Pochopenie triedenia adenovírusových kapsidov po vstupe; Šanca zmeniť vlastnosti vektora vakcíny, časť 1

Abstrakt:

Genetické vakcíny založené na adenovírusových vektoroch sa ukázali ako účinná stratégia proti zdravotnej kríze SARS-CoV-2. Tento úspech nie je neočakávaný, pretože adenovírusy kombinujú mnohé žiaduce vlastnosti genetickej vakcíny. Sú vysoko imunogénne a majú nízky a dobre charakterizovaný patogénny profil spojený s technologickou prístupnosťou. Prebiehajúce snahy o zlepšenie adenovírusových vakcinačných vektorov zahŕňajú použitie vzácnych sérotypov a nehumánnych adenovírusov. V tomto prehľade sa zameriavame na vírusovú kapsidu a na to, ako výber genotypov ovplyvňuje príjem a následné subcelulárne triedenie. Opisujeme, ako pochopenie vlastností kapsidy, ako je stabilita počas procesu vstupu, môže zmeniť osud vstupujúcich častíc a ako sa to premieta do rozdielov vo výsledkoch imunity. Podrobne diskutujeme o tom, ako mutácia membránového lytického kapsidového proteínu VI ovplyvňuje triedenie vírusov druhu C po vstupe a stručne diskutujeme o tom, či by takéto prístupy mohli mať širší dosah na vývoj vakcín a / alebo vektorov.

Kliknite na čisté cistancheprodukt

For more information:1950477648nn@gmail.com

1. Úvod

Vírusové infekcie, na rozdiel od bakteriálnych infekcií, ktoré možno liečiť antibiotikami, zostávajú hrozbou pre zdravie, pretože existuje len veľmi málo antivírusových liekov. Preto je očkovanie jedinou široko použiteľnou stratégiou na ochranu ľudskej (a zvieracej) populácie pred vírusovými infekciami.

Donedávna sa o očkovaní proti vírusovým infekciám uvažovalo najmä v súvislosti s prevenciou detských chorôb alebo ako každoročná „chrípková“ injekcia na prevenciu chrípkovej infekcie. S vypuknutím zdravotnej krízy SARS-CoV-2 v roku 2020 sa očkovanie vrátilo do centra pozornosti verejnosti, keďže sa v súčasnosti považuje za jediné udržateľné východisko z tejto pandémie. V tomto kontexte sa vakcíny založené na adenovírusových (Ad) vektoroch ukázali ako jedna z dvoch hlavných úspešných stratégií očkovania. Po núdzovom schválení sa teraz vakcíny Ad vpichujú veľkej časti populácie Zeme v bezprecedentnom úsilí zaviesť planetárnu imunitu proti SARS-CoV-2.

Adenovírusové vektorové vakcíny sa pred vypuknutím COVID-19 veľmi nepoužívali, no ich úspech nie je neočakávaný. Vírusy sú vo všeobecnosti veľmi vhodnými očkovacími platformami. Sú biologicky optimalizované a prispôsobené na transport nukleových kyselín a vyvolávajú imunitné reakcie. Adenovírusy majú mnoho vlastností, ktoré z nich robia obzvlášť ideálnych kandidátov na vakcínu. Majú nízky a dobre charakterizovaný patogénny profil spojený s vysokou infekčnosťou. Sú technologicky prístupné a vo veľkej miere sa používajú na vektorizáciu. Ich vysoký produkčný výnos a stabilita umožňujú priemyselnú výrobu v podmienkach správnej výrobnej praxe (GMP) a poskytujú praktické vlastnosti (tj skladovanie) pre regionálnu distribúciu pri znížených nákladoch [1]. Navyše, dodávanie buniek Ad do buniek prezentujúcich antigén je účinné a prirodzene vyvolávajú vrodenú imunitnú odpoveď, ktorá pôsobí ako adjuvans na zvýšenie úspechu očkovania [2,3].

Pochopenie biológie Ad bolo rozhodujúce pri vývoji vektorov založených na Ad (vakcíne). Napríklad použitie nehumánnych alebo zriedkavých sérotypov Ad v niektorých vakcínach proti SARS-CoV-2, ktoré sú v súčasnosti na trhu, bolo zámerne zvolené, aby sa zabránilo zníženiu účinnosti vakcíny už existujúcej vektorovej imunite. Použitie vektorov s deletovaným vírusovým génom poskytuje zlepšenú bezpečnosť vektorov. Stále však existuje veľa aspektov vírusového životného cyklu, ktoré neboli zohľadnené pri vývoji vakcínových vektorov založených na Ad, a poznatky o zriedkavých alebo nehumánnych genotypoch sú obmedzené, vrátane tých, ktoré sa v súčasnosti používajú ako vakcíny proti SARS-CoV-2 . Touto recenziou by sme chceli zvýšiť povedomie o možných modifikáciách, ktoré by sa dali využiť pri vývoji vektorov reklamy na lekárske účely vrátane očkovania.

Zameriavame sa na vírusovú kapsidu a na to, ako výber genotypov ovplyvňuje príjem a následné subcelulárne triedenie. Opisujeme, ako pochopenie vlastností kapsidy, ako je stabilita počas procesu vstupu, môže zmeniť osud vstupujúcich častíc a aké rôzne výsledky imunity sa pozorujú. Ako príklad toho, ako možno zmeniť stabilitu a osud kapsidy, podrobne diskutujeme o tom, ako mutácia membránového lytického kapsidového proteínu VI ovplyvňuje vírusy druhu C. Nakoniec stručne diskutujeme o tom, či takéto prístupy majú potenciál na využitie pri vývoji vakcín a/alebo vektorov.

1.1. Adenovírusy tvoria rozmanitú rodinu infekčných patogénov

Historicky bol Ad prvýkrát izolovaný v roku 1953 z adenoidov pacientov s respiračnými infekciami [4] a čoskoro potom bol všeobecne prijatý termín „adenovírus“ [5]. Čeľaď Adenoviridae má viac ako 120 členov, rozdelených do piatich rodov – v závislosti od toho, či infikujú cicavce (napr. Mastadenoviridae), vtáky (napr. Aviadenoviridae), plazy (napr. Atadenoviridae), obojživelníky (Siadenoviridae) alebo ryby (Ichtadenoviridae ) [6,7]. Rod Mastadenoviridae tiež predstavuje viac ako 70 typov ľudských Ads [8,9], ktoré sú klasifikované do siedmich druhov (A–G) podľa ich morfologických, biologických a fyzikálno-chemických vlastností, ako je uvedené v tabuľke 1 [10, 11].

Okrem toho sa Ads môžu spontánne rekombinovať, čím sa generujú nové druhy [12], ako to bolo v prípade AdE4, čo je jediný vírus ľudského druhu E a pravdepodobne vznikol rekombináciou medzi ľudským druhom B a opičím Ad [13 ]. Hoci sú infekcie u ľudí nehumánnymi Ads prirodzene zriedkavé, nie sú nemožné [14,15]. Schopnosť rôznych nehumánnych Ads infikovať (alebo transdukovať) ľudské bunky z nich robí atraktívne (vakcínové) vektorové platformy. Medzi nimi sú reklamy odvodené od šimpanzov [16–18], goríl [19], oviec [20], kráv [21], psov [21,22] alebo opice nového sveta [23].

Adenovírusové infekcie môžu spôsobiť rôzne patológie v závislosti od ich bunkového alebo tkanivového tropizmu vrátane respiračných, očných, močových alebo gastrointestinálnych ochorení (pozri tabuľku 1). Tropizmus tkaniva je často výsledkom odlišného využitia receptorov rôznymi Ads a môže tiež súvisieť s vnútornou stabilitou častíc [24]. Väčšina infekcií Ads je u imunitne kompetentného hostiteľa mierna alebo asymptomatická. Primárne infekcie Ad sa väčšinou vyskytujú v detstve a vedú k silnej ochrannej imunite. Naopak, u imunosuprimovaných jedincov môže Ads spôsobiť nekontrolované, závažné a život ohrozujúce systémové infekcie vedúce k závažnej bunkovej toxicite, ktorá môže viesť k nadmernému zápalu a zlyhaniu viacerých orgánov, čo spôsobuje vysokú mortalitu [12].

Najlepšie preštudované ľudské Ads sú vírusy druhu C typu 2 a 5, ktoré sa vyskytujú prevažne u pacientov s infekciami horných dýchacích ciest a gastrointestinálneho traktu [25] a na ktoré sa tento prehľad zameria. Adenovírusy môžu byť zodpovedné za občasné prepuknutia, ako sú vírusy druhu B spôsobujúce zápal pľúc (napr. Ad3, 7 a 14) medzi imunitne kompetentnými jedincami [26] alebo Ad40/41 druhu F a Ad12, 18 a 31 druhu A , ktoré infikujú gastrointestinálny trakt (ako je uvedené v [26,27]). Vírusy druhu D sú veľmi rôznorodou skupinou a sú náchylné na rekombináciu a sú hlavnou príčinou očných infekcií [28].

1.2. Adenovírusové kapsidy sú metastabilné štruktúry

Napriek svojej rozmanitosti majú všetky reklamy podobný štrukturálny a organizačný rámec. Adenovírusy sú neobalené DNA vírusy obsahujúce relatívne veľký, 26–45 kb lineárny dvojvláknový DNA genóm [29–31]. Kapsida má priemer ~70–90 nm a má tvar ikozaédra s 20 fazetami a 12 vrcholmi [32]. Kapsida pozostáva z troch hlavných štruktúrnych proteínov (hexón, pentón a vlákno) a rôznych menších cementových proteínov (tj IIIa, VI, VIII a IX vo vírusoch druhu C), ktoré stabilizujú štruktúru. Štruktúra niekoľkých Ad kapsidov s vysokým rozlíšením bola získaná kryoelektrónovou mikroskopiou a röntgenovou kryštalografiou [24,33–36]. Ikozaedrický kapsid má pseudo-T25 štruktúru so 720 exónmi zostavenými v rôznych triméroch v závislosti od ich umiestnenia v kapside. 20 faziet kapsidy sa skladá z deviatich zostavených exónov (tzv. GON pre skupinu deviatich), zatiaľ čo v 12 vrcholoch sú exóny zostavené v GOS (pre skupinu šiestich) (podrobnejšie pozri [37,38] ). Pentamerický pentón je vložený do 12 vrcholov a slúži ako základ pre vyčnievajúce trimérne vlákno [39,40]. Interakcia medzi hlavnými a vedľajšími kapsidovými proteínmi stabilizuje kapsidu, hlavne prostredníctvom interakcie s šesťuholníkmi.

Napríklad GON je stabilizovaný pomocou IX [41]; IX a IIIa sú samy osebe stabilizované interakciou s VIII, ktorá ich spája s GOS a GON [37]. Molekuly VIII načrtávajú GON a pomáhajú stabilizovať šesťuholníky na vnútornej strane kapsidy. Proteín VI tiež stabilizuje hexón väzbou centrálnej dutiny triméru hexónu vystavenej vnútornému lúmenu vírusu [42–44].

Kapsida obklopuje a chráni vírusové jadro zložené z vírusového genómu, proteínov vírusového jadra (tj V, VII, Mu vo vírusoch druhu C) a terminálneho proteínu (TP), ktorý je kovalentne viazaný na každý 5' koniec genóm Ad. Menšie kapsidové proteíny interagujú s jadrovými proteínmi a vytvárajú spojenie medzi kapsidou a genómom; ich priestorová organizácia medzi jadrovými proteínmi však zostáva nedostatočne pochopená. Ukázalo sa, že V udržiava DNA vo vnútri kapsidy interakciou s VI (strana kapsidy) a VII (strana genómu) [45–47] a pravdepodobne prispieva k uvoľneniu genómu v jadrovom póre [48]. VII je hlavný kapsidový proteín spojený s vírusovou DNA a podporuje jej kondenzáciu vo vnútri kapsidy [49–51]. VII tiež chráni vírusový genóm pred imunitnou detekciou prostredníctvom bunkových faktorov [50,52–54]. Je zaujímavé, že kapsidový proteín IX a proteín V sú prítomné iba v Mastadenoviridae [55,56] a vírusové kapsidy môžu byť produkované bez IX [57] alebo proteínu VII [58], čo vykazuje určitú flexibilitu v štruktúre kapsidy.

Genóm ľudských Ads kóduje ~45 proteínov (vrátane štrukturálnych proteínov), organizovaných do dočasne regulovaných transkripčných jednotiek [59]. Transkripčný faktor E1A je prvým exprimovaným proteínom a je nevyhnutný na spustenie expresie vírusového génu [60]. Genóm tiež obsahuje 5' enkapsidačnú sekvenciu a invertované terminálne repetície (ITR) na každom konci, ktoré sú potrebné na replikáciu [59,61–64]. Adenovírusy kódujú adenovírusovú proteázu (AVP), ktorá je zabalená do častice a spracováva niekoľko proteínov (tj IIIa, VI, VII, VIII, µ, TP a 52,55 K vo vírusoch druhu C) [65–67]. Tento krok je potrebný na tvorbu zrelých infekčných častíc a indukuje tvorbu metastabilných (tj menej stabilných) kapsidov pripravených na rozklad kapsidy po prichytení a vstupe buniek [68,69]

Existujú aj druhovo špecifické rozdiely v štruktúre ľudských Ads, napr. v dĺžke vlákna a flexibilite, čo priamo ovplyvňuje väzbu na receptor [70–72]. Rozdiely možno pozorovať aj pri montáži pentónov. Pentóny vírusov druhu B môžu vytvárať inter-pentónové kontakty, čo vedie k alternatívnym a menej stabilným časticiam podobným vírusu, ktoré sú bez genómov a príležitostne bez vlákien. Takéto častice sa nazývajú dodekaedróny a študujú sa na bunkový prenos plazmidov alebo peptidov ako alternatíva k vektorom Ad. Dodekaedróny lepšie exponujú krátky peptidový motív RGD prítomný v pentóne väčšiny druhov Ad, ktorý je potrebný na naviazanie cieľových buniek [73,74]. Rozdiely v stabilite kapsidy, ako je uvedené nižšie, môžu byť dôležitou vlastnosťou, ktorá určuje vstupný osud častíc Ad.

1.3. Adenovírusy sledujú lytický životný cyklus

Infekčný cyklus Ad bol podrobne preskúmaný inde [75–77]. Tu sa stručne zameriame na vstupnú časť životného cyklu a pokiaľ nie je uvedené inak, budeme sa odvolávať na vírusy druhu C, ktoré sú najlepšie študované (obrázok 1). Adenovírusy používajú kapsidové vlákno ako primárnu bunkovú pripájaciu molekulu. Väčšina Ad, vrátane vírusov druhu C, používa vírus coxsackie a Ad receptor (CAR) na viazanie cieľových buniek [78–81]. Naopak, niektoré vírusy druhu B prednostne viažu receptor CD46 [82] alebo desmogleín 2 [83] a niektoré vírusy druhu D interagujú s kyselinami sialovými [84,85] alebo priamo s integrínmi v (pozri tabuľku 1) [ 86].

Prepínanie vlákien medzi druhmi je teda atraktívnou stratégiou na zmenu tropizmu [87–89]. Primárnou úlohou molekuly vlákna je sprostredkovať fyzickú asociáciu s cieľovými bunkami, po ktorej nasleduje druhá interakcia medzi pentónom a integrínmi, ako je v 5 [90]. Táto interakcia je sprostredkovaná RGD peptidovým motívom v pentónovej sekvencii [91]. Neprítomnosť tohto motívu, ako u vírusov druhu F, je spojená s menej účinným vstupom do bunky [92]. Výsledkom väzby integrínu je zhlukovanie integrínu na bunkovom povrchu [93], ktoré spúšťa signalizačnú kaskádu vedúcu k reorganizácii aktínového cytoskeletu [94,95] a endocytovému vychytávaniu prostredníctvom endocytózy alebo mikropinocytózy sprostredkovanej klatrínom [96,97]. Väzba RGD môže tiež destabilizovať kapsidu [98] znížením kontaktov medzi pentónom a hexónom, čo pomáha kapside odkryť [99]. V dôsledku toho častice Ad strácajú svoje vlákno a vo vnútri endozómu možno nájsť disociovaný hexón a pentón [100–102]. Endozóm je dynamická organela pripravená na dozrievanie na degradačné lyzozómy a Ads musia rýchlo uniknúť do cytosólu. Okyslenie endozómu môže urýchliť proces úniku ďalším oslabením kapsidy [100,103]. Proces penetrácie endozómu závisí od uvoľnenia vnútorného kapsidového proteínu VI [103,104].

Uvoľnený VI je charakterizovaný N-terminálnou amfipatickou špirálou, ktorá sa viaže na vnútorný cíp endozómu a indukuje pozitívne zakrivenie membrány, čo vedie k lokálne obmedzenému pretrhnutiu membrány [75,103,105,106]. Bunky reagujú na vírusom indukované pretrhnutie membrány a aktivujú lokalizovanú autofagickú reakciu na odstránenie poškodenej organely [107–109]. Aby sa zabránilo degradácii, Ads zastaví autofágiu prostredníctvom krátkeho peptidového motívu PPxY v proteíne VI, kým častica nedosiahne bezpečnosť cytosólu [104, 108]. Ukázalo sa, že vírusy druhu C unikajú zo skorých endozómov [110]. Iné druhy vrátane A, B a D sa najskôr dostanú do lyzozómu pred únikom do cytosólu [111–113], čo môže ovplyvniť imunitnú aktiváciu spúšťanú týmito vírusmi [114].

Akonáhle Ads dosiahne cytosól, zapoja sa do dyneínových motorov a využívajú retrográdny transport pozdĺž mikrotubulov, aby dosiahli centrum organizujúce mikrotubuly [115–117]. Motorická väzba je pravdepodobne sprostredkovaná hexónom [115] a môže vyžadovať kyslé primovanie [118]. V blízkosti jadra kapsidy menia smerovanie transportu, pravdepodobne väzbou na kinezínové motorické proteíny a akumuláciou v jadrovom obale [115,117,119,120]. Zakotvia v komplexe jadrových pórov, potom sa kapsidy úplne rozložia a genómy sa uvoľnia a importujú do jadra [51, 121 – 124]. Akonáhle je vnútri jadra, cyklus pokračuje transkripčnou aktiváciou genómu a expresiou bezprostredného skorého génu E1A, ktorý slúži ako transkripčný faktor pre všetky ostatné skoré transkripčné jednotky [60,125–130]. Po expresii replikačných enzýmov sa vírusové genómy replikujú a akumulujú na periférii replikačných centier [131].

Potom sa štrukturálne proteíny exprimujú z neskorej expresnej jednotky pod kontrolou hlavného neskorého promótora [132,133]. Expresia neskorých génov kulminuje v produkcii a jadrovej akumulácii všetkých štruktúrnych proteínov, kde sa zhromažďujú do potomstva a balia novosyntetizované genómy. Jadrové zostavenie ďalšej generácie Ads potom vedie k úniku častíc a lýze buniek [42, 134–136]. Ako je uvedené vyššie, po zostavení kapsidov nasleduje dozrievanie, tj proteolytické štiepenie niekoľkých kapsidových proteínov AVP za vzniku infekčných častíc [66]. Dôležitosť tohto procesu ilustruje mutant citlivý na teplotu, Ts1 pôvodne identifikovaný pri skríningu mutagenézy v Ad2. Pri nepermisívnej teplote tento mutant nedokáže zabaliť AVP a zostavené častice nepodliehajú dozrievaniu, čo vedie k hyperstabilným časticiam [137]. Zodpovedná mutácia AVP bola geneticky zavedená do Ad5 so zachovaním tohto fenotypu. Kapsidy Ts1 sú stále schopné naviazať sa na bunkové receptory a byť endocytózované, ale potom zostávajú zachytené v endozóme v dôsledku ich zlyhania pri uvoľňovaní proteínu VI [103, 138, 139].

2. Imunitná detekcia adenovírusu

Adenovírusy sú rozšírené a veľká väčšina populácie sa s týmto vírusom stretla najmä v detstve. Adenovírusy sú vysoko imunogénne a každé stretnutie vyvoláva vývoj špecifickej anti-Ad imunity, vrodenej aj adaptívnej, ktorá môže trvať celý život. To je dôležité v boji proti vírusu a robí Ads menej škodlivými pre imunitne kompetentného hostiteľa, ale môže to byť prekážkou, keď sa Ads má použiť ako vektor vo vakcinológii alebo génovej terapii [140,141]. Pochopenie toho, ako Ad (a jeho vektorové deriváty) aktivuje imunitný systém, nám umožní zlepšiť účinnosť a bezpečnosť vakcín. Pozorovania in vivo od pacientov zúčastňujúcich sa na klinických štúdiách jasne ukázali, že vektory založené na Ad môžu indukovať silnú imunitnú aktiváciu [142, 143], niekedy s fatálnymi následkami [144].

Okrem toho rôzne štúdie uskutočnené in vitro alebo na zvieracích modeloch [145] naznačujú kľúčovú úlohu samotnej vírusovej častice (tj kapsidy a inkorporovanej DNA) pri aktivácii počiatočnej imunitnej odpovede. Tu sa stručne zameriame na imunitné reakcie spojené so vstupujúcim kapsidom; pre hlbší prehľad pozri skôr publikované prehľady [146–149].

2.1. Adenovírusy spúšťajú bunkovú vnútornú imunitu

S vývojom Ads ako vektorov sa ukázalo, že bunková vnútorná alebo vrodená imunita vyvolaná Ads je odpoveďou na invázny virión. Je zaujímavé, že replikatívne aj nereplikatívne vírusy (tj vírusy inaktivované UV žiarením, nereplikatívne vektory alebo prázdne kapsidy) aktivujú imunitné reakcie v infikovaných bunkách, čo ukazuje, že kapsida má v tejto odpovedi kľúčovú úlohu [145,150–156]. .

Vo všeobecnosti sú Ads snímané bunkami v niekoľkých krokoch počas celého životného cyklu vírusu a aktivujú dráhy vrodenej imunity (obrázok 1). Táto aktivácia začína väzbou Ad vlákna na bunkový povrchový receptor CAR, ktorý aktivuje signalizáciu mitogénom aktivovanej proteínkinázy (MAPK), ktorá vedie k aktivácii transkripčného faktora NF-KB. Tento spúšťač vedie k produkcii prozápalových cytokínov (IL-6, IL-8) [157,158]. Avšak v závislosti od druhu Ad môže použitie iných receptorov modulovať silu signálnej kaskády zapojenej do expresie cytokínov [159]. Interakcia medzi vírusovým pentónom a bunkovým integrínom je ďalším spúšťačom imunitnej aktivácie. Štúdia na myších makrofágoch ukázala, že táto väzba aktivuje expresiu IL-1 prostredníctvom motívu RGD [160]. Toto môže byť obmedzené na imunitné bunky, pretože v iných bunkových modeloch (napr. HeLa, línia epitelových buniek) nebola potvrdená úloha interakcie integrín/RGD v produkcii chemokínov a prozápalových cytokínov [151,161,162]. To naznačuje dôležitejšiu úlohu samotného procesu internalizácie pri imunitnej aktivácii ako interakcia s integrínmi. Väzba pentónu na integrín tiež aktivuje signalizáciu fosfoinozitid 3-kinázy (PI3K) na zvýšenie internalizácie vírusu [163].

Okrem toho sa ukázalo, že aktivácia PI3K po infekcii Ad spúšťa produkciu prozápalových cytokínov, ako je TNF [164], a proces internalizácie bol opísaný ako potrebný na aktiváciu imunity [165]. Tieto štúdie naznačujú, že imunitná aktivácia sa vyskytuje hlavne v kroku po internalizácii, čo zdôrazňuje dôležitosť triedenia po vstupe (prehľad v [166]).

Keď sú Ads v endozóme, sú vystavené intraluminálnym receptorom na rozpoznávanie patogénov (PRR), ako je TLR9, čo je senzor dvojvláknovej DNA obmedzený na imunitné bunky. Myšie makrofágy môžu snímať Ad vektory prostredníctvom TLR9, aby vyvolali produkciu prozápalových cytokínov [167]. TLR9 sa tiež striktne vyžadoval na produkciu IFN/, keď boli myšie plazmocytoidné dendritické bunky (pDC) stimulované Ad [168]. Avšak v TLR9 knock-out myších modeloch sa IFN/ stále produkoval, čo naznačuje, že v iných bunkách ako pDC sa produkcia IFN vyskytuje nezávisle od signalizácie TLR9 [168, 169].

Vírusové genómy (alebo vektorové genómy) sa stávajú prístupnými pre snímanie počas alebo po endozomálnom úniku vírusu. Keď sa dostanú do cytosólu, sú snímané cytosolickým senzorom dvojvláknovej DNA cGAS [168,170]. Po rozpoznaní vírusového genómu cGAS podporuje fosforyláciu a jadrovú translokáciu transkripčného faktora IRF3 na riadenie expresie IFN, čo vyvoláva antivírusový stav. Endozomálna pasáž vyžaduje vírusom indukované poškodenie endozomálnej membrány, aby sa uľahčil endozomálny únik vírusových častíc. Prasknutie membrány tak značne prispieva k imunitnej aktivácii, čo je zdôraznené skutočnosťou, že únikový defektný mutant Ts1 nedokáže aktivovať úplnú a účinnú imunitnú odpoveď [161,162,170,171]. Kľúčovú úlohu v zápalovej odpovedi po penetrácii membránou Ad hrá kináza viažuca tank, TBK1, o ktorej sa predpokladá, že je súčasťou downstream cytosolického snímania vírusového genómu prostredníctvom dráhy cGAS/STING [168, 170].

Poškodenie membrány adenovírusu tiež vedie k uvoľneniu katepsínu B z endo-lyzozomálneho kompartmentu, čo spôsobuje oxidačný stres, ktorý aktivuje zápal NLRP3, čo vedie k maturácii IL-1 [114]. Vírusy druhu C unikajú zo skorých endozómov, zatiaľ čo vírusy druhu B sa šíria až do neskorých endozómov, pravdepodobne kvôli rozdielom v používaní receptorov. Acidifikácia v neskorom endozóme/lyzozóme pravdepodobnejšie aktivuje lyzozomálne kyslé hydrolázy. Oba druhy indukujú aktiváciu zápalu zápalu [172], ale rozsah ich odpovedí sa pravdepodobne v dôsledku času pobytu v endozóme líši. Globálne vírusy druhu B indukujú silnejšiu vrodenú a adaptívnu imunitnú aktiváciu ako vírusy druhu C [113,173,174]. To môže vysvetľovať, prečo sú vírusy druhu B patogénnejšie a spôsobujú prepuknutie u imunitne kompetentných hostiteľov [26]. Ďalej naznačuje, že bunky môžu rozlišovať penetračný kompartment (tj endozóm vs. lyzozóm, [109]) a prispôsobiť účinnosť imunity. Poškodenie endozomálnej membrány počas procesu úniku Ad môže byť samo o sebe signálom nebezpečenstva. Ako je podrobne uvedené nižšie, poškodenie membrány vedie k cytosolickej expozícii intraluminálnych glykánov, ktoré bunka deteguje ako nebezpečné signály (ako je uvedené v [109]). Detekcia exponovaných glykánov galektínmi následne aktivuje autofágiu, čím sa spustí druhá vetva antivírusovej imunity [108].

2.2. Adenovírusy vyvolávajú adaptívnu imunitnú odpoveď a podvracajú antivírusovú autofágiu pri vstupe do bunky

Vrodené imunitné odpovede vyvolané Ads alebo ich vektormi sa následne premietnu do adaptívnej imunity prostredníctvom sekrécie chemokínov, ktorá priťahuje imunitné bunky (neutrofily, prirodzené zabíjačské bunky a makrofágy) a posilňuje silnú prezentáciu antigénu [153, 154]. Adenovírusy sú vysoko imunogénne a ich hlavnými imunogénmi sú hlavné kapsidové proteíny (hexón, pentón a vlákno), ktoré spúšťajú druhovo špecifickú produkciu neutralizačných protilátok B bunkami [175–177].

Neutralizačné protilátky sú väčšinou namierené proti hypervariabilným slučkám hexónového proteínu [178–180] a predstavujú hlavné obmedzenie pre použitie Ads ako vektorov odvodených z rovnakého sérotypu. Tento problém bol obídený použitím menej séroprevalentných alebo nehumánnych Ads [181–185]. Napriek tejto antivektorovej imunite, keď sa Ads používajú ako očkovacie platformy (napr. na vyvolanie imunitnej ochrany proti ebole v klinických štúdiách), stále vyvolávajú silnú reakciu B buniek, čo umožňuje produkciu protilátok proti požadovanému imunogénu vakcíny, ktorý môže trvať až 6 mesiacov [186]. Navyše, už existujúcu vektorovú imunitu by bolo možné prekonať vyššími dávkami vakcínového vektora, ako v prípade vakcínového vektora SARS-CoV-2 založeného na vysokej séroprevalencii AdC5 [187].

Rovnako ako v prípade neutralizujúcich protilátok, infekcie Ad spúšťajú pretrvávajúcu imunitu T-buniek, najmä prostredníctvom aktivácie CD4 plus. Túto ochranu možno stále nájsť u dospelých, čo naznačuje dlhotrvajúcu imunitu od detstva [188–190]. Okrem toho je opísaná aj aktivácia CD8 plus na udržanie cytotoxickej odpovede [191–193]. Táto aktivácia T-buniek nie je nevyhnutne sérotypovo špecifická a umožňuje krížovú ochranu proti rôznym podskupinám a sérotypom Ad [192–194].

Okrem toho u pacientov s transplantovanými kmeňovými bunkami infikovaných Ad bola opísaná silná aktivácia CD4 plus a CD8 plus [195]. Táto aktivácia je namierená proti hexónovým peptidom a vedie k odstráneniu Ad virémie, pričom sa zdôrazňuje hlavná úloha aktivácie CD4 plus a CD8 plus T-buniek v imunitnej ochrane. Zatiaľ čo táto imunita založená na T-bunkách je namierená proti častici Ad, Ads tiež spúšťajú silnú bunkovú imunitu založenú na odpovedi T-buniek proti antigénu vakcíny, čo je výhodou pre dlhotrvajúcu imunitu pri použití rekombinantných vektorov Ad ako platforiem vakcín [196,197 ]. Dôležité je, že údaje z klinických štúdií potvrdili, že keď sa Ad použije ako očkovacia platforma (s požadovaným antigénom ako transgénom), indukuje aktiváciu cytotoxických CD8 plus T-buniek a CD4 plus T-buniek, čo vedie k pamäťovej imunite proti exprimovaný transgén [184,186,198-202].

Aktivácia T-buniek závisí od prezentácie vírusových peptidov prostredníctvom hlavného histokompatibilného komplexu (MHC). Stručne povedané, prezentácia antigénu MHC triedy I je výsledkom proteazomálnej degradácie a získané peptidy budú indukovať aktiváciu CD8 plus T-buniek, čo umožní aktiváciu a proliferáciu cytotoxickej T-bunkovej odpovede. Prezentácia antigénu MHC triedy II je výsledkom lyzozomálnej proteolýzy a výsledné peptidy budú po prezentácii indukovať aktiváciu CD4 plus T-buniek, čím sa spustí následná aktivácia B buniek [203]. Teraz je dobre charakterizované, že autofágia podporuje prezentáciu peptidu molekulám MHC triedy II [204]. Nie je prekvapením, že autofágia je jedným z najstarších obranných mechanizmov proti infekcii a dôležitou súčasťou bunkového repertoáru proti inváznym patogénom, pričom sa podieľa na vrodených aj adaptívnych imunitných odpovediach. Môže priamo sekvestrovať patogén na degradáciu (xenofágiu) a podieľa sa na jeho prezentácii imunitnému systému [205–207]. Makroautofágia (bežnejšie nazývaná autofágia) je zachovaná dráha lyzozomálnej degradácie, ktorá sa zúčastňuje mnohých základných fyziologických procesov, ako je homeostáza a vrodená a adaptívna imunita [208–210]. Autofágia je charakterizovaná tvorbou vezikula s dvojitou membránou nazývaného „autofagozóm“, ktorý pohlcuje cytoplazmatické náklady (tj organely, agregáty a patogény) určené na degradáciu (obrázok 2). Počas tohto procesu sa autofagozómy obsahujúce náklad spájajú s lyzozómami, aby sa degradovali a recyklovali.

Prezentácia antigénu prostredníctvom autofágie bola opísaná pre MHC triedy I aj triedy II [204]. Po indukcii autofágie sú intracelulárne antigény pohltené autofagozómami, ktoré sa fúzujú s kompartmentmi obsahujúcimi MHC triedy II, aby im poskytli vonkajší patogénny materiál (obrázok 2) [211]. Úloha autofágie v tejto konkrétnej prezentácii antigénu MHC triedy II bola prvýkrát opísaná pri infekcii vírusom Epstein-Barrovej, kde inhibícia autofágie viedla k zníženiu aktivácie CD4 plus T-buniek [212, 213]. K dnešnému dňu príklady zahŕňajú niekoľko vírusov vrátane vírusu herpes simplex [214], vírusu chrípky [215] a vírusu ľudskej imunodeficiencie typu 1 (HIV-1) [216] a pravdepodobne sa rozširuje na Ads (pozri nižšie). Prezentácia MHC triedy II je v súlade s procesom autofágie, pretože ide o cytosolický obranný mechanizmus. Autofágia sa tiež podieľa na krížovej prezentácii extracelulárnych antigénov MHC triedy II [214]. MHC prezentácia extracelulárneho ovalbumínu je skutočne efektívnejšia, keď je autofagický aparát (a najmä ATG5) funkčný a ukázalo sa, že vychytávanie extracelulárneho materiálu zahŕňa nekanonickú formu autofágie nazývanú LC3-asociovaná fagocytóza ( LAP) [217].

Keď sú niektoré extracelulárne antigény prítomné v LAP-some, môžu byť exponované prostredníctvom prezentácie MHC triedy II [218]. Autofágia sa do určitej miery podieľa aj na prezentácii MHC triedy I, hoci veľká väčšina epitopov je prezentovaná mechanizmom striktne závislým od transportéra asociovaného s komplexom spracovania antigénu (TAP) [219]. Prezentácia nezávislá od TAP sprostredkovaná autofágiou bola doteraz preukázaná iba za podmienok vyčerpania TAP [219, 220]. Ak tento spôsob prezentácie skutočne existuje, zostáva kontroverzné [221] a je diskutované inde [204, 222, 223].

Aby sa zabránilo prezentácii MHC, Ads venuje veľkú časť svojho genómu, konkrétne oblasti E3, na podkopanie systému prezentácie MHC v bunkách [224–228]. Vo väčšine (vakcínových) vektoroch tieto gény chýbajú a nedávna práca naznačuje, že zvýšenie prezentácie antigénu pomocou MHC by mohlo zlepšiť účinnosť vakcíny proti Ad [229,230]. Autofágia hrá kľúčovú úlohu pri spracovaní antigénov Ad na prezentáciu MHC triedy II v imunite indukovanej Ad [108, 229].

Montespan a kol. ukázali, že Ads indukujú autofágiu po penetrácii endozómu a že vstupujúce častice odstránené autofágiou v tomto procese sú účinne prezentované imunitnému systému [108]. Toto pozorovanie je v súlade so štúdiou publikovanou Kleinom a kol. čo ukazuje, že v kontexte onkolytických Ads sú vírusové antigény dozrievané formou autofágie závislou od JNK [229]. Autofágia v kontexte rakoviny však hrá dvojakú úlohu. Autofágia ako strážca homeostázy obmedzuje iniciáciu nádoru [231], zatiaľ čo pri pokročilej rakovine autofágia pôsobí ako proces prežitia na podporu rastu nádoru [232, 233]. V kontexte onkolytických vektorov by sa teda mali starostlivo vyhodnotiť vlastnosti autofágie špecifické pre nádor.

3. Adenovírusy ako (vakcínové) vektory

Vektorizácia vírusu zahŕňa využitie jeho prirodzených vlastností pri súčasnej minimalizácii súvisiaceho biologického rizika. Z tohto hľadiska sú Ads vynikajúcimi vektorovými kandidátmi na vývoj vakcíny [234]. Adenovírusové vektory sú stabilné, ľahko sa vyrábajú s vysokým titrom a majú veľké klonovacie kapacity. To umožňuje inzerciu transgénu, tj expresiu vybraného antigénu. Majú široké spektrum infekčnosti a transdukujú nedeliace sa bunky a ich genóm je neintegratívny [1]. Ako je opísané vyššie, vyvolávajú tiež zápalovú reakciu v bunkách prezentujúcich antigén (APC), ktorá slúži ako adjuvantná funkcia na zosilnenie imunitnej reakcie potrebnej na účinné očkovanie [2,3,142,235,236].

Navyše vektory odvodené od Ad sa vo veľkej miere používajú v predklinických a klinických štúdiách na preukázanie ich bezpečnosti [237, 238]. Aby sa eliminovala nežiaduca časť replikačného cyklu, je potrebné potlačiť replikáciu vírusu, aby sa zabránilo lýze buniek a šíreniu vírusu. Vývoj adenovírusových vektorov sa začal začiatkom 90. rokov minulého storočia ako platforma pre širokú škálu terapeutických prístupov, ako je génová terapia, onkolytické vektory a vývoj vakcín. Väčšina skorého vývoja vektorov boli modifikované verzie vírusov druhu C.

3.1. Vývoj adenovírusových vektorov, generačný prístup

Prvá generácia Ad vektora sa pripravila deléciou oblasti El a E3 z vírusového genómu, najmä kódovaním bezprostredného skorého transkripčného faktora, ktorý bráni replikácii týchto vektorov. Tieto vektory mali klonovaciu kapacitu približne 8 kb na vloženie transgénu s regulačnými sekvenciami [239–241]. Vektory prvej generácie boli produkované v ľudských embryonálnych obličkových bunkách (HEK) stabilne transformovaných časťou vírusového genómu Ad5, ktorý dopĺňa oblasť El in trans [242–247]. Jednou z hlavných nevýhod tohto systému je, že umožňuje rekonštitúciu replikačne kompetentných genómov po spontánnej rekombinácii [248]. Dodatočná delécia E3, ktorá nie je potrebná na produkciu vektora, zväčšuje veľkosť transgénovej kazety [243] a podporuje lepšiu imunitnú odpoveď [240].

Bohužiaľ, Ad vektory prvej generácie neboli úplne transkripčne inertné a stále vyvolávali silnú imunitnú odpoveď proti vírusovým kapsidovým proteínom, ktoré boli exprimované na základnej úrovni [141,249,250]. Táto lentivectorová imunita prispela k vektorovej toxicite a krátkodobej eliminácii transdukovaných buniek [145]. Druhá generácia Ad vektorov mala navyše oblasti E2 a E4 odstránené z vektorového genómu. E2 kóduje replikačné enzýmy a ďalšie regulačné proteíny E4 [251–253]. To umožnilo priestor pre 10,5 kb transgénových sekvencií, vrátane až štyroch expresných kaziet [254]. Podobne doplnkové delécie silne znížili nežiaducu rekombináciu a predĺžili expresiu transgénu [255]. Bolo to pravdepodobne výsledkom zníženej aberantnej vírusovej génovej expresie, ktorá ďalej znižuje anti-vektorovú imunitu [141,250,251]. Adenovírusové vektory tretej generácie sú koncepčne odlišné. Pozostávajú zo zbaleného vektorového genómu a nezbaleného vírusového genómu (pomocný vírus), ktorý produkuje vektorové častice. Takéto vektory sú tiež známe ako "pomocné závislé", "gutless" alebo "vysokokapacitné" (HC-Ad) vektory. Majú najvyššiu možnú klonovaciu kapacitu a môžu niesť sekvencie s veľkosťou až 36 kb [256–258]. Vysokokapacitným Ads chýba akákoľvek vírusová kódujúca sekvencia okrem ITR a krátkeho enkapsidačného signálu, ktorý umožňuje balenie genómu a ktorý chýba v pomocnom víruse [259–262]. Táto stratégia nám umožnila konečne prekonať väčšinu anti-vektorovej imunity, čo umožňuje dlhodobú expresiu transgénov [263–267]. HC-Ads však nie sú súčasťou súčasného repertoáru vakcínových vektorov.

3.2. Adenovírus ako vektor vakcíny

Pred skúmaním toho, ako boli vektory Ad využívané, je potrebné spomenúť, že vakcinácia proti vírusom Ad druhu B typu 4 a typu 7 samotným bola vyvinutá začiatkom 70. rokov 20. storočia [268]. Táto orálna živá vakcína je povinná od roku 2011 pre vojenských regrútov v USA a dramaticky znížila mieru infekcie, ktorá dosahuje prakticky nulu [269–271]. To zvýraznilo vnútornú účinnosť a bezpečnosť Ads ako vakcíny a otvorilo pole pre využitie Ads ako očkovacej platformy. K dnešnému dňu vstúpilo do klinických skúšok viac ako 200 vakcín na báze Ad [272]. Mnohé z nich sú namierené proti infekčným patogénom, ako sú HIV{10}} a Ebola [230,273,274]. Vakcíny na báze adenovírusov nie sú bez nevýhod. Nedávno vyvinutá anti-HIV vakcína, založená na druhu C vírusu Ad5, používala zmes vektorov exprimujúcich HIV-1 gény gag, pol a nef [275,276]. Vektory boli bezpečné, imunogénne a dobre tolerované. Žiaľ, výsledná klinická štúdia STEP musela byť predčasne zastavená [277–279]. Nielenže sa ukázalo, že táto vakcína nechráni pred infekciou HIV, ale epidemiologické údaje naznačujú, že očkovanie Ad v tomto prípade zvyšuje riziko infekcie HIV [280–282]. Preexistujúca imunita proti Ad5 bola identifikovaná ako potenciálny postvakcinačný rizikový faktor [283,284]. Toto pozorovanie sa však v podobných štúdiách nepotvrdilo [285,286] a zostáva mechanicky nejasné [287,288]. Okrem HIV boli v boji proti Ebole (Ad-EBOV), opakujúcej sa hrozbe v západnej Afrike, vyvinuté vektorové vakcíny založené na Ad [289]. Všetky vakcíny Ad-EBOV používajú ako antigén vakcíny glykoproteín Ebola (GP). Počiatočné predklinické štúdie na hlodavcoch a primátoch používali Ad5 a preukázali ochranu počas 3 mesiacov s produkciou neutralizujúcich protilátok a aktiváciou CD8 plus [273, 290 – 292]. Táto vakcína prešla fázou II klinického skúšania; avšak už existujúca imunita voči Ad5 vo očkovanej populácii viedla k variácii v hladine vyvolaných neutralizujúcich protilátok [293–297]. Na prekonanie tohto problému boli vyvinuté vakcíny založené na menej rozšírenom druhu D Ad26 [186,298,299].

Ad26 je však u ľudí menej imunogénny, čo má za následok zníženú účinnosť vakcinácie a vyžaduje si primárnu dávku pomocou vakcíny na báze vírusu osýpok (MVA). Tento vakcinačný režim dosiahol fázu III klinických skúšok [289 300 301]. Vo vývoji je aj použitie nehumánnych Ad vektorov [184]. Použitie šimpanzej ChAd3 ako očkovacej platformy proti EBOV preukázalo ochranu u hlodavcov a šimpanzov [302,303] a klinické štúdie využívajúce tieto vektory sú v rôznych štádiách pokroku [17,300,301,304–306].

Až donedávna boli vakcíny proti HIV{0}} a EBOV dva hlavné príklady aplikácie vakcín založených na vektore Ad, ale nie sú jediné. Uskutočnili sa rôzne pokusy použiť vektory vakcín Ad proti rôznym patogénom, ako je Mycobacterium tuberculosis [307 – 310], vírus dengue [311 – 313], hepatitída B a C [314 – 320], besnota [321 – 324] alebo chrípka. [325 – 328]. Ich účinnosť však bola vždy pod očakávaniami (podrobnejšie pozri [18,142,300,329]). Kandidát na vakcínu EBOV zostal jedinou prakticky používanou vakcínou proti Ad a používa sa s určitými obmedzeniami v Konžskej demokratickej republike. Táto vakcína je založená na type Ad26 (Ad26-ZEBOV/MVA-BN-FILO) a k máju 2020 dostalo prvú dávku očkovania 20 339 ľudí a 9 560 bolo plne zaočkovaných [230 301 330].

Adenovírusom vektorizované vakcíny získali veľkú podporu verejnosti v reakcii na pandémiu SARS-CoV-2. Naliehavosť situácie umožnila zúročiť ich vývoj vrátane skúseností získaných s vakcínami proti koronavírusom, ktoré spôsobili predchádzajúce regionálne obmedzené prepuknutia SARS-CoV-1 [331]. Koronavírusový spike (S) glykoproteín bol identifikovaný ako najlepší vakcinačný antigén pre imunitu voči koronavírusovým infekciám [332,333]. K dnešnému dňu sú štyri vakcíny Ad vektor, všetky kódujúce hrotový antigén, v pokročilom stave a boli povolené na núdzové použitie vo veľkých častiach sveta. Aplikované vektorové stratégie boli mierne odlišné, ale v podstate zahŕňajú použitie vektorov prvej generácie. Zahŕňajú použitie vektorov založených na Ad5-druhu C (Ad5-nCoV), prekonanie už existujúcej imunity vysokou dávkou vektora (CanSino) [187 334] až po použitie menej rozšíreného vírusu druhu D Ad26 s použitím stabilizovaného vrcholového glykoproteínu (JNJ-78436735/Ad26.COV2.S) [335]. Alternatívny prístup využíva ChAdOx1-S-(AZD1222), Ad vektor od šimpanzov [336,337]. Jediná používaná vakcína založená na heterológnej prime-boost stratégii na prekonanie vektorovej imunity (Gam-COVIDVac/Sputnik V) aplikuje najprv vektor založený na Ad{26}}a potom v posilňovacej injekcii používa vektor Ad5 [338,339]. Vo všetkých prípadoch boli údaje z klinických skúšok veľmi sľubné a ukázali vysoké úrovne indukovanej ochrannej imunity a v niekoľkých krajinách bolo povolené núdzové použitie vakcín na báze Ad. Okrem toho epidemiologické prieskumy prebiehajúcich očkovacích kampaní v rôznych krajinách naznačujú obrovský úspech pri používaní vakcín proti SARS-CoV-2 na báze reklamy.

4. Modulácia účinnosti vektora adenovírusu (vakcíny), kapsid vedie cestu

Návrh vektora adenovírusu (vakcíny) musí brať do úvahy niekoľko faktorov. Tieto zahŕňajú udržiavanie dlhej a trvalej expresie kódovaného antigénu a aktiváciu imunologického kontextu (adjuvantný účinok), ktorý umožňuje účinnú transláciu expresie antigénu do pretrvávajúcej adaptívnej imunity namierenej proti imunogénu, ale nie proti samotnému vektoru. Imunologický kontext poskytuje prirodzená imunitná aktivácia, ktorú vakcinačný vektor vyvoláva počas podávania. V tomto kontexte je dôležitá účinnosť, s akou vrodené imunitné senzory detegujú vektor, a bude zase určovať amplitúdu adaptívnej odpovede. Ako je opísané v častiach vyššie, vrodené imunitné snímanie prebieha hlavne na úrovni po vstupe, súčasne s penetráciou endozómu Ad. Účinná expresia (vakcínového) antigénu potom závisí od rovnováhy medzi úrovňou klírensu vektora vs. úspešným dodaním a expresiou vektorových genómov do jadra. S vývojom kapsidových displejových vektorov nie je expresia transgénu potrebná na vyvolanie imunitnej aktivácie. Táto stratégia je založená na inzercii požadovaného epitopu do kapsidových proteínov Ad, čo umožňuje jeho priame vystavenie imunitnému systému. Aj keď má tento prístup určité výhody, väčšina vakcinačných vektorov sa spolieha na geneticky kódované gény. Ďalšie informácie o vektoroch kapsidového displeja nájdete v týchto recenziách [340 341].

Preexistujúca imunita proti vírusovému vektoru (napr. 30–90 percent proti vírusu druhu C Ad5, v závislosti od geografickej polohy) môže znížiť vychytávanie vektora a znížiť expresiu antigénu a výslednú imunitnú odpoveď (342–344). Na zníženie antivektorovej imunity bolo vyvinutých niekoľko stratégií, ktoré boli nedávno preskúmané [249]. Stručne povedané, neutralizačné protilátky rozpoznávajú hlavne hypervariabilnú slučku exónov a v dôsledku toho sú sérotypovo špecifické [178–180]. Tieto hypervariabilné slučky môžu byť preto nahradené slučkami iného, ​​menej prevládajúceho sérotypu [178,345]. Tým sa zabráni neutralizácii a inaktivácii vektora. Keďže Ad5 je najséroprevalentnejší typ, použitím zriedkavých sérotypov, ako sú Ad26, Ad35 alebo iné ako ľudské Ads, by sa tomuto problému dalo vyhnúť [177,346–350].

Avšak hlavnou nevýhodou použitia zriedkavých typov je ich nižšia imunogenicita, ktorá ich robí menej účinnými, pokiaľ ide o vývoj vakcíny [298]. Preto by sa stratégie na zníženie anti-vektorovej imunity mali vyvíjať paralelne so stratégiami na zvýšenie imunogenicity vektora, aby sa získal najúčinnejší vektor. Aj keď je počiatočná hladina neutralizačných protilátok proti vektoru nízka, očkovanie daným typom vektora môže vyvolať reakciu, ktorá zabráni jeho budúcemu použitiu. Priming anti-vektorovej odpovede tiež prebieha na post-entry úrovni, keď sú vektorové častice triedené a spracované ako samotné antigény. Vyvolanie imunologicky priaznivého kontextu pre úspešnosť vakcinácie môže prísť na úkor zvýšeného primovania vektorovej imunity. Pochopenie parametrov, ktoré určujú osud Ad vektorov po absorpcii, môže poskytnúť príležitosť pre návrh vektorov.

4.1. Stabilita spočíva v druhu

Receptorom sprostredkované vychytávanie a únik z endo-lyzozomálneho kompartmentu sú charakteristické znaky infekcie Ad a vektorovej transdukcie. Počiatočné vychytávanie je určené interakciou molekúl vírusového vlákna a pentónu s bunkovými receptormi. Vláknina a pentón sú spoločné pre všetky Ads, ale podľa ich druhu sa zapájajú do rôznych bunkových receptorov (tabuľka 1). Vírusy druhu C využívajú CAR a vstupujúce častice unikajú zo skorého endozomálneho kompartmentu [79]. Ak sú vírusy druhu C (Ad5) skonštruované tak, aby obsahovali molekulu vlákna z vírusu druhu B (Ad16), výsledná častica (Ad5F16) potom unikne z lyzozomálneho kompartmentu (ako je ukázané farbením lyzozomálnym markerom LAMP1) namiesto skorého endozóm [351]. Tento oneskorený únik z lyzozómov je vlastnosť zdieľaná so všetkými testovanými vírusmi druhu B [111,352,353].

Okrem toho hybridný Ad5F16, ako aj vírusy druhu B vyvolávajú silnejšiu prozápalovú odpoveď ako vírusy druhu C [159, 351]. To sa pripisuje zvýšenej detekcii prostredníctvom intraluminálneho TLR9 v imunitných bunkách [354]. Okrem toho, poškodenie lyzozomálnej membrány, na rozdiel od skorého poškodenia endozómu, spôsobuje silný oxidačný stres. Roztrhnutie lyzozómu súčasne uvoľňuje lyzozomálne hydrolázy, ako je katepsín B, ktoré môžu poškodiť mitochondrie, čím sa zosilňuje reakcia na poškodenie prostredníctvom aktivácie zápalu [355–357]. Proces vychytávania Ad destabilizuje kapsidu, čo umožňuje uvoľnenie vírusového proteínu VI [103,106]. Uvoľnený proteín VI potom preniká membránou zvnútra endo-lyzozomálneho kompartmentu, aby umožnil vírusu získať prístup k cytosolu. Porovnanie druhov C a B ukazuje, že obidva vírusy sú rovnako účinné pri vstupe do cytosolu a dodaní genómu, ale líšia sa v kinetike úniku [111]. Skutočnosť, že jednoduchá výmena vlákna môže preniesť vstupné a imunogénne vlastnosti z vírusu druhu B na vírus druhu C, je pozoruhodná. Poskytuje dôkaz koncepcie, že možno navrhnúť hybridné vektory so špecifickými vlastnosťami. Zdá sa, že základný rozdiel spočíva v tom, že uvoľňovanie proteínu VI je oneskorené vo vírusoch druhu B (alebo hybridnom víruse) a môže vyžadovať buď okyslenie alebo iný neznámy spúšťač rozkladu.

Pretože uvoľňovanie proteínu VI je v tomto prípade oneskorené, mohlo by to odrážať zvýšenú stabilitu kapsidy. Skutočne sa ukázalo, že vírusy Ad5 druhu C uvoľňujú molekulu vlákna po naviazaní bunky, čo je krok, o ktorom sa predpokladá, že oslabí kapsidu a spustí proces rozkladu na uvoľnenie proteínu VI. V tomto kontexte sa ukázalo, že Ad5 bez vlákien je menej stabilný ako prirodzené častice [358]. Naopak, nevyzreté, hyper stabilné Ts1 Ad2/5 neuvoľňujú vlákninu ani proteín VI a sú slabými induktormi zápalu, pretože nespúšťajú TLR9 ani nespôsobujú poškodenie membrány [114,138,359,360].

Či zámena vlákna s druhom B zabraňuje počiatočnému uvoľneniu vlákna a robí kapsidu druhu C stabilnejšou, nebolo skúmané, ale je pravdepodobné. Stabilita kapsidy môže byť základným determinantom osudu kapsidy po vstupe a v rozšírení aj vlastnosťou, ktorú je možné využiť na návrh vektorov. Vírusy druhu B môžu byť stabilnejšie vďaka použitiu iného receptora alebo vďaka jedinečnej interakcii vlákno-pentón. Na rozdiel od toho vírusy Ad40/41 druhu F infikujú gastrointestinálny trakt a majú zvýšenú stabilitu kapsidy v dôsledku ich tropizmu a ich adaptácie na drsné prostredie čriev [24, 361]. Črevo má vnútornú teplotu, ktorá je niekoľko stupňov nad hornými dýchacími cestami, na ktoré sa zameriavajú vírusy druhu C (37 ◦C vs. 33 ◦C) [362]. Ad40/41 sú teda vo svojej podstate termostabilnejšie, podporujú proces infekcie [24], čo sťažuje ich šírenie [24,361,363].

Okrem toho im chýba RGD motív v molekule pentónu, čo vedie k ďalšiemu zníženému vstupu do bunky [92]. Nie je známe, či sa tieto jedinečné vlastnosti kapsidy premietnu do úniku z lyzozomálneho kompartmentu alebo čiastočného rozkladu/defektov uvoľnenia proteínu VI pri vstupe. Naopak, tieto vlastnosti môžu poskytnúť kontext pre vývoj aplikácií orálnych vakcín. Na rozdiel od vlákien druhu B majú vektory obsahujúce vlákna druhu F zníženú imunitnú aktiváciu [364], keď sa aplikujú na štandardné podmienky prostredia. Ak je teraz daný ľudský druh Ad vytrhnutý z kontextu a použitý ako očkovací vektor, mohlo by byť užitočné pozrieť sa na prirodzený tropizmus tohto vektora a hľadať stopy na predpovedanie jeho správania. V súčasnosti používaný vakcinačný vektor založený na Ad26 je vírus druhu D a jeho prirodzeným tropizmom sú oči a gastrointestinálny trakt (365). Vírusy druhu D vrátane Ad26 sú menej imunogénne ako Ad5 [366] a ukázalo sa, že smerujú do neskorého endozomálneho kompartmentu, čo pravdepodobne zahŕňa oneskorené uvoľňovanie proteínu VI.

V dôsledku toho blokovanie acidifikácie neskorého endozomálneho kompartmentu ďalej znížilo jeho imunogenicitu [113]. Na rozdiel od ľudských Ads sú znalosti o nehumánnych Ads používaných aj pri očkovaní a vektorizácii veľmi obmedzené. Reklamy odvodené od šimpanzov vrátane ChAd3 úzko súvisia s vírusmi druhu D [367, 368]. Je zaujímavé, že vektory Ad5 sú viac imunogénne ako vektory Ad odvodené od šimpanzov a majú vyšší transdukčný potenciál. Toto pozorovanie nesúviselo s rozdielmi v pentónovom RGD motíve alebo vlákne a jeho mechanický dôvod zostáva neznámy [369]. Potenciálne rozdiely v stabilite kapsidy neboli skúmané. Ďalšou nehumánnou reklamou využívanou ako vektor je psia reklama typu 2 (CAV-2). Tento vektor má pozoruhodnú vlastnosť selektívne transdukovať neuróny, ale nie obklopujúce gliové bunky, na rozdiel od kontrolného vektora Ad5, napriek tomu, že oba vektory používajú rovnaký receptor [370–372]. Táto schopnosť môže byť spojená so zvýšenou stabilitou kapsidy, čo umožňuje odkrytie iba v neurónových bunkách. Psy majú telesnú teplotu o ~2 ◦C vyššiu ako ľudia, čo potenciálne vedie k zvýšenej stabilite CAV-2 kapsidy [373], podobne ako vírusy druhu F. CAV-2 slabo vyvoláva vrodenú imunitnú odpoveď, čo je v súlade s nedostatočnou efektívnou demontážou v cieľových bunkách [372]. CAV2 vektory teda môžu byť ďalším príkladom, kde biofyzikálna vlastnosť spojená s jeho prirodzeným tropizmom alebo hostiteľom má potenciál poskytnúť nové vlastnosti vektora.

4.2. Jemné doladenie kapsidovej štruktúry, príklad proteínu VI v druhu C Ad2/5

Ak stabilita kapsidy a uvoľňovanie proteínu VI určujú ďalší osud vírusovej kapsidy, vzniká otázka, či to možno modifikovať v Ad vektoroch, tj prisúdiť vírusovým vektorom nové vlastnosti (obrázok 3). Väčšina našich vedomostí o tom, ako Ads prenikajú do endo-lyzozomálneho kompartmentu, pochádza z vírusov druhu C Ad2/5. Objav proteínu VI ako membránového lytického faktora bol nevyhnutný na pochopenie tohto procesu [103,106]. Proteín VI kóduje N-koncovú amfipatickú špirálu, ktorá je skutočnou membránovou lytickou časťou proteínu. Počas produkcie vírusu sa proteín VI exprimuje ako prekurzorový proteín, ktorý sa spája s hexónovými trimérmi prostredníctvom amfipatickej špirály [42,374]. Komplex je importovaný do jadra prostredníctvom transportných signálov kódovaných na N- a C-konci proteínu VI, ktoré sú odstránené počas zostavovania vírusu a dozrievania vírusovou proteázou. C-koncový peptid s 11 aminokyselinami tiež aktivuje proteázu, čím poskytuje inteligentný spôsob spojenia vírusovej zostavy s tienením amfipatickej špirály. Mutantný vírus Ts1 Ad2/5 má defekt balenia proteázy a žiadny z kapsidových proteínov, vrátane proteínu VI, nie je spracovaný. Výsledné častice sú hyperstabilné, zadržiavajú vlákna a neuvoľňujú proteín VI.

V dôsledku toho sa častice Ts1 triedia do lyzozómov po endocytóze sprostredkovanej receptorom. Presná lokalizácia proteínu VI v zrelom víruse nie je jasná, ale odštiepený N-koniec sa lokalizuje na vnútorný hexónový povrch peripersonálnych exónov [37,104,375]. Ukázalo sa, že dve bodové mutácie v proteíne VI, G33A a S28C zvyšujú stabilitu kapsidy Ad5 (obrázok 3A) [376, 377]. Prvý mutant predchádza miesto štiepenia N-koncovej proteázy v proteíne VI a zhoršuje spracovanie. Výsledné častice sú čiastočne nezrelé a sú charakterizované defektom lýzy endozómu, čo naznačuje, že N-koniec proteínu VI stabilizuje interakcie proteín-proteín vo vnútri viriónu [376]. Druhý mutant bol vybraný pre svoju schopnosť vytvárať intramolekulárne disulfidové mostíky [377].

Vírus obsahoval čiastočne nespracované proteíny, potenciálne vrátane proteínu VII, ale prekvapivo nevykazoval žiadne defekty infekčnosti, napriek jeho zvýšenej stabilite. Nie je známe, či niektorý z vírusov má zmenený profil imunitnej aktivácie. Ďalšou bodovou mutáciou proteínu VI, ktorá ovplyvňuje osud vírusu, je mutácia proteínu VI L40Q, ktorá sa nachádza priamo v amfipatickej špirále (obrázok 3A) [378, 379]. Vírusy s touto mutáciou normálne dozrievajú, ale sú čiastočne defektné pre krok lýzy endozómu. Na rozdiel od vyššie uvedených mutantov sú virióny L40Q menej stabilné ako ich náprotivky divokého typu. Namiesto oneskorenia sa proteín VI a pentón uvoľňujú predčasne z kapsidy L40Q. Virióny L40Q sú menej infekčné a podliehajú čiastočnému triedeniu lyzozómov. Mutácia L40Q však úplne nezruší lýzu membrány a niektoré vírusy uniknú do cytosólu, čo vedie k celkovo približne štvornásobne zníženej infekčnosti vektora L40Q [379, 380]. Pozorovania naznačujú, že amfipatická špirála prispieva svojou interakciou k stabilite častíc. Nie je známe, či a ako mutácia L40Q mení imunogénne vlastnosti vektorov Ad5. Nedávne pozorovania naznačujú, že uvoľňovanie proteínu VI z kapsidy je spustené vnútornou konkurenciou s proteínom VII o rovnaké alebo prekrývajúce sa väzbové miesta v exónoch [375].

Mutantnému vírusu bez proteínu VII sa konzistentne nedarí uniknúť z endozómu a má defekt v lýze endozómu [58]. Ďalšie pochopenie štrukturálnej a dynamickej organizácie vnútornej kapsidy (tj proteín VI) a jadrových proteínov (tj proteín V a VII) v častici a počas bunky, vstup značne pomôže pochopiť, čo určuje (reverzibilnú) stabilitu kapsidy.

Riadenie účinnosti imunitnej aktivácie Ad vektorov je hlavným záujmom vývoja vakcín a rozšírenie MHC prezentácie antigénov by zlepšilo vývoj vakcín [381]. Ako už bolo spomenuté, autofágia reguluje imunitnú aktiváciu a dodáva peptidy do MHC. Autofágia je jedným z najstarších mechanizmov bunkovej obrany proti infekcii, ale Ads, ako adaptované ľudské patogény, si nevyvinuli mechanizmy, ktoré by zabránili autofágii pri vstupe. Namiesto toho sa zdá, že prijímajú aktiváciu autofágie a presúvajú zodpovednosť na podporu infekcie. Proteín VI hrá ústrednú úlohu pri riadení autofágovej reakcie bunky. Lýza membrány adenovírusu proteínom VI vedie k náboru galektínu 3 a galektínu 8, ktoré bunka rozpoznáva ako nebezpečné signály (obrázok 3B) [108,109,382]. Detekcia miest prieniku Ad galektínmi aktivuje selektívnu autofágiu v infikovanej bunke, ako to ilustruje nábor autofágových receptorov (napr. NDP52 ap62) a tvorba LC3 punctae [108].

Je zaujímavé, že vektorovým časticiam Ad5 sa podarí uniknúť z prasknutého endozómu a môžu sa dostať do jadra. Inhibícia autofágie neovplyvňuje vírusovú infekčnosť, ale oneskoruje dodanie ich genómu do jadra, čo ukazuje, že Ads unášajú bunkový mechanizmus pre svoj zisk [108]. Únik z endozómu preto umožňuje vírusu vyhnúť sa degradácii autofágiou prostredníctvom aktívneho procesu. Tento proces objavil ešte ďalší mutant proteínu VI, mutant M1. Všetky ľudské Ads (a niekoľko nehumánnych Ads) kódujú vysoko konzervovaný PPxY peptidový motív v proteíne VI. V mutante M1 bol tento motív zmenený na PGAA (obrázok 3) [104]. Divoký typ aj mutant M1 účinne uvoľňujú proteín VI po vstupe a spúšťajú autofágiu po pretrhnutí endozomálnej membrány. Mutantný vírus M1 však nie je schopný účinne uniknúť do cytosolu a EM snímky ukázali, že mutantné vírusy M1 sú zachytené v roztrhnutých endozómoch, na ktoré sa zameriava autofágia.

V dôsledku toho sa ukázalo, že mutantný vírus M1 má silný defekt infekčnosti, ktorý sa obnoví po farmakologickej a genetickej inhibícii autofágie. Štúdia ukázala, že vírusy divokého typu využívajú svoj motív PPxY na nábor ubikvitín ligázy NEDD4.2 a obmedzujú dozrievanie autofagozómov dostatočne dlho na to, aby unikli do cytosólu. Okrem toho táto vlastnosť umožňuje vírusu obmedziť svoju antigénnu prezentáciu [108]. Dôležité je, že mutantný vektor M1 injikovaný myšiam viedol k oveľa silnejšej anti-vektorovej imunite a zníženej CD8 plus reakcii na kódovaný transgén, čo ukazuje, že jednoduchá zmena kapsidy môže mať zásadný vplyv na imunogenicitu kapsidy Ad5. Nie je známe, či niektorá z ďalších mutácií proteínu VI ovplyvňuje imunogenicitu. Prítomnosť motívu PPxY vo víruse L40Q však môže vysvetliť, prečo si vektor zachováva relatívne vysokú infekčnosť napriek defektu lýzy membrány [379, 380]. Pretože lýza endozómov je menej účinná a vektory L40Q končia čiastočne v lyzozomálnom kompartmente, je možné, že vyvolaná imunitná reakcia sa ešte líši od kapsidov divokého typu, Ts1 alebo M1 Ad5.