Ako proteíny na opravu bunkovej membrány regulujú transdukciu signálu transkripčného faktora na kontrolu renálnej fibrózy

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Haichang Li

Obličkyfibróza je spojená s progresiou akútobličkyporanenie pri chronickom ochorení obličiek. Ukázalo sa, že MG53, proteín na opravu bunkovej membrány, chráni pred poškodením obličkových epiteliálnych buniek a akútnym poškodením obličiek. Tu sme vyhodnotili úlohu MG53 pri moduláciiobličkyfibróza u starnúcich myší a u myší s jednostrannou ureterálnou obštrukciou (UUO), známym modelom progresívnej fibrózy obličiek. U myší s abláciou MG53 sa s vekom vyvinula väčšia intersticiálna fibróza ako u MG53-intaktných myší rovnakého veku. Podobne v neprítomnosti MG53,obličkyfibróza bola prehnaná v porovnaní s myšami s intaktným MG53 v nepriechodnej obličke v porovnaní s kontralaterálnou neobštrukciou obličky alebo obličkami falošne operovaných myší. Ureterál je upchatýobličkyz myší s deficitom MG53 tiež vykazovali významne väčší zápal ako ureterálne obštrukcie obličiek z intaktných myší. Experimenty in vitro ukázali, že MG53 môže vstúpiť do jadier proximálnych tubulárnych epiteliálnych buniek a priamo interagovať so zložkou p65 transkripčného faktora NF-kB, čo poskytuje možné vysvetlenie zvýšeného zápalu v neprítomnosti MG53. Aby sa to otestovalo, myšiam vystaveným UUO sa podala zvýšená expresia MG53 prostredníctvom upravených buniek alebo priameho dodania rekombinantného proteínu. To znížilo aktiváciu a zápal NF-kB a oslabilo fibrózu obličiek. MG53 teda môže mať terapeutickú úlohu pri liečbe chronického zápalu obličiek, a tým poskytnúť ochranu protifibrózačo vedie k fenotypu chronického ochorenia obličiek.

Cistanche tubulosa zabraňuje ochoreniu obličiek, kliknite sem a získajte vzorku

Translačné vyhlásenie Chronický zápal vedie k fibrotickej remodelácii, ktorá môže byť tiež základom prechodu z akútneho poškodenia obličiek na chronické ochorenie obličiek. Aktivácia proteín-zápalového transkripčného faktora nukleárny faktor-kB (NF-kB) sa podieľa na patogenéze zápalu obličiek. Tu uvádzame dôkaz, že MG53, predtým identifikovaný proteín na opravu bunkovej membrány, priamo interaguje s NF-kB a znižuje jeho transkripčnú aktivitu. Súbežne môže exogénne podaný MG53 znížiť fibrotickú remodeláciu zapálenej obličky. Tieto zistenia poukazujú na ochrannú súhru medzi MG53 a NF-kB na zmiernenie vývoja fibrózy obličiek sprostredkovanej zápalom. Farmakologické podávanie MG53 môže byť sľubným prístupom na liečbu progresívnej fibrózy obličiek.

Dysfunkcia obličiek, ktorú možno klasifikovať ako akútne poškodenie obličiek (AKI) alebo chronické ochorenie obličiek (CKD), prerástla u staršej populácie do epidémie. V roku 2017 prevalencia CKD dosiahla 14,5 percenta ľudí vo veku 65 rokov a viac, čo viedlo k výdavkom Medicare na liečbu vo výške viac ako 84 miliárd dolárov.^1,2AKI a CKD sú bežnejšie u starších jedincov, hlavne kvôli zvýšenej náchylnosti na zranenia a zníženej schopnosti opraviť starnúce obličky. Klinické štúdie ukázali, že CKD je hlavným rizikovým faktorom pre AKI, a naopak, epizódy AKI môžu urýchliť progresiu CKD do konečného štádia ochorenia obličiek. V súčasnosti je liečba AKI prevažne podporná a liečba potvrdeného CKD je zameraná na spomalenie progresie prostredníctvom inhibície systému renín-angiotenzín-aldosterón a teraz možno prostredníctvom inhibície kotransportéra sodíka a glukózy-2.^3,4

V závislosti od závažnosti poranenia môžu proximálne tubulárne bunky, hlavný cieľ akútneho poranenia, podliehať zmenám v progresii bunkového cyklu,5,6 metabolizme,7 sekrécii proteín-zápalových a profibrotických cytokínov alebo čiastočnému epitelovo-mezenchymálnemu prechodu,8 čo určí, či prestavba/oprava bude úspešná alebo maladaptívna a povedie k fibróze obličiek, ktorá je charakteristickým znakom CKD.9,10 Táto prestavba sa zvyčajne vyskytuje na pozadí zápalu obličiek,

znížené vaskulárne zásobenie a produkcia proteínov extracelulárnej matrice (ECM) a zahŕňa stratu epitelových buniek a akumuláciu kolagénov, a-aktínu hladkého svalstva a fibronektínu; má tiež vysokú koreláciu so zhoršením funkcie obličiek.

Chronický zápal vedie k fibrotickej remodelácii, ktorá môže byť tiež základom prechodu z AKI na CKD.11–13 Kumulatívny výskum naznačuje účasť transkripčného faktora nukleárneho faktora-kB (NF-kB) v patogenéze zápalu obličiek spôsobeného infekciou, poranením, alebo transplantáciou.11,12,14 Aktivácia kanonickej NF-kB dráhy začína aktiváciou inhibítora NF-kB (IkB) kinázy, čo vedie k fosforylácii a degradácii IkBa a jadrovej translokácii NF-kB heterodimérov.15 Aktivácia signalizácie NF-kB v obličkových epiteliálnych bunkách a infiltrujúcich imunitných bunkách môže byť vyvolaná patofyziologickými spúšťačmi, ako je expozícia lipopolysacharidom (LPS) alebo ischemicko-reperfúzne poškodenie.16 Štúdie molekulárneho profilovania odhaľujú nfkb1 ako hlavnú hnaciu silu obličkovej fibrózy.¹⁷Okrem tubulárnych buniek obličiek prispievajú k poškodeniu obličiek, zápalu a fibrotickej remodelácii aj vrodené imunitné bunky, ako sú makrofágy a dendritické bunky.^13,18–20

cistanche je účinný pri liečbe dysfunkcie obličiek

Rastúce dôkazy naznačujú, že sekrečné faktory odvodené od svalov (tj myokíny) modulujú systémovú fyziológiu cez presluchy tkaniva, aby ovplyvnili progresiu ochorení obličiek.²¹MG53 (tiež nazývaný TRIM72) je proteín s tripartitným motívom obohatený o svaly (TRIM) s kritickou funkciou pri oprave bunkovej membrány.22,23 Proteíny rodiny TRIM majú rôzne funkcie od regulácie imunitnej signalizácie po opravu tkaniva.²⁴MG53-sprostredkovaná oprava membrány sa podieľa na zmierňovaní akútneho poškodenia kostrového svalstva,²⁵obličky,²⁶Srdce,²⁷ pľúca, 28 mozgy,^29,30a kožu.³¹Naše predchádzajúce štúdie identifikovali nízku hladinu expresie MG53 v obličkách, ktorá je kľúčovou zložkou ochrany AKI, a myši s nedostatkom MG53 (mg53 / ) boli náchylnejšie na stresom indukovanú AKI.²⁶Nedávno sme tiež preukázali, že trvalé zvýšenie MG53 v obehu zvyšuje opravu a regeneráciu poranenia tkaniva.32 Relatívne úlohy obličkovo špecifického a vonkajšieho cirkulujúceho MG53 pri modulácii fibrózy obličiek počas progresívneho CKD sú stále neznáme.

Nedávno sa vyvinula nová úloha MG53 pri modulácii ochrany tkaniva prostredníctvom inhibície zápalu, najmä prostredníctvom modulácie signalizácie NF-kB. Napríklad MG53 tlmí LPS-indukovanú neurotoxicitu a neurozápal inhibíciou dráhy TLR4/NF-kB33 a srdcový MG53 reguluje expresiu KChIP2 na kontrolu elektrofyziologickej prestavby počas kardiohypertrofie.34 Okrem toho sme preukázali dvojitú funkciu MG53 v predchádzanie maladaptívnej hyperzápalovej odpovedi počas subletálnej infekcie vírusom chrípky A, charakterizovanej nadmernou produkciou interferónu-b, prostredníctvom supresie aktivácie IRF3/NF-kB a inhibície aberantnej intracelulárnej Ca2+ signalizácie v makrofágoch.35 Okrem toho po letálnej dávke chrípky A vírusovej infekcii, ukázalo sa, že MG53 zabraňuje úmrtnosti a poškodeniu pľúc nie priamym ovplyvnením vírusových titrov per se, ale zmierňovaním búrky cytokínov (interferón-b, interleukín-6 a interleukín{20}}b) prostredníctvom negatívnej regulácie zápalu NLRP3 a prevenciu pyroptózy pľúc.36 Okrem toho bola chronická liečba vysokými dávkami exogénneho MG53 spojená so supresiou NF-kB – sprostredkovaný zápal v staršom srdci.37 Tieto štúdie naznačujú, že MG53 môže modulovať aberantnú signalizáciu NF-kB počas zápalu, ale či k tomu dochádza v kontexte zápalu obličiek, nebolo skúmané.

Predpokladali sme, že MG53 reguluje zápal obličiek moduláciou transkripčnej aktivity NF-kB, a tým môže zmierniť fibrózu obličiek, ku ktorej dochádza v dôsledku chronického zápalu. Táto štúdia bola vykonaná s cieľom vyriešiť túto hypotézu.

cistanche je účinný pri liečbe ochorení obličiek

METÓDY

Štúdie na zvieratách

Všetky experimenty so zvieratami sa držali príručky National Institute of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals a dodržiavali protokoly schválené Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť o zvieratá a používanie zvierat na Ohio State University. Divoký typ zodpovedajúceho veku (WT) alebo mg53^-/-na stanovenie úlohy MG53 v modulácii vekom závislej a jednostrannej ureterickej obštrukcie (UUO) indukovanej fibrózy obličiek boli použité22 súrodenci kmeňa 129S1/SvImJ. Myši C57B6/J (9–10 týždňov) boli zakúpené od Jackson Labs.

Pri štúdiách poškodenia obličiek sa myši (9–12 týždňov) podrobili UUO na vyvolanie fibrózy obličiek. Myši boli anestetizované izofluránom (1,5 percenta – 2.0 percent ), aby sa zabezpečila hlboká rovina anestézie. Procedúra UUO sa uskutočnila podviazaním ľavého močovodu 5-0 chirurgickým hodvábom dvakrát podľa publikovaných protokolov.38 Falošné myši mali iba brušný kožný rez. Aby sa vyhodnotil účinok rhMG53 na obštrukčné poškodenie obličiek, 1 skupina myší UUO dostávala rhMG53 (2 mg/kg) injekciou do chvostovej žily so začiatkom bezprostredne po operácii UUO (deň 0) a potom denne počas 7 dní, pričom 2 ďalšie dávky v dňoch 9 a 11. Kontrolná skupina UUO myší dostala injekcie fyziologického roztoku podľa rovnakého plánu. Myši boli usmrtené v deň 12 po operácii UUO, obličky boli perfundované in situ fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom a vzorky tkaniva z obličky UUO a kontralaterálnej obličky boli odobraté na histológiu a analýzu Western blot.

V samostatných štúdiách WT a mg53^-/-myši podstúpili UUO alebo simulovanú operáciu a boli usmrtené v deň 7 po operácii. MG53 sa podával myšiam pomocou prístupu bunkovej terapie.39 Makrofágy RAW 264.7 boli infikované vírusovými časticami Ad tPA-MG53- čerešňových vírusov závislých od doxycyklínu (DOX) počas 24 hodín. Infikované bunky (v koncentrácii {{1{12}}}}/100 ml fyziologického roztoku na myš) boli myšiam injikované do chvostovej žily bezprostredne po chirurgickom zákroku (injekcia v deň 0). Myši dostali 4 injekcie buniek RAW transdukovaných Ad-tPA-MG53 v dňoch 0, 1, 3 a 6. Ihneď po injekcii buniek v deň 0 boli myši náhodne rozdelené do skupiny, ktorá dostala a skupiny, ktorá nedostala DOX (2 mg/ml v 5-percentnom roztoku sacharózy) v pitnej vode počas 7 dní a potom boli usmrtené. Vzorky tkaniva z obličky UUO a kontralaterálnej obličky sa odobrali na histológiu, analýzu RNA a proteínov.

Štatistické analýzy Údaje sú vyjadrené ako priemer -SD. Porovnanie v rámci skupín bolo uskutočnené pomocou Studentovho t-testu pri porovnaní 2 experimentálnych základných výskumov H Li a kol.: MG53 moduluje NF-kB pri fibróze obličiek 2 Kidney International (2021) -, --- skupiny a 1-analýza rozptylu pre viac ako 2 skupiny (Graphpad Prism 8.2; GraphPad), po ktorej nasledoval buď Bonferroniho alebo Holm-Sidak viacnásobný porovnávací test ad hoc. Hodnota P < 0,05="" sa="" považovala="" za="" štatisticky="">

Doplnkové metódy Kompletné metódy vrátane histologického hodnotenia, merania sérového kreatinínu, plazmidových konštruktov, bunkovej kultúry a izolácie primárnych tubulárnych epitelových buniek, prípravy adenovírusu a bunkovej infekcie, testu jadrovej translokácie NF kB p65, imunohistochémie a konfokálnych snímok, reportérového testu NF-kB luciferázy, cytokínu enzýmový imunosorbentový test, frakcionácia tkaniva, imunoblotovanie, koimunoprecipitácia, kvantitatívna polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase (doplnková tabuľka S1) a produkcia rhMG53 sú v doplnkových metódach.

extrakt z cistanche tubulosa: liečba ochorenia obličiek

VÝSLEDKY

U myší s abláciou MG53 sa vyvinula fibróza obličiek závislá od veku

Porovnali sme vplyv starnutia na funkciu obličiek a fibrózu v mg53^-/-a WT myši. Potvrdili sme naše predchádzajúce pozorovanie, že hoci hladiny kreatinínu v sére mladých myší (2 mesiace) s MG53 a bez MG53 neboli významne odlišné, staršie (16–20 mesiacov) mg53-/-myši vykazovali významne vyšší sérový kreatinín ako kontroly WT zodpovedajúce veku (obrázok 1a). Na základe farbenia trichrómom sme zistili, že mg53-/-myši mali viac fibrózy obličiek v porovnaní s myšami WT, začínajúc vo veku 5 mesiacov a pokračovali vo veku 20 mesiacov (obrázok 1b a c). Imunohistochemické farbenie sa použilo na vyhodnotenie vplyvu ablácie MG53 na infiltráciu leukocytov, monocytov a makrofágov v obličkách myší vo veku 2- mesiaca a 5- mesiaca (obrázok 1d a e). Obličky mladých myší WT a mg{8}}/- mali podobné hladiny intrarenálnych leukocytov, ale významne viac zápalových buniek sa našlo v mg53 / obličkách ako v obličkách WT u 5-mesačných myší.

Okrem toho imunohistochémia aktínu hladkého svalstva a fibronektínu, 2 proteínov extracelulárnej matrice bežne sa vyskytujúcich v oblastiach fibrózy obličiek, ukázala zvýšené (3- až 8-násobne) sfarbenie v glomerulách a tubulointerstíciu obličiek z { {4}}mesačné mg53-/- myši v porovnaní s 10-mesačnými WT myšami (doplnkový obrázok S1).

UUO indukuje zhoršený zápal obličiek a fibrózu u mg53-/- myší Hladiny MG53 v obličkách zistené imunoblotovaním sa 7 dní po UUO významne zvýšili (obrázok 2a). Obličky mg53-/- UUO vykazovali prehnanú fibrózu s 30-percentnou dodatočnou plochou zafarbenou trichrómom ako obličky WT UUO (obrázok 2b).

MG53 moduluje aktiváciu NF-kB a jadrovú lokalizáciu p65

Aktivita NF-kB (p65) bola hodnotená v modeli UUO. Počet celkového p65 (t-p65) sa významne zvýšil v obličkách UUO od WT a mg53 / myši, ale aktivácia NF-kB, hodnotená ako fosforylácia p65, bola väčšia (16--krát) v mg53 / UUO obličky ako oblička WT UUO (2-násobok) v porovnaní so zvieratami s falošnou operáciou (obrázok 3a). Analyzovali sme relatívne hladiny RNA transformujúceho rastového faktora b1 (TGF-b1), inhibítora aktivátora plazminogénu-1 (PAI-1) a kolagénu typu I alfa 1 (Col1a1) v nepriechodnej obličke.40 detegovali nízke hladiny génovej expresie u simulovaných zvierat a podobnú indukciu (TGF-b1, w10-násobok; PAI-1, w40-násobok; Col1a1, w40-násobok) v obličkách UUO z WT a mg53/ (obrázok 3b). Na preskúmanie priestorovej distribúcie MG53 v kôre obličiek za normálnych podmienok sa analyzovali frakcie obličkového tkaniva. Pravidelne sme získavali 10-krát viac celkového cytosolového proteínu ako celkový extrahovaný jadrový proteín. Hladiny t-p65 boli porovnateľné v cytosolickej frakcii medzi WT a mg53-/- myší, ale boli vyššie v jadrovej frakcii mg53-/- myší (obrázok 3c). MG53 sa detegoval v cytosolovej frakcii (s tubulínom ako cytozolovým markerom). Neočakávane sa zistilo významné množstvo MG53 v jadrovej frakcii (s histónom H3 ako markerom jadrovej frakcie).

Na potvrdenie tohto zistenia sme tiež skúmali lokalizáciu MG53 vo frakciách kostrového svalstva (doplnkový obrázok S2). Reprodukovali sme naše predchádzajúce štúdie, v ktorých sa MG53 lokalizoval v cytosóle a sarkolemálnej membráne (adenozíntrifosfatáza sodno-draselná ako marker membránovej frakcie)22, 23, 25, ale tiež detegoval obohatený jadrový MG53 z kostrového svalstva.

MG53 interaguje s p65 na kontrolu transkripčnej aktivity indukovanej tumor nekrotizujúcim faktorom-a Na potvrdenie našich výsledkov frakcionácie tkanív sme vykonali nasledujúce imunohistochemické štúdie. V kultivovaných WT proximálnych tubulárnych epiteliálnych bunkách sa p65 nachádzal hlavne v cytosóle, ale lokalizoval sa v jadrách v neprítomnosti MG53 (obrázok 4a). Keď boli tieto bunky ošetrené LPS (5 mg) počas 8 hodín, sekrécia prozápalových cytokínov bola významne vyššia v mg53 / bunky ako bunky WT (obrázok 4b).

Pretože tieto údaje naznačujú, že MG53 môže interagovať s p65 na reguláciu expresie zápalových cytokínov, priama interakcia medzi p65 a MG53 sa hodnotila koimunoprecipitačnými testami s použitím buniek HEK293 kotransfekovaných s Flag-p65 a HA-MG53. Preukázali sme slabú interakciu (obrázok 4c). Kotransfekcia plazmidov GFP-p65 a RFP-MG53 a konfokálna analýza potvrdili kolokalizáciu p65 a MG53 (obrázok 4d). Potom sme kvantifikovali, či MG53 ovplyvňuje transkripčnú aktivitu NF-kB (p65) po stimulácii TNF meraním luciferázovej aktivity zo stabilnej transkripčnej reportérovej bunkovej línie NF-kB/293-GFP-Luc, ktorá bola prechodne transfekovaná buď vektorom pHM6 alebo HA-MG53. Reportérové ​​bunky obsahujú transdukovaný lentivírusový expresný luciferázový reportér svetlušiek riadený minimálnym cytomegalovírusovým promótorom v spojení so 4 kópiami konsenzuálnych NF-kB transkripčných odozvových elementov (kB miesto) upstream. V neprítomnosti TNF-a bola v reportérových bunkách exprimujúcich proteíny MG53 detegovaná veľmi nízka vnútorná luciferázová aktivita. MG53 potlačil transkripčnú aktivitu NF-kB (p65) vyvolanú TNF-a o približne 40 percent (obrázok 4e).

Nadmerná expresia MG53 zabránila jadrovej translokácii NF-kB p65 po liečbe TNF-a NF-kB p65 sa translokoval do jadra po liečbe TNF-a v epiteli proximálneho tubulu obličiek.41 Preskúmať, či liečba s MG53 môže zoslabiť jadrovú translokáciu NF-kB p65 po stimulácii TNF-a sme nadmerne exprimovali MG53 v HKC-8 bunkách buď prostredníctvom DOX-dependentnej vírusovej transdukcie Ad-tPA-MG53 alebo prostredníctvom liečby rekombinantným ľudským MG53 (rhMG53). Použitím MG53-špecifickej monoklonálnej protilátky sa po indukcii závislej od DOX imunoblotingom detegovala MG53. MG53 bol prítomný vo veľmi vysokej hladine v bunkách HKC-8 transdukovaných Ad-tPA-MG53,

ekvivalent 1 ng rhMG53/mg bunkového lyzátu. Na rozdiel od toho HKC-8 absorboval a exprimoval oveľa menšie množstvo rhMG53 (obrázok 5a). Príjem FL fluorescenčne značeného rhMG53 pomocou HKC -8 bol potvrdený konfokálnou mikroskopiou (doplnkový obrázok S3). Po ošetrení TNF-a bol čas na vrchol aktivácie p65 15 až 30 minút (obrázok 5b). Za bazálnych podmienok sa NF-kB p65 nachádzal hlavne v cytosóle a nadmerná expresia MG53 to nezmenila (obrázok 5c a d). Po stimulácii TNF-a sa však p65 translokoval do jadier v bunkách HKC-8, ktoré nadmerne neexprimujú MG53. Na porovnanie, jadrová translokácia p65 klesla o 33 percent (bunky, ktorým bol podávaný rhMG53) na 50 percent (transdukované bunky, ktoré dostali DOX) v bunkách nadmerne exprimujúcich MG53 (obrázok 5c a d).

Adoptívny prenos upravených buniek RAW do modelu UUOmouse sa uskutočnil s 1 - 106 bunkami podanými injekciou do chvostovej žily bezprostredne po operácii UUO. Myši boli náhodne rozdelené do skupiny, ktorá dostávala normálnu pitnú vodu (-DOX) a skupiny, ktorá dostávala DOX (2 mg/ml) v pitnej vode. Myši UUO dostávali RAW každý ďalší deň celkovo 4 injekcie. Obličky sa odobrali 7 dní po operácii.

Myši s infúziou upraveného RAW, po ktorej nasledovala indukcia DOX, vykazovali významne zníženú (o 30 percent) fibrózu obličiek v porovnaní s tými, ktoré nedostali žiadne bunky alebo ktoré dostali infúziu upravených buniek RAW, ale bez indukcie Dox (66 percent fibrotickej oblasti; obrázok 6a a b).

Iba malá populácia RAW/Ad-tPA-MG53 prežila dohľad nad retikuloendoteliálnym systémom na konci experimentov. Imunohistochemické farbenie potvrdilo, že expresia MG53 sprostredkovaná RAW v obličkách indukovala liečba DOX (obrázok 6c). Je zaujímavé, že obličky UUO od myší s infúziou RAW a MG53 indukovaný DOX vykazovali nižší pomer p-65/t-p65 (asi o 40 percent) ako u tých, ktorí buď nedostali RAW, alebo tých, ktorí dostali RAW bez DOX (obrázok 6d a e). Znížená hladina p-p65 bola potvrdená imunohistochemickým farbením UUO obličiek p-p65 (S536) (obrázok 6f). Myslíme si, že cirkulujúci MG53 dodávaný pomocou Raw/Ad-tPA-MG53/þDOX a absorpcia bunkami proximálneho tubulu obličiek by sa mohli podieľať na znížení p-p65 (S536) a znížení zápalu obličiek UUO. V porovnaní s obličkami obsahujúcimi iba UUO sa expresia TGF-b1, PAI- 1 a Col1a1 významne zvýšila v obličkách UUO od myší, ktorým bol podaný RAW bez DOX (bez indukcie MG53). Zvýšenie týchto profibrotických génov možno pripísať indukcii silnej aloštepovej reakcie z buniek infúziou do imunokompetentných myší. Avšak obličky UUO od myší, ktorým bola podaná infúzia RAW a ktorým bol podaný DOX (indukcia MG53), vykazovali výrazne nižšiu (60- až 72-percentnú redukciu) PAI-1 a relatívne nižšie hladiny TGF-b1 a Col1a1 ako myši bez liečby DOX (obrázok 6g).

Systémové podávanie rhMG53 zmierňuje aktiváciu NF-kB a rozvoj fibrózy u myší vystavených UUO

Testovali sme, či rhMG53 vykazuje podobný antifibrotický účinok ako predtým opísaná umelá bunková terapia RAW. Naše predchádzajúce farmakokinetické údaje ukázali krátky polčas v obehu (približne 90 minút u hlodavcov) rhMG53.42 Myši tolerovali chronické podávanie 2 až 6 mg/kg

rhMG5326,37, takže bola použitá stratégia podávania znázornená na obrázku 7a. Myšiam UUO sa náhodne podávalo buď vehikulum (fyziologický roztok) alebo rhMG53 (2 mg/kg) denne počas prvých 7 dní po operácii a potom každý druhý deň, kým neboli usmrtené v deň 12. Falošné a kontralaterálne obličky vykazovali približne ekvivalentný t-p65 a hladiny expresie fibronektínu, pričom hladiny p-p65 sa mierne zvýšili v kontralaterálnych obličkách v porovnaní s falošnými obličkami. Po UUO sa obličkový t-p65 zvýšil. V porovnaní so zvieratami liečenými fyziologickým roztokom sa pomer p-65/t-p65 v obličkách UUO zvierat liečených rhMG{18}} znížil o približne 37 percent, zatiaľ čo IkBa sa zvýšil o približne 27 percent (obrázok 7b a c). Okrem toho sa fibronektín znížil o približne 33 percent (obrázok 7b a c). Imunohistochémia potvrdila prítomnosť rhMG53 v obličkách UUO po liečbe (obrázok 7d). Celková fibróza bola znížená v obličkách UUO liečených rhMG53- (obrázok 7e). Avšak RNA expresia TGF-b1, PAI-1 a Col1a1 bola podobná u myší liečených buď fyziologickým roztokom alebo rhMG53 (obrázok 7f).

cistanche je účinný pri liečbe dysfunkcie obličiek

DISKUSIA

MG53 je proteín TRIM obohatený svalmi, ktorý bol pôvodne identifikovaný ako významná zložka mechanizmu na opravu plazmatickej membrány. myokín.32 Už sme predtým ukázali, že MG53 dokáže kontrolovať zápal počas poškodenia tkaniva vo vzdialených orgánoch.27,29,33,35–37 Tento výskum rozširuje rozsah MG53-sprostredkovanej ochrany orgánov na obličky. Dospeli sme k záveru, že MG53 môže zmierniť intrarenálny zápal a fibrózu obličiek blokovaním cytokínom indukovanej aktivácie prozápalového a profibrotického transkripčného faktora NF-kB. Tento záver je založený na nasledujúcich pozorovaniach: (i) genetická delécia MG53 u normálnych myší.

viedlo k poklesu funkcie obličiek, keď myši starli, čo bolo sprevádzané zvýšením fibrózy obličiek a infiltráciou obličiek leukocytmi a makrofágmi; (ii) v myšom modeli poškodenia obličiek UUO vykazovali upchaté obličky MG53-deficientných myší viac fibrózy a zápalu ako myši s MG53-repletáciou; (iii) produkcia TNF-a a interleukínu -6proximálnymi tubulárnymi epiteliálnymi bunkami ošetrenými LPS bola oslabená v prítomnosti MG53; (iv) liečba alebo nadmerná expresia MG53 v proximálnej tubulárnej epiteliálnej bunkovej línii znížila TNFa-indukovanú aktiváciu NF-kB blokovaním jadrovej translokácie zložky p65 v-kB (zistilo sa, že MG53 sa viaže priamo na p65, aj keď slabo); a (v) fosforylácia p65, nevyhnutný krok v aktivácii NF-kB, bola znížená v upchatých obličkách UUO myší liečených rekombinantným MG53 indukovaným k nadmernej expresii MG53 v makrofágoch. Okrem toho sa inhibítor aktivácie NF-kB, IkBa, zvýšil v upchatých obličkách myší UUO, ktorým bol injikovaný rekombinantný MG53.

Genetická delécia MG53 u normálnych myší bola prípustná pre nepriaznivé účinky starnutia na obličky. To naznačuje, že prítomnosť endogénneho MG53 poskytuje základnú úroveň ochrany počas starnutia. Podobne strata endogénneho MG53 zhoršila AKI v dôsledku obštrukcie. Oblička UUO akumulovala MG53, čo pravdepodobne odráža aktivitu vzdialeného myokínu z kostrového svalstva. Zostáva nejasné, ako sa sval MG53 môže nabrať do obličiek počas zranenia; poškodená oblička však často vyvíja hypoxiu a podlieha oxidačnému stresu,^44,45signály, ktoré by mohli slúžiť na nábor MG53. Ak áno, táto os „sval-oblička-imunitná bunka“ by sa mohla využiť na zmiernenie poškodenia obličiek.46 Alternatívne obličkové bunky exprimujú nízke hladiny MG53 na začiatku,²⁶a počas akútneho alebo chronického poranenia môže byť produkcia MG53 zvýšená.

NF-kB je prominentným transkripčným hnacím motorom zápalu a fibrózy pri poškodení obličiek a starnutí.^14,17,47,48Boli sme vyzvaní, aby sme preskúmali, či by účinky MG53 mohli byť sprostredkované prostredníctvom NF-kB, pretože prítomnosť MG53 v jadrovom kompartmente obličkových homogenátov naznačovala potenciál pre transkripčnú interferenciu. Jadrová lokalizácia MG53 nie je bez precedensu. V transgénnom modeli nadmerne exprimujúcom myokardiálny MG53 jadrový MG53 reguloval expresiu peroxizómového proliferátorom aktivovaného receptora-alfa na transkripčnej úrovni a ovplyvňoval metabolizmus srdcových lipidov.49 Okrem toho sme nedávno preukázali, že rhMG53 potláča aktiváciu NF-kB na zmiernenie srdcového zlyhania súvisiaceho s vekom redukciou prozápalových cytokínov, apoptózy a oxidačného stresu u starých kardiomyocytov.³⁷

Molekulárny mechanizmus toho, ako MG53 moduluje jadrovú/cytoplazmatickú mobilizáciu p65, zostáva nejasný. MG53 neobsahuje žiadny jadrový lokalizačný signál, ale obsahuje 3 predpokladané nukleárne exportné signály bohaté na N-koncový leucín, motív rozpoznávaný exportínom jadrového exportného proteínu.⁵⁰Priama interakcia medzi MG53 a p65 bola dosť slabá ako jediný alebo hlavný rušivý účinok MG53 na aktiváciu NF-kB. Aj keď sa zdá, že MG53 ovplyvňuje dynamické nukleocytoplazmatické presúvanie kritických zložiek NF-kB, presné mechanizmy ešte treba určiť.

Zdá sa, že kritickým výsledkom renoprotekcie sprostredkovanej MG{0}} je zníženie fibrotickej remodelácie prostredníctvom oslabenia zápalu sprostredkovaného NF-kB. Fibróza obličiek je komplexný proces zahŕňajúci patologické ukladanie rôznych ECM proteínov.51 Zdá sa, že MG53 má jasné účinky na ECM proteín fibronektín. Fibronektín sa zvýšil v UUO obličkách s deficitom MG53 a znížil sa u UUO myší liečených MG53. Expresia iných ECM proteínov v prítomnosti a neprítomnosti MG53 je ťažšie pochopiteľná. Už predtým sme v štúdii in vitro preukázali, že rhMG53 negatívne reguluje signalizáciu TGF-b1/Smad a potláča syntézu proteínov ECM.31 In vivo transkripty TGF b1, PAI-1 a Col1a1 sa nezvýšili v obličkách UUO z mg53/deficitné zvieratá. Tieto transkripty sa znížili u zvierat UUO indukovaných k nadmernej expresii MG53 prostredníctvom podávania vírusom indukovanej myši

makrofágy, ale keď sa podal rekombinantný MG53, nepozoroval sa žiadny účinok. Toto môže byť jednoducho prípad dostatočného dávkovania, pretože dosiahnuté intrarenálne hladiny MG53 boli oveľa vyššie u zvierat, ktorým bol podávaný makrofágový vektor, v porovnaní s rekombinantným MG53. Okrem toho sa nemerali hladiny proteínov a post-transkripčné udalosti mohli modifikovať ECM v UUO. Na objasnenie vznikajúcej úlohy MG53 pri modulácii špecifických ECM proteínov je potrebný ďalší výskum. Na záver, táto štúdia preukázala, že myokín môže pomôcť regulovať základný zápal vo vzdialenom orgáne, ako je oblička, a v prípade poškodenia obličiek môže pomôcť zmierniť a kontrolovať zápal. Obrázok 8 predstavuje pracovný model úlohy MG53 pri renoprotekcii. Počas stimulácie a ischemického stresu spojených s poškodením (DAMP, ako je TNF-a) a patogénom asociovaných molekulárnych vzorov (PAMP, ako je LPS) sa v obličkách aktivuje signálozóm NF-kB. MG53 chráni obličky inhibíciou fosforylácie a aktivácie signalizácie NF-kB, stabilizáciou IkBa a znížením mobilizácie jadra p65, čím blokuje aktiváciu prozápalových programov. Aj keď endogénny MG53 môže sprostredkovať tieto účinky, navrhujeme, aby sa pri použití MG53 terapeuticky poskytla silnejšia ochrana, čo je uskutočniteľné na základe schopnosti exogénneho MG53 znižovať poranenie pri UUO. Je potrebné ďalšie skúmanie, aby sme pochopili, ako možno tento myokín klinicky využiť.

prínos cistanche: ochrana pečene a antifibróza

DISCLOSURE

JM má majetkový podiel v spoločnosti TRIM-edicine, Inc., ktorá vyvíja rhMG53 na liečbu ľudských chorôb. Patenty na používanie MG53 vlastnia Rutgers University a The Ohio State University. Všetci ostatní autori nedeklarovali žiadne konkurenčné záujmy.

POĎAKOVANIE

Túto prácu podporili Národné inštitúty zdravia (NIH) R01-DK106394 (JM, BHR a P-HL) a NIH R01-AG062896 (P-HL a BHR). Tento projekt bol tiež čiastočne podporený intramuralLockwood fondom zo Štátnej univerzity v Ohiu (P-HL) a ocenením od Národného centra pre pokrokové translačné vedy (NCATS; P-HL, číslo ocenenia UL1TR002733). Za obsah sú výlučne zodpovední autori a nemusí nevyhnutne predstavovať oficiálne názory NCATS alebo NIH.

AUTORSKÉ PRÍSPEVKYHL,

PD, P-HL, JM a BHR navrhli a/alebo navrhli štúdie; HL, PD, P-HL, ZL a XZ vykonali experimenty, získali údaje a vykonali analýzu údajov; PD, P-HL a BHR interpretovali výsledky; a P-HL a BHR vypracovali, zrevidovali a schválili rukopis. Všetci autori si prečítali a schválili konečnú verziu.

DOPLNKOVÝ MATERIÁL

Doplnkový súbor (PDF) Doplnkové metódy.

Tabuľka S1.Primérové ​​sekvencie. Obrázok S1. mg53-/- myši vykazujú zvýšené ukladanie proteínov ECM. Tkanivá obličiek divého typu (WT) zodpovedajúceho veku (10 mesiacov) a mg53-/- boli zafarbené 40 6-diamidino-2-fenylindolom (DAPI; modrá, ľavé panely), a-aktín hladkého svalstva (SMA; zelený, druhý panel), fibronektín (červený, tretí panel) a zlúčený (pravý panel). Tyč ¼ 25 mm. Kvantifikácia oblasti renálnej fibrózy (n ¼ 3 na skupinu). Údaje sú prezentované ako priemer -SD. Študentov t-test. ***P <>

Obrázok S2.Distribúcia kostrového svalstva MG53 medzi jadrom a cytoplazmou. Kostrový sval získaný z myší divokého typu (WT) ormg53-/- sa frakcionoval a imunoblotoval s na mieru vyrobenou protilátkou anti-MG53 (3 mg lyzáty) a markermi bunkového kompartmentu (20 mg lyzáty). Adenozíntrifosfatázy sodno-draselné sa používajú ako marker bunkovej membrány, histón H3 ako jadrový marker a tubulín ako cytozolový marker.

Obrázok S3.Bunky proximálneho tubulu obličiek HKC-8 špecificky vychytávajú rhMG53 značený AlexaFluor 647. rhMG53 (Trimedicine) a hovädzí sérový albumín (BSA; ThermoFisher Scientific) boli označené súpravami Alexa Fluor (AF) Antibody Labeling kits (Life Technologies) podľa protokolu výrobcu. Bunky HKC-8 boli kultivované na miske so skleneným dnom Delta TPG (Bioptechs Inc.) v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu (DMEM) s 10 percentným fetálnym bovinným sérom (FBS) v prítomnosti značených proteínov, BSA-AF647 (vľavo ) a rhMG53-AF647 (vpravo) počas 24 hodín. Obrázky Z-stack boli nasnímané z konfokálneho mikroskopu LSM780 (Zeiss). Obrázky zobrazujú bunky na dne riadu. Tyč ¼ 25 mm.

Obrázok S4.Vytvorenie buniek RAW na sprostredkovanie indukovateľnej sekrécie MG53. (A) RAW bunky boli infikované Ad-tPA-MG53 počas 24 hodín a ošetrené bez (doxycyklínu [Dox]) alebo s Dox (þDox, 1 mg/ml) ďalších 24 hodín, aby sa indukovala expresia tPA-MG53. Konfokálne snímky ukázali indukciu expresie MG53 (protilátka anti-MG53 vyrobená na mieru, červená, spodné panely) z buniek RAW podobných makrofágom (farbenie F4/80, zelené, horné panely). Tyče ¼ 25 mm. (B, C) Western blot analýza bunkových lyzátov (v množstve 0,6, 3 a 6 mg) na indukovanú expresiu tPA-MG53 a MG53 z infikovaných RAW buniek (B) a zodpovedajúcej kultúry koncentráty médií (v objemoch 2, 5 a 10ml) (C). Ako štandardy sa naniesli rôzne množstvá rhMG53 (v množstve 0,2, 1, 0,05 a 0,025 ng). Mw, markery molekulovej hmotnosti.