Biochemické a histopatologické reakcie Biomphalaria Alexandrina na RIPEX (regulátor rastu rastlín)Ⅰ

Abstraktné

Pozadie

Rastové regulátory rastlín sú široko používané v poľnohospodárstve na zvýšenie rastu a dozrievania rastlín, ale ohrozujú vodný ekosystém. Súčasná štúdia hodnotila účinok subletálnej expozície RIPEX 48-percentným koncentráciám EC (8 a 16 µL/l) na parametre oxidačného stresu, pohlavné hormóny, enzýmy imunitného potenciálu, rozdielne počty hemocytov a histopatológiu tráviacich žliaz a ovotestes v Biomphalaria alexandrina slimáky.

Kliknite pre cistanche herba pre testosterón

Výsledky

Expozícia RIPEX spôsobila celkové zvýšenie aktivít superoxiddismutázy a glutatión-S-transferázy u B. Alexandrina. Avšak extrémna expozícia RIPEX inhibuje aktivitu SOD u slimákov. Aktivita malondialdehydu ukázala zvýšenie B. Alexandrina vystaveného obom koncentráciám po všetkých expozičných obdobiach. RIPEX tiež spôsobil významné zvýšenie testosterónu u slimákov vystavených koncentrácii 16 µl/l, znížil však hladiny hormónov u slimákov vystavených 8 µl/l po 7 dňoch. Čo sa týka estradiolu, došlo k významnému zvýšeniu po 3 dňoch expozície 16 µl/l a 7 dňoch expozície 8 µl/l. Expozícia prípravku RIPEX tiež zvýšila aktivity enzýmov myeloperoxidázy a adenozíndeaminázy v tráviacich žľazách slimákov. Zvýšil celkový počet hemocytov exponovaných slimákov, ako aj počet granulocytov. Tráviace žľazy slimákov a ovotestes vykazovali patologické zmeny po 7 dňoch expozície RIPEXu.

Závery

Tieto zistenia naznačujú, že RIPEX je toxický pre B. Alexandrina a že tento slimák možno použiť ako bioindikátor kontaminácie životného prostredia regulátormi rastu rastlín.

Kľúčové slová

Biomphalaria alexandrina, RIPEX, testosterón, estradiol, myeloperoxidáza, adenozíndeamináza, histopatológia

1 Pozadie

Agrochemické znečistenie povrchových vôd predstavuje rastúci celosvetový environmentálny problém, najmä v oblastiach, kde sa poľnohospodárstvo rýchlo rozširuje a zintenzívňuje. Rôzne syntetické chemikálie, ako sú pesticídy alebo hnojivá, sa používajú na úpravu množstva a kvality plodín, aby uspokojili potreby zákazníkov [7, 40]. Promótory rastu rastlín sú bežné agrochemikálie v mnohých krajinách [18].

Keď sú tieto chemikálie priamo vdychované alebo konzumované s kontaminovanou zeleninou, poškodzujú ľudské zdravie [39]. Organofosforový pesticíd, etefón (2-chlóretylfosfónová kyselina) je syntetická chemikália uvoľňujúca etylén, ktorá sa bežne používa ako regulátor rastu rastlín (PGR) na podporu indukcie plodov, dozrievania ovocia a iných fyziologických reakcií. Je schválený na použitie na rôznych potravinách, krmivách, nepotravinárstve, v skleníkoch a okrasných rastlinách pestovaných vonku [3, 50]. Laboratórne hodnotenie toxicity etefónu ukázalo, že etefón vyvolal morfometrické malformácie druhej antény, zmyslových štetín, chvostovej chrbtice a rostrum Daphnia magna, čo viedlo k strate funkcie a smrti [54].

Abd-El Azeem [1] zaznamenal zníženie rýchlosti rastu, poškodenia DNA a apoptotických účinkov v bunkách tráviacej žľazy slimáka Deroceras reticulatum po vystavení etefónu. Mnoho autorov schválilo toxicitu Ethephonu na potkany a vtáky [2, 17, 55]. Okrem toho expozícia etefónu spôsobila genotoxicitu, oxidačný stres a reprodukčnú toxicitu u myší [16]. Teratogenita a dysfunkcia gonádového systému u myší sú tiež spojené s expozíciou etefónu [2, 16]. Ethephon sa tiež ukázal ako imunotoxický, má mutagénne účinky [26], zvyšuje oxidačný stres a znižuje koncentrácie deoxyribonukleových a ribonukleových kyselín [4].

Etefón vo vodných útvaroch môže ohroziť vodnú faunu; údaje o jeho vplyve na vodné organizmy sú však obmedzené. Na detekciu rastových hormónov rastlín vo vodných systémoch sa použilo niekoľko vodných druhov. S niektorými z týchto organizmov je však náročné manipulovať a udržiavať ich v laboratóriu, čo sťažuje ich použitie pri ekotoxikologických hodnoteniach [54]. Vodné mäkkýše, vrátane slimákov, si nedávno získali pozornosť ako testovacie organizmy kvôli potrebe vývoja modelov bezstavovcov na environmentálne monitorovanie vodných kontaminantov [21, 45]. Slimáky sú najrozšírenejšou skupinou mäkkýšov vo vodných systémoch. Slimáky predstavujú menej vykorisťovateľskú alternatívu k vyšším stavovcom ako bioindikátorom, pretože sa dajú použiť v rôznych experimentoch bez etického schválenia a ich získanie a údržba sú lacné [13].

V tomto ohľade sa slimák Biomphalaria alexandrina široko používa ako indikátorový organizmus znečistenia sladkej vody pesticídmi [29, 30]. Okrem svojho potenciálu ako bioindikátora pôsobí tento slimák ako medzihostiteľ pre prenos Schistosoma mansoni [35]. Preto agrochemické koncentrácie v prostredí môžu ovplyvniť prenos schistosomiázy prostredníctvom priamych a nepriamych účinkov na medzihostiteľa a hustotu parazitov [27]. Toto vyšetrovanie sa zameralo na skúmanie vplyvu subletálnej expozície regulátoru rastu rastlín, RIPEX 48 percent EC (obchodný názov ethephon, 2-chlóretylfosfónová kyselina) na rôzne biochemické, imunologické a histologické aspekty B. alexandrina slimáky ako bioindikátor organizmu.

2 metódy

2.1 Testovací organizmus

Slimáky Biomphalaria alexandrina boli zozbierané z jazera Manzalah v El-Matareya, Dakahlia Governorate, Egypt (31 stupňov 11′ N 32 stupňov 2′ E) a udržiavané v dobre prevzdušnenej vode z vodovodu pri konštantnej teplote 20 stupňov . Denne ich kŕmili čerstvými listami šalátu. Po udržiavaní počas 4 týždňov v laboratórnych podmienkach sa v nasledujúcich experimentoch použili zdravé zrelé slimáky (priemer ulity 10–12 mm).

2.2 Experimentálny materiál a podmienky expozície

Regulátor rastu rastlín RIPEX (forma roztoku obsahujúca 48 percent etefónu [2- kyseliny chlóretylfosfónovej (C2H6ClO3P)] a 52 percent inertných zložiek) bol zakúpený od Chema Industries (mesto New Nubaria, Behira, Egypt; registračná licencia č. 1840). Pripravila sa séria koncentrácií. Boli vystavené repliky stromov s desiatimi slimákmi. Po 1-dni expozície boli mŕtve slimáky spočítané a odstránené a LC50 a LC90 boli vypočítané štatistickým softvérom spoločenských vied (SPSS; IBM Corp. Armonk, NY, USA).

2.3 Experimentálny dizajn

Boli použité dve subletálne koncentrácie reprezentujúce LC10 a LC20 (8 a 16 µL/L). 90 slimákov bolo rozdelených do troch skupín, každá skupina s tromi replikátmi (desať slimákov/replikácia): kontrolná skupina, skupina vystavená 8 ul/l a skupina vystavená 16 ul/l. V 1-, 3- a 7-denných intervaloch sa v tráviacej žľaze hodnotili biomarkery oxidačného stresu a enzýmy imunitného potenciálu. steroidné hormóny boli hodnotené v Ovotestis. Hodnotil sa diferenciálny počet hemocytov a histológia tráviacich žliaz a ovotestes. Na biochemické vyšetrenia sa 0,5 g tkaniva (tráviace žľazy alebo ovotestis) z každej skupiny homogenizovalo v 0,5 ml fosfátového tlmivého roztoku (pH 6,5) pomocou skleneného homogenizátora a centrifugovalo sa pri 10,000×g, 4 stupňoch počas 10 minút . Výsledné supernatanty sa použili na následné testy.

2.4 Stanovenie markerov oxidačného stresu

2.4.1 Superoxiddismutáza (SOD, EC 1.15.1.1)

Aktivita SOD bola stanovená pomocou EnzyChrom™ Superoxiddismutase Assay Kit (kat. č.: ESOD{{0}}; BioAssay Systems, Hayward, CA, USA) podľa pokynov výrobcu. Tkanivový homogenát s použitím studeného lyzačného pufra (50mM fosforečnan draselný, 0,1mM EDTA a 0,5% Triton X-100) sa centrifugoval pri 12,000g počas 5 minút pri 4 stupňoch a supernatant sa odobral na stanovenie SOD [43]. Aktivita SOD sa merala pri optickej hustote (OD) pri 440 nm.

2.4.2 Glutatión-S-transferáza (GST, EC 2.5.1.18)

Enzým Tis katalyzuje konjugáciu GSH s {{0}}chlór-2,4-dinitrobenzénom (CDNB). Meria sa spektrofotometricky pri 340 nm. Reakčná zmes obsahuje 0,1 M tlmivý roztok fosforečnanu draselného, ​​pH 6,5, GSH rozpustený v tlmivom roztoku fosforečnanu draselného (140 mg/100 ml) a CDNB 4 mg/ml v etylalkohole. Jedna jednotka aktivity enzýmu je definovaná ako množstvo enzýmu, ktoré katalyzuje tvorbu 1 μmol S-konjugátu za minútu [11].

2.4.3 Malondialdehyd (MDA)

Malondialdehyd v celých homogenátoch bol stanovený ako látky reaktívne s kyselinou tiobarbiturovou (TBARS) podľa štandardnej metódy Ohkawa et al. [37]. Reakčná zmes obsahovala 0,1 ml tkanivového homogenátu, rovnaký objem roztoku dodecylsulfátu sodného, ​​0,75 ml kyseliny octovej, 0,75 ml kyseliny tiobarbiturovej, a 0.3 ml destilovanej vody. Tieto zložky sa zmiešali vo vortexe a inkubovali sa vo vriacom vodnom kúpeli počas 1 hodiny, potom sa ochladili na teplotu miestnosti. Do každej skúmavky sa pridalo desať 0,5 ml destilovanej vody a 2,5 ml n-butanolu a dôkladne sa premiešalo na vortexe, potom sa rotovalo v centrifúge pri 2500 x g počas 10 minút. Absorbancia sa odčítala pri 532 nm.

2.5 Stanovenie hormónov

2.5.1 Testosterón

Testosterón bol stanovený pomocou testosterónu Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (kat. č.: ADI-900-065; Enzo Life Sciences, NY, USA), testosterón je hlavný androgén, ktorý ovplyvňuje primárny aj sekundárny sexuálny vývoj ako sexepíl. 100 ul štandardného riedidla (testovací pufor 3 alebo tkanivové kultivačné médium) sa napipetovalo do jamiek s nešpecifickou väzbou a maximálnou väzbou (0 pg/ml štandard). Potom 100 ul štandardu #1 až #5 do príslušných jamiek. Vzorka (100 ul) sa napipetovala do príslušných jamiek a 50 ul testovacieho pufra 3 do jamiek pre nešpecifickú väzbu. Do každej jamky sa tiež pridalo 50 ul žltej protilátky, okrem jamiek na slepý pokus, na celkovú aktivitu a na jamky s nešpecifickou väzbou. Inkubácia platne pri teplote miestnosti na trepačke platní počas 1 hodiny pri 500 ot./min. Potom sa do každej jamky pridalo 50 ul modrého konjugátu, s výnimkou celkovej aktivity a slepých jamiek. Po vyprázdnení obsahu jamiek sa premytie uskutočnilo pridaním 400 ul premývacieho roztoku do každej jamky 3-krát. Do jamiek s celkovou aktivitou sa pridal modrý konjugát (5 ul) a do každej jamky sa pridalo 200 ul roztoku p-nitrofenylfosfátu a inkubovalo sa pri 37 stupňoch počas 1 hodiny bez trepania. Odčítanie doštičky pri 405 nm sa uskutočnilo po pridaní 50 ul stop roztoku do každej jamky [12, 48].

2.5.2 Estradiol

Estradiol bol stanovený pomocou súpravy estradiol ELIZA (kat. č.: 501890; Cayman Chemical, Michigan, USA) podľa protokolov výrobcu. Princíp tejto reakcie je založený na tom, že koncentrácia indikátora estradiol acetylcholínesterázy (AChE) je konštantná, ale koncentrácia natívneho estradiolu sa mení, preto množstvo indikátora estradiol acetylcholínesterázy (AChE), ktoré sa viaže na estradiolové antisérum, je nepriamo úmerné koncentrácii natívneho estradiolu. v studni. 100 ul ELISA pufra sa pridalo do jamiek s nešpecifickou väzbou a maximálnou väzbou. Pridanie 50 µl zo skúmavky č. 8 do oboch jamiek s najnižším štandardom (Štandard 8) a 50 µl zo skúmavky č. 7 do každej z ďalších štandardných jamiek (Štandard 7). Do každej jamky sa pridala vzorka (50 ul). Estradiol AChE Tracer (50 ul) sa pridal do každej celkovej aktivity a slepých jamiek. Potom sa do každej jamky pridalo estradiolové ELISA antisérum (50 ul) s výnimkou celkovej aktivity, nešpecifickej väzby a slepých jamiek. Po inkubácii na orbitálnej trepačke (2 hodiny pri teplote miestnosti) sa merala absorbancia pri 414 nm [52].

2.6 Stanovenie enzýmov imunitného potenciálu

2.6.1 Myeloperoxidáza (MPO, EC 1.11.2.2)

Jedna jednotka aktivity MPO je definovaná ako množstvo enzýmu, ktorý hydrolyzuje substrát a generuje taurínchloramín na spotrebu 10 μmol TNB za minútu pri 25 stupňoch . MPO bol stanovený pomocou súpravy na testovanie kolorimetrickej aktivity myeloperoxidázy (kat. č.: MAK068; Sigma-Aldrich, MO, USA). Absorbancia sa merala pri 412 nm.

2.6.2 Adenozíndeamináza (ADA, EC 3.5.4.4)

ADA je enzým, ktorý katalyzuje premenu adenozínu a 2'-deoxyadenozínu na inozín a 2'-deoxyinozín. ADA bola stanovená podľa princípov súpravy na stanovenie aktivity adenozíndeaminázy v technickom bulletine (kat. č.: MAK40}0; Merck KGaA, Darmstadt, Nemecko). Jedna jednotka adenozíndeaminázy je množstvo enzýmu, ktorý hydrolyzuje adenozín za vzniku 1,0 μmol inozínu za minútu pri 37 stupňoch. Reagencie sú 1× ADA testovací pufor (41 μl), ADA Converter (2 μl), ADA vývojka (2 μl) a ADA substrát (5 μl).

2.7 Diferenciálny počet hemocytov

Hemolymfa bola odobratá zo slimáka (kontrola, exponovaný) podľa Sminia [47]. Po dotyku hlavy a chodidla Pasteurovou pipetou bol slimák nútený stiahnuť sa hlboko do svojej ulity a vytlačiť hemolymfu, ktorá sa zhromaždila na diferenciálny počet hemocytov. Hemolymfa sa rozotrela na podložné sklíčko mikroskopu, aby sa rozšírila. Po fixácii v 99,8 percentnom metanole počas 5 minút sa sklíčko otočilo pod uhlom 45 stupňov na sušenie pri teplote miestnosti a zafarbilo sa farbivom Giemsa počas 20 minút. Zistilo sa, že diferenciácia hemocytov je úmerná počtu 100.

2.8 Histologické vyšetrenia

Histologické vyšetrenia sa uskutočnili po 7 dňoch expozície 8 a 16 ul/l RIPEX. Tráviace žľazy a ovotestes boli vypreparované a okamžite fixované v Bouinovej tekutine. Po 1 dni fixácie boli vzorky potom dehydratované sériou alkoholov a vyčistené v xyléne. Boli vyrobené parafínové bloky [42]. Desať siekt. (hrúbka 5–7 μm) boli narezané a zafarbené hematoxylínom a eozínom (Mayerov H a E). Po farbení nasledovalo dobré umytie vodou z vodovodu. Histologické rezy boli odfotografované pomocou fotoautomatizovaného fotoaparátu (Optika, Taliansko).

2.9 Štatistická analýza

Údaje boli vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka a analyzované štatistickým softvérom spoločenských vied (SPSS; IBM Corp. Armonk, NY, USA). Na identifikáciu rozdielov medzi kontrolnou a exponovanou skupinou, medzi rôznymi koncentráciami a časovými bodmi expozície sa použila dvojcestná analýza rozptylu ANOVA. Hladina významnosti bola nastavená na p menšie alebo rovné 0,05.

Mechanizmus Cistanche zvyšuje účinok testosterónu

Zistilo sa, že Cistanche zvyšuje hladinu testosterónu niekoľkými spôsobmi. Po prvé, obsahuje zlúčeniny známe ako echinakozid a akteozid, u ktorých bolo preukázané, že zvyšujú produkciu luteinizačného hormónu (LH) v hypofýze. LH stimuluje Leydigove bunky v semenníkoch k produkcii testosterónu. Cistanche tiež obsahuje polysacharidy a fenyletanoidové glykozidy, u ktorých sa preukázalo, že majú antioxidačné a protizápalové vlastnosti. To môže pomôcť znížiť oxidačný stres a zápal v semenníkoch, čo môže narušiť produkciu testosterónu. Okrem toho sa zistilo, že Cistanche zvyšuje expresiu génov zapojených do syntézy testosterónu a znižuje aktivitu enzýmov, ktoré testosterón rozkladajú, ako napríklad {{1} }alfa-reduktázy. Celkovo sa predpokladá, že kombinácia týchto mechanizmov prispieva k účinkom Cistanche na zvýšenie testosterónu.

Hoda H. Abdel‑Azeem1*, Azza H. Mohamed1 a Mohamed R. Habib2