu kalcineurínu silnejšie ako tetrandrín. Ako už bolo uvedené, zdá sa, že CsA priamo neovplyvňuje aktivitu calpaínu.

Hlavným obmedzením štúdie bolo nepreukázanie dávkovo závislého účinku medzi tetrandrínovými podskupinami (skupiny s nízkou dávkou, strednou dávkou a vysokou dávkou). Jedným z možných vysvetlení by mohlo byť, že rozsah dávok, ktorý sme použili, bol pre potkany príliš vysoký. Okrem toho môžu byť individuálne rozdiely v pokuse na zvieratách podstatne väčšie ako rozdiely v dávke. Relatívne malá veľkosť vzorky môže znížiť štatistickú silu. Preto sú potrebné ďalšie štúdie zahŕňajúce podstatne menšie dávky a vhodnú veľkosť vzorky na zistenie presného rozsahu dávok a účinku tetrandrínu u potkanov ARDN.

Stručne povedané, pri regulácii vápnikových signálnych dráh tetrandrín vykazoval zjavný inhibičný účinok na kalpaín-1, zatiaľ čo CsA priamo ovplyvňoval inhibíciu kalcineurínu. Tieto zistenia naznačujú, že kombinovaná liečba tetrandrínom a CsA môže ovplyvniť viaceré ciele vápnikovej signalizačnej siete, aby sa zlepšili klinické výsledky. Na potvrdenie týchto pozorovaní, ako aj na objasnenie mechanizmov synergických účinkov sú potrebné potvrdzujúce štúdie.

Skratky

FSGS: fokálna segmentálna glomerulárna skleróza; MCD: Choroba s minimálnymi zmenami; MN: Membranózna nefropatia; DKD: Diabetikobličkychoroba; TRPC6: katiónový kanálový proteín 6 prechodného receptorového potenciálu; Ca2 plus : vápnik; TČM: Klasická tradičná čínska medicína; Tet: tetrandrín; CsA: cyklosporín A; Scr: sérový kreatinín; BUN: dusík z krvi moču; PFR: Rýchlosť fúzie procesov; BM: Bazálna membrána; ADRN: Adriamycínom indukovaná nefropatia; PLC: Fosfolipáza C.

Rozhodcances

1. Garg P. Prehľad biológie podocytov. Am J Nephrol. 2018;47(Suppl 1):3–13.

2. Khalilpourfarshbaf M, Hajiaghaalipour F, Selvarajan KK a kol. Terapie založené na mezenchymálnych kmeňových bunkách proti poškodeniu podocytov pri diabetickej nefropatii. Tissue Eng Regen Med. 2017;14:201–10.

3. Nagata M. Poranenie podocytov a jeho následky. Kidney Int. 2016;89:1221–30.

4. Pavenstädt H, Kriz W, Kretzler M. Bunková biológia glomerulárneho podocytu. Physiol Rev. 2003;83:253–307.

5. Riehle M, Büscher AK, Gohlke BO, a kol. Mutácia straty funkcie TRPC6 G757D sa spája s FSGS. J Am Soc Nephrol. 2016;27:2771–83.

6. Ilatovskaya DV, Blass G, Palygin O, a kol. Dráha NOX4 / TRPC6 v regulácii vápnika v podocytoch a poškodení obličiek pri diabetickej chorobe obličiek. J Am Soc Nephrol. 2018;29:1917–27.

7. Reiser J, Polu KR, Möller CC, a kol. TRPC6 je kanál spojený s glomerulárnou štrbinou bránice potrebný pre normálnu funkciu obličiek. Nat Genet. 2005;37:739–44.

8. Huang H, You Y, Lin X a kol. Inhibícia signálnej dráhy TRPC6 zmierňuje poškodenie podocytov vyvolané TGF- 1. Cell Physiol Biochem. 2017;41:163–72.

9. Verheijden KAT, Sonneveld R, Bakker-van Bebber M, et al. Na vápniku závislá proteáza Calpain-1 spája aktivitu TRPC6 s poškodením podocytov. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2099–109.

10. Peltier J, Bellocq A, Perez J, a kol. Aktivácia a sekrécia calpaínu podporujú poškodenie glomerulov pri experimentálnej glomerulonefritíde: dôkaz z calpastatín-transgénnych myší. J Am Soc Nephrol. 2006;17:3415–23.

11. Tian X, Kim JJ, Monkley SM a kol. Talin1 spojený s podocytmi je rozhodujúci pre udržiavanie bariéry glomerulárnej filtrácie. J Clin Investig. 2014;124:1098–113.

12. Jiang L, Ding J, Tsai H a kol. Nadmerná expresia katiónového kanála 6 s prechodným receptorovým potenciálom v podocytoch indukuje preskupenie cytoskeletu prostredníctvom zvýšenia intracelulárnej aktivácie Ca2 plus a RhoA. Exp Biol Med (Maywood). 2011;236:184–93.

13. Liu X, Zhou QG, Zhu XC a kol. Skríning potenciálnych aktívnych zložiek Fangji Huangqi tang pri liečbe nefrotického syndrómu pomocou integrovanej metabolomiky založenej na „koreláciách medzi chemickými a metabolickými profilmi“. Front Pharmacol. 2019;10:1261.

14. Liu KC, Lin YJ, Hsiao YT, a kol. Tetrandrín indukuje apoptózu v bunkách ľudského nazofaryngeálneho karcinómu NPC-TW 039 stresom endoplazmatického retikula a dráhami Ca2 plus/Calpain. Anticancer Res. 2017;37:6107–18.

15. Wang YJ, He LQ, Sun W, a kol. Optimalizovaný projekt tradičnej čínskej medicíny pri liečbe chronického ochorenia obličiek 3. štádia: multicentrická dvojito zaslepená randomizovaná kontrolovaná štúdia. J Ethnopharmacol. 2012;139:757–64.

16. Yu J, Zhu C, Yin J, a kol. Tetrandrín potláča prechodný receptorový potenciál nadmernou expresiou proteínu 6 katiónového kanála vyvolaného poškodenia podocytov prostredníctvom blokovania signalizácie RhoA/ROCK1. Drug Des Devel Ther. 2020;14:361–70.