Časť Ⅰ: Obličkové organoidy generované z erytroidných progenitorových buniek pacientov s autozomálne dominantným polycystickým ochorením obličiek

pre viac informácií:{0}}

Roberta Faciolio, Fernando Henrique Lojudice a kol.

Úvod

Autozomálne dominantné polycystickéochorenie obličiek(ADPKD) je celosvetovo najčastejšou genetickou príčinou chronického ochorenia obličiek (CKD) a je jednou z najrozšírenejších dedičných monogénnych porúch, ktoré postihujú populáciu odhadovanú na 1:400-1000 [1].ADPKD (Autozomálne dominantné polycystickéochorenie obličiek) je spôsobená mutáciami v génoch PKD1 (polycystická choroba obličiek typu 1) a PKD2 (polycystická choroba obličiek typu 2), ktoré kódujú polycystín-1(PC1) a polycystín-2 (PC2), v uvedenom poradí, čo má za následok zmeny mihalníc a tvorbu cýst. Oba proteíny modulujú početné molekulárne dráhy, ako aj morfogenézu a funkciu tkanív. Presné molekulárne mechanizmy, ktoré sú základom cystogenézy, však zostávajú nejasné. Dobre sa uznáva, že pre cystogenézu je nevyhnutná zárodočná mutácia, po ktorej nasleduje somatická mutácia (druhý zásah) v normálnej alele [2,3]. Okrem toho sa na základe výsledkov z ortologických myších modelov preukázalo, že pre rýchly a závažný rast cýst v zrelých obličkách je potrebný ďalší renálny insult (tretí zásah) [4,5]. Zdá sa, že u ľudí sa väčšina druhých zásahov vyskytuje počas vývoja obličiek, čo vedie k cystickej tvorbe a rastu dokonca aj in utero. Závažnosť a rýchlosť progresie ochorenia obličiek v dôsledku mutácií PKD1 (polycystické ochorenie obličiek typu 1) a PKD2 (polycystické ochorenie obličiek typu 2) môžu byť ovplyvnené niekoľkými faktormi, vrátane načasovania inaktivácie génov, vývoja obličiek štádium, vplyvom prostredia, prítomnosťou sprievodných renálnych lézií a rôznorodosťou genetických mutácií.

Hoci existuje nespočetné množstvo údajov týkajúcich sa patofyziologických mechanizmov ADPKD (autozomálne dominantné polycystickéochorenie obličiek) zhromaždené zo štúdií využívajúcich ortologické a neortologické myšacie modely, je k dispozícii len niekoľko štúdií zameraných na ľudské bunkové modely cystogenézy [6]. V roku 2007 Takahashi et al.[Z úspešne preprogramovali somatické bunky na pluripotentné kmeňové bunky s embryonálnymi vlastnosťami a nazvali ich "indukované pluripotentné kmeňové bunky" (iPSC). Odvtedy bolo mnoho zdrojov somatických buniek preprogramovaných na iPSC (indukované pluripotentné kmeňové bunky) zo zvieracích alebo ľudských tkanív (hiPSC)[Z], pričom ich hlavným zdrojom sú dospelé fibroblasty. V roku 2013 Freedman a spol.[8] indukované hiPSC (indukované pluripotentné kmeňové bunky) z fibroblastov ADPKD (autozomálne dominantné polycystickéochorenie obličiek) a zistili zníženú ciliárnu expresiu polycystínu-2, čo podporuje použitie takýchto buniek na skúmanie patofyziológie polycystickej choroby (PKD). Nedávno Chen et al v roku 2016 uviedli, že získali hiPS bunky z erytroidných progenitorových buniek [9].

Za posledných niekoľko rokov došlo k významnému pokroku vo vytváraní 3-rozmerných organoidov z iPSC (indukované pluripotentné kmeňové bunky) [Z,{1}}]. Primárnyobličkytubulárne epitelové organoidy môžu byť odvodené z tkaniva obličiek, ako aj z moču, a tieto organoidy sú dôležitým nástrojom na personalizované modelovanie chorôb, ako ukázali Schutgens et al. [13]. V nasledujúcich štúdiách Freedman et al.[14] dokázali vygenerovaťobličkyorganoidy odvodené z komerčne dostupnej bunkovej línie hiPS, čím sa vytvoril protokol na generovanie bunkových typov prítomných v metanefrickej hmote, z ktorých vznikajú všetky štruktúry nefrónu. Potom zrazením PKD1 (polycystický typ 1obličkyochorenie) alebo gény PKD2 (polycystické ochorenie obličiek typu 2), títo výskumníci pozorovali tvorbu cýstobličkytubuly. Vzhľadom na všetky tieto pokročilé a inovatívne technológie sme sa zamerali na získanie iPSC (indukované pluripotentné kmeňové bunky) z cirkulujúcich erytroidných progenitorových buniek ADPKD (autozomálne dominantné polycystickéochorenie obličiek)pacientov a testovať vývoj obličkových organoidov in vitro na rekapituláciu krokov podieľajúcich sa na organogenéze, snažiac sa vyvolať niektoré patofyziologické udalosti súvisiace s včasnou cystogenézou.

Kliknutím zobrazíte vedľajšie účinky a prínos pre obličky

Metódy Výber pacienta

Vzorky krvi boli odobraté od dvoch nepríbuzných pacientok (PT1 a PT2), ktorým bola klinicky diagnostikovaná ADPKD (autozomálne dominantné polycystické ochorenie obličiek) (PT1:66 rokov, eGFR 43,8 ml/min na 1,73 m2 a PT2:56 rokov, eGFR 60,2 ml/ min na 1,73 m2), sledované pri polycystickej chorobe obličiek. Ambulancia Nefrologického oddelenia Federálnej univerzity v Sao Paule (UNIFESP) a od jednej zdravej ženy bola odobratá ďalšia vzorka, ktorá slúžila ako kontrola na stabilizáciu a normalizáciu techniky. Diagnóza ADPKD (Autozomálne dominantné polycystické ochorenie obličiek) bola založená na pozitívnej rodinnej anamnéze a na prítomnosti obličkových cýst podľa ultrasonografických diagnostických kritérií Pei et al.[15] (rodokmene rodiny sú uvedené na obrázku S1A). Obaja pacienti mali cystické obličky a pečeň (obrázky magnetickej rezonancie sú uvedené na obrázku S1B). Štúdiu posúdil a schválil Etický poradný výbor univerzity (CEP UNIFESP, "Comite de Etica em Pesquisa da Universidade Federal de Sao Paulo", č. 1199.{20}}/2018). Po rozhovore s cieľom vysvetliť účel štúdie pacienti aj zdravá kontrola podpísali formulár informovaného súhlasu.

Expanzia erytroidných progenitorových buniek izolovaných z plnej krvi Vzorky krvi sa odoberali do skúmavky Vacutainer obsahujúcej EDTA (ako antikoagulant) pri teplote miestnosti. Erytroidné progenitorové (EP) bunky sa potom oddelili pomocou metódy RosetteSep (15216; Stem Cell Technologies), ktorá odstránila nežiaduce bunky, ako sú zrelé červené krvinky a krvné doštičky, pričom sa zachovala požadovaná EP populácia. Kvôli nízkej koncentrácii EP v plnej krvi boli bunky expandované a kultivované v špecifickom kultivačnom médiu obsahujúcom cytokíny a doplnky (X-Vivo médium, Lonza). EP bunky boli identifikované prietokovou cytometriou s použitím transferínového receptora (CD71) a glykoforín A (Gly A) ako markery označené GFP (obr. S2).

Preprogramovanie erytroidných progenitorových buniek

Expandované EP bunky boli zozbierané a nukleofikované pomocou Epi5 Episomal iPSC (indukované pluripotentné kmeňové bunky) Reprogram-ming kit (Thermo Fisher) obsahujúcej optimalizovanú zmes piatich preprogramovacích faktorov (Oct-4, Sox2, Lin28, L-Myc, a Klf4). Transfekcia (elektroporácia) sa uskutočnila epizomálnymi vektormi (bez vírusov, neintegrujúcimi sa) zo súpravy Lonza Nucleo factor kit. Po transfekcii boli bunky nanesené do kultivačného média špecifického pre ReproTeSR na preprogramovanie (Stem Cell Technologies) za štandardných podmienok bunkovej kultivácie (37 °C, 95 % CO a 5 % O2).

Karyotypizácia

Aby sa overilo, či proces preprogramovania zachoval chromozomálnu integritu, vykonala sa analýza karyotypu na genetickom oddelení UNIFESP. Bunky boli ošetrené 100 ul kolchicínu (0,08 ug/ml) v 5 ml iPs bunkové kultivačné médium na vyvolanie zastavenia bunkového cyklu, po ktorom nasledovalo pridanie 0,075 M hypotonického roztoku KCI na vyvolanie jadrového opuchu; bunky sa potom fixovali zmesou metanolu a kyseliny octovej (3:1). Zozbierali sa metafázové chromozómy a na cytogénnu analýzu G-pásov sa použilo Wrightovo farbenie (obr. S3).

iPSC (indukované pluripotentné kmeňové bunky) charakterizácia kolónie

EP bunky boli preprogramované epizomálnymi vektormi, ktoré vytvorili typické kolónie iPSC (indukované pluripotentné kmeňové bunky) a predstavovali normálny karyotyp (obr. S3). Charakteristiky kolónie iPSC (indukované pluripotentné kmeňové bunky) boli porovnané s charakteristikami zavedenej kontroly odvodenej z bunky línie H9 (hESC, Human Embryonic Stem Cells, WA09, dostupné od Wicell Research Institute, USA)( Obr. 1B). Pretože iPSC (indukované pluripotentné kmeňové bunky) predstavovali typickú morfológiu, markery pluripotencie sa identifikovali imunofluorescenciou. Bunky boli fixované 4 percentami paraformaldehydu počas 30 minút pri teplote miestnosti. Po fixácii boli vzorky trikrát premyté PBS, blokované v 5 percentách PSA a 0,3 percentách Triton-X-100/DPBS a inkubované cez noc s primárnymi protilátkami (Cell Signaling, Ma, EUA), menovite OCT4(1 : 400 riedenie) ako test pluripotencie. Nasledujúci deň sa pripravilo nové sklíčko, premylo sa v PBS a inkubovalo sa so sekundárnou protilátkou Alexa Fluor (riedenie 1:200, Cell Signaling) a pridal sa DAPI (1:1000, Invitrogen, MA, USA) pre jadrovú identifikácia.

Obr. 1. Generovanie a charakterizácia iPSC(indukované pluripotentné kmeňové bunky). iPSC boli preprogramované z expandovaných erytroidných progenitorových (EP) buniek zo zdravej kontroly (HC) a dvoch rôznych pacientov s ADPKD (PT1 a PT2).

A. Schematické postupné generovanie obličkových organoidov B. Podobnosť iPSC (a. typický obraz iPSC z komerčných embryonálnych buniek H9. b. iPSC z progenitorových erytroidných buniek zo zdravej kontroly)

C. Morfológia iPSC kolónií D. Charakterizácia iPSC pluripotencie pozorovanej pod invertovaným digitálnym fluorescenčným mikroskopom EVOS fl.

Značenie protilátky OCT4 sa použilo ako marker pluripotencie na charakterizáciu povahy pluripotencie HC, PT1 a PT2 kolónií.

Bunkové jadrá boli označené DAPI (stupnica pre obr. 1B: 200 μm; stupnica pre obr. 1C: 1000 μm; stupnica HC / PT2 pre obr. 1D: 1000 μm; stupnica PT1 pre obr. 1D: 200 μm).

Schopnosť iPSC (indukované pluripotentné kmeňové bunky) diferencovať sa na všetky tri zárodočné vrstvy

iPSC (indukované pluripotentné kmeňové bunky) sa pestovali v 6-jamkových doštičkách potiahnutých Matrigelom (1:10, BD Biosciences, NY, EUA) v kultivačnom médiu mTeSR1 (Stem Cell Technologies, BC, Kanada). Aby sa zabránilo diferenciácii iPSC (indukované pluripotentné kmeňové bunky), kolónie sa pasážovali manuálne mechanickou fragmentáciou špičkou pipety pod mikroskopom alebo sa disociovali enzymatickým štiepením pomocou Gentle Cell (Life Technologies) (obr. S4). Pomocou týchto metód sa iPSC (indukované pluripotentné kmeňové bunky) udržiavali počas 22 sériových pasáží, aby sa zabezpečilo, že bunky správne začlenia preprogramovacie faktory. iPSC (indukované pluripotentné kmeňové bunky) sa potom stimulovali na diferenciáciu do troch zárodočných vrstiev pomocou súpravy STEMdiff Trilineage Differentiation kit (Stem Cell Technologies). Po piatich dňoch sa bunky zozbierali na analýzu vekovo špecifických markerov mezodermu a endodermu a po siedmich dňoch sa analyzovali na ektoderm podľa protokolu STEMdiff Trilineage Differentiation Protocol (S5 obr.).

Molekulárna charakterizácia všetkých troch zárodočných línií pomocou qRT-PCR

Celková RNA z kultúr troch zárodočných vrstiev bola extrahovaná pomocou súpravy GE RNA Spin Mini (GE Healthcare, USA) a potom konvertovaná na cDNA pomocou súpravy High Capacity Reverse Transscription Kit (Applied Biosystems, USA) podľa pokynov výrobcu. Kvantitatívna PCR v reálnom čase (gRT-PCR) sa uskutočnila s použitím súpravy SYBR Green PCR (Applied Biosystems, USA) podľa protokolu výrobcu. Hladiny expresie mRNA sa vypočítali pomocou metódy 2^Ct. Hydroxymetylbilánsyntáza (HMBS) a glyceraldehyd 3-fosfátdehydrogenáza (GAPDH) sa použili ako vnútorné kontroly a ako kvantitatívna kontrola sa použila expresia OCT4. Expresia SOX17 sa použila na identifikáciu diferenciácie do endodermy, CXCR4 sa použil na identifikáciu diferenciácie do mezodermy a PAX6 sa použil na identifikáciu diferenciácie na ektoderm (obr. S6). Všetky sekvencie primérov sú špecifikované v tabuľke S1 a krivka účinnosti sa vyhodnotila pre každý pár primérov.

Imunofluorescencia pre rôzne zárodočné vrstvy

iPSC (indukované pluripotentné kmeňové bunky) boli indukované k diferenciácii na krycích sklíčkach v šesťjamkových doštičkách. Po diferenciácii boli krycie sklíčka odstránené z pôvodných jamiek a prenesené na novú platňu, kde boli bunky fixované 4 percentami paraformaldehydu a potom premyté PBS, ako je opísané vyššie. Boli použité primárne protilátky proti OCT4 (1:400; Cell Signaling), CXCR4 (1;100;Cell Signaling), PAX6 (1:100;Thermo Fisher) a SOX17 (1:100;R&D Systems). Fluorescencia bola hodnotená pomocou sekundárna protilátka Alexa Fluor (1:200; Cell Signaling).

Obličková organoidná diferenciácia od iPSC (indukované pluripotentné kmeňové bunky)

Renalorganoidy boli generované podľa protokolu opísaného Cruzom a kol. [6] s niekoľkými úpravami. Stručne povedané, 50 000 iPSC (indukované pluripotentné kmeňové bunky) od HC a dvoch pacientov s ADPKD (autozomálne dominantné polycystické ochorenie obličiek) sa použilo na výrobu suspenzií jednotlivých buniek s roztokom na oddelenie Accutase (Stem Cell Technologies). Jednotlivé bunky boli doplnené 10uM inhibítorom Rho-kinázy (Y27632, Stem Cell Technologies alebo Stemgent). Po 16 hodinách sa kultivačné médium nahradilo 1 ml mTeSR1 plus 2,5 percenta Matrigel plus 10 μuM Y27632. Po 20 hodinách sa médium nahradilo iba 1 ml mTeSRI; o 14 hodín neskôr sa kultivačné médium nahradilo a bunky sa indukovali 6 uM CHIR99021 (AT104; Kmeňové bunky alebo Stemgent GSK-3b inhibítor/agonista Wnt dráhy) plus Advanced RPMI (Thermo Fisher) plus Glutamax (Life Technologies) plus 10 ug/ml antibiotikum (Ampicillin; 1:1000; Gibco ). Nakoniec, o 36 hodín neskôr, bolo kultivačné médium nahradené médiom DRB obsahujúcim Advanced RPMI (Thermo Fischer) plus Glutamax (Thermo Fischer) plus doplnok B27 (17504-044; Life Technologies) plus antibiotikum. Médium DRB sa menilo každé tri dni počas 28 dní. Toto obdobie (28 dní) stačilo na to, aby boli organoidy viditeľné mikroskopom.

Molekulárna charakterizácia organoidov pomocou RT-PCR

Semikvantitatívna génová expresia bola hodnotená pomocou RT-PCR počas embryogénneho procesu, pričom celková RNA bola purifikovaná z bunkových štruktúr vytvorených v dňoch 0 (iPSC (indukované pluripotentné kmeňové bunky)) a 14, 21, 28 a 35 dní po indukcii diferenciácie. Hodnotila sa expresia WT1 (vyvíjajúca sa oblička), AQP1 (proximálna trubica) a ECAD (marker cystového epitelu). GAPDH sa použil ako vnútorná kontrola. Expresia OCT4 sa použila ako kvantitatívny štandard.

Výsledky

Získanie iPSC (indukované pluripotentné kmeňové bunky) z erytroidných progenitorov (EP)

Je zhrnutý protokol použitý na získanie obličkových organoidov z erytroidných progenitorov. Expanzia EP viedla k bunkám 1x10 stupňov po približne 20 dňoch (obr. S2A) a približne o dva mesiace neskôr boli EP identifikované ich expresiou markerov CD71 a Gly A. Účinnosť separačnej metódy odhalila expresiu; 88 percent buniek boli CD71 pozitívne a 57,4 percent bolo Gly A pozitívnych (S2BFig).

Po overení, že bunky boli EP, boli transfekované preprogramovacími faktormi (Oct-4, Sox2, Lin28, L-Myc a klf4) a potom boli udržiavané v špecifickom médiu na preprogramovanie (ReproTeSR, Stem Cell Technologies) približne päť dní. iPSC (indukované pluripotentné kmeňové bunky) vyvinuli typické bunkové charakteristiky vytvorením kolónií s morfológiou odlišnou od morfológie nepreprogramovaných buniek prítomných v rovnakej bunkovej kultúre. Bunky sa monitorovali, kým sme nepozorovali typické kolónie podobné iPSC (indukované pluripotentné kmeňové bunky), ktoré boli podobné kolóniám komerčnej bunkovej línie H9 (Eig 1B). Kolónie iPSC (indukované pluripotentné kmeňové bunky) boli tiež rozpoznané podľa ich relatívne väčšej veľkosti, tesné balenie buniek, dobre definovaný homogénny tvar a pravidelné okraje. Identifikácia bola uľahčená nízkym stupňom prerastania kolónií z diferencovaných buniek v bezpodpornom preprogramovacom médiu (Eig 1C). Medzi kolóniami iPSC od pacientov s HC a ADPKD (autozomálne dominantné polycystické ochorenie obličiek) (PTl a PT2) sa nenašli žiadne detegovateľné rozdiely, pokiaľ ide o morfológiu kolónií a markery pluripotencie, ako je znázornené na obrázku 1D.

iPSC (indukované pluripotentné kmeňové bunky) boli ďalej charakterizované ich schopnosťou diferencovať sa na tri zárodočné vrstvy. Typické obrazy progresie vývoja zárodočnej vrstvy v bunkách z HC sú uvedené na S5 Obr. Vývoj troch zárodočných vrstiev bol overený typickou morfológiou (Eig 2A) a imunofluorescenčným značením pre diferenciačné markery, konkrétne FOXA2 pre endoderm , aktín hladkého svalstva (SMA) pre mezoderm a SOX2 pre ektoderm (Eig2B-2D). Negatívne kontroly pre protilátky sú znázornené na obr. S7. Obr. 2E ukazuje hladiny génovej expresie špecifických markerov endodermu (SOX17), mezodermu (CXCR4) a ektodermu (PAX6), ako boli detegované pomocou RT-PCR.

Obr. 2. Charakterizácia troch zárodočných vrstiev. Zdravá kontrola (HC) a pacienti s ADPKD1 (PT1 a PT2).

A. Typická morfológia troch zárodočných vrstiev. Zárodočné vrstvy boli charakterizované imunofluorescenčným farbením pomocou špecifických protilátok. B. Endoderm (FOXA2),

C. Mesoderm (SMA) a D. Ectoderm (SOX2). Bunkové jadrá boli zafarbené pomocou DAPI. Posledné stĺpce zobrazujú zlúčené obrázky.

E. Génová expresia OCT4 indikuje pluripotenciu iPSC, SOX17 bol marker pre endoderm, CXCR4 bol marker pre mezoderm a PAX6 bol marker pre ektoderm (n=2).

Expresia OCT4 pomocou iPSC sa použila ako interná kvantitatívna kontrola. Expresia OCT4 bola nedetegovateľná v bunkách troch zárodočných vrstiev (mierka: 200 μm).

Generovanie obličkových organoidov z iPSC (indukované pluripotentné kmeňové bunky)

Trojrozmerné obličkové štruktúry boli vytvorené z iPSC (indukovaných pluripotentných kmeňových buniek) odvodených od pacientov s HC a oboch pacientov s ADPKD (autozomálne dominantné polycystické ochorenie obličiek) podľa krokov, ktoré rekapitulujú embryonálny vývoj. Obr. 3 znázorňuje kroky, ktoré sú potrebné na získanie príslušných embryonálnych štruktúr. Kolónie iPSC (indukované pluripotentné kmeňové bunky) (Eig 3A) sa disociovali s Accutase (obr. 3B), čím sa získali jednotlivé iPSC (indukované pluripotentné kmeňové bunky) (obr. 3C). Vzhľadom na normálny embryogénny proces by sa očakávalo, že sa kolónie diferencujú na blastulu a potom na gastrulu, ale spontánna diferenciácia iPSC (indukovaných pluripotentných kmeňových buniek) v kultúre je stále výzvou, pretože bunky spontánne podliehajú apoptóze [16]. Na obídenie tohto nežiaduceho výsledku sa 16 hodín po štádiu jednej bunky pridal ROCK inhibítor signalizácie (10 μM inhibítor Rho-kinázy Y27632). Inhibícia dráhy ROCK bráni bunkám spustiť cesty smrti, čo im umožňuje prežiť a prispôsobiť sa procesu diferenciácie. iPSC (indukované pluripotentné kmeňové bunky) potom rástli, až kým nedosiahli štádium epiblastu, ktoré je charakterizované prítomnosťou sféroidných dutín (obr. 3D). Ďalej sa pridal silný inhibítor GSK-3b/agonista dráhy Wnt (CHIR99021), po čom nasledovalo pridanie média DRB na vyvolanie epitelovo-mezenchymálneho prechodu (obr. 3E a 3E) a nakoniec mezenchým-epiteliálneho prechodu ( Obr. 3G); tieto kroky umožnili epitelizáciu a sekvenčnú tvorbu pretubulárnych agregátov a obličkových vezikúl (Eig 3H), čo nakoniec umožnilo tvorbu renálnych tubulárnych organoidov (obr. 3D). Všetky tieto kroky embryogenézy in vitro boli podobné pre bunky odvodené od pacientov s HC aj ADPKD (autozomálne dominantné polycystické ochorenie obličiek).

Prítomnosť tubulárnych štruktúr bola overená expresiou špecifických markerov pomocou imunofluorescencie: NHE3 a AQP1 pre proximálne tubuly (Eig4A) a NPHS2 pre glomeruly (Eig 4B). Naopak, značenie AQP2 nebolo zistené (Eig 4B), čo potvrdzuje, že toto metodika umožnila len vývoj metanefrickej hmoty, ale nie ureterického pupenu. Marker ECAD nebol detegovaný v neprítomnosti forskolínu (obr. 4B).

Na overenie prítomnosti špecifických markerov exprimovaných počas procesu vývoja progenitorových obličiek sa všetky vzorky (HC, PT1 a PT2) odobrali v piatich bodoch celého procesu diferenciácie: deň 0 (iPSC (indukovaný pluripotentný kmeň bunky)), dni 14, 21, 28 a potom v deň 35 (7 dní po indukcii cysty). Časový priebeh génovej expresie odhalil diferenciáciu počas procesu embryogenézy, ako je znázornené na obrázku 5A-5C. Marker pluripotencie OCT4 bol exprimovaný iPSC (deň O), ale jeho hladiny sa počas 14 dní znížili a po diferenciácii dosiahli veľmi nízke hladiny. Na rozdiel od toho sa expresia špecifických markerov metanefrického mezenchýmu (WT1) a proximálneho tubulu (AQP1) progresívne zvyšovala, keď sa proces diferenciácie začal do 14. dňa, pričom plató dosiahla na 21. deň. Obr. 5D ukazuje expresiu ECAD, cystogenézu marker, na 35. deň, tj 7. deň po indukcii cysty forskolínom. V neprítomnosti forskolínu bola expresia ECAD veľmi nízka, dokonca aj u pacientov s ADPKD (autozomálne dominantné polycystické ochorenie obličiek). Keď sa však pridal forskolín (28. deň), obaja pacienti vykazovali zvýšenú expresiu ECAD; ale rovnaký vzor nebol pozorovaný v HC organoidoch, ktoré zostali s nízkymi hladinami expresie ECAD dokonca aj v prítomnosti forskolínu.

Prítomnosť cýst vytvorených z organoidov stimulovaných forskolínom bola evidentná u pacientov s ADPKD (autozomálne dominantné polycystické ochorenie obličiek), ako je uvedené v Eig6. Horný panel zobrazuje obrázky organoidov na 28. deň, pred pridaním forskolínu (Eig6Aa). Eig6Ab (panoramatický pohľad-4X) a 6Ac (20-násobný pohľad) zobrazujú organoidy na 35. deň v prítomnosti forskolin ukazujúci prítomnosť štruktúr podobných cystám vo vzorkách od oboch pacientov (PT1 a PT2), ale nie vo vzorke HC. Prítomnosť cýst bola tiež overená imunofluorescenčným farbením (obr. 6B). Značenie ECAD nebolo zistené v organoidoch HC, ale bolo jasne pozorované v organoidoch u oboch pacientov. Je zaujímavé, že je možné pozorovať aj prítomnosť lumenu cysty.

Obr. 3. Generovanie tubulárnych organoidov.

Snímky s fázovým kontrastom vytvárania epitelových tubulárnych obličkových organoidov po 28 dňoch z iPSC generovaných zo skupín HC, PT1 a PT2. Počas prvých 36 hodín sa iPSC udržiavali v 3D kultúre.

Potom boli disociované, transformované na jednotlivé bunky a ošetrené Y-27632, čo umožnilo bunkovú reorganizáciu a prežitie, čím sa vytvorili epiblastové sféroidy (d).

Potom sa pridali CHIR99201 a DRB, čím sa aktivovala dráha Wnt/-katenínu a umožnila sa diferenciácia na tubulárne organoidy (I).

Morfológia medzi sféroidmi odvodenými od pacientov s ADPKD a od darcu HC je podobná. (Mierka pre a a f: 1000 μm; Mierka pre b, cd, e, g, hai: 200 μm).

KLIKNITE SEM PRE PARTⅡ