Galektín-3 má antinekroptotické a antiapoptotické účinky pri akútnej tubulárnej nekróze vyvolanej cisplatinou

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Suhail Al-Salama a kol

Dávkovanie Cistanche tubulosa pri ochorení obličiek, kliknite sem a získajte vzorku

Abstraktné

Pozadie/ciele:Akútnaobličkyúraz (AKI) predstavuje záťaž pre verejné zdravie so zvýšenou morbiditou, úmrtnosťou a nákladmi na zdravotnú starostlivosť. Je spojená so zvýšeným rizikom rozvoja chronickejobličkychoroba a smrť. Akútna tubulárna nekróza (ATN) je najčastejšou príčinou AKI. Apoptóza a nekróza tkaniva hrajú dôležitú úlohu v ATN. Je známe, že galektín 3 (GAL-3), lektín viažuci beta galaktozid, zohráva úlohu pri zápale, apoptóze a oxidačnom strese, ale jeho úloha pri akútnej tubulárnej nekróze vyvolanej cisplatinou nie je jasne objasnená.

Metódy:Samce C57B6-J a C57BL-6 –GAL{4}} knock-out myší sa použili na indukciu ATN s použitím modelu akútnej tubulárnej nekrózy na myšiach s cisplatinou. GAL-3 expresia, apoptotické, nekrotické a nekroptické proteíny vobličkysa merali s použitím štandardných histologických, imunohistochemických a enzýmovo viazaných imunosorbentových testovacích techník. Údaje boli prezentované ako priemer ± SE Štatisticky významné rozdiely (str<0.05) were="" calculated="" between="" experimental="" groups="" and="" corresponding="" control="" groups="" by="" one-way="" analysis="" of="">

Výsledky:Došlo k výraznému nárastu GAL-3 v rokuobličkydivých myší GAL-3 liečených cisplatinou v porovnaní s kontrolnými myšami. Okrem toho boli vobličkyGAL-3 KO myší liečených cisplatinou ako divokých GAL-3 myší liečených cisplatinou. Podobne boli významne vyššie hladiny proteínov nekroptózy RIPK1, RIPK3 a MLKL vobličkyGAL-3 KO myší liečených cisplatinou ako divokých GAL-3 myší liečených cisplatinou. Okrem toho boli výrazne vyššie úrovneobličkyproapoptotické proteíny; štiepená kaspáza-3, štiepená PARP, TRAIL a FAS u myší GAL-3 KO liečených cisplatinou v porovnaní s divokými myšami GAL-3 liečenými cisplatinou.

Záver:GAL-3 môže ovplyvniť prežitie a smrť buniek prostredníctvom interakcie s nekroptotickými, apoptotickými a pro-prežitkovými proteínmi v obličkových tubuloch počas akútnej tubulárnej nekrózy vyvolanej cisplatinou.

Kľúčové slová: Obličky• Akútna tubulárna nekróza • Cisplatina • Galektín-3 • Nekroptóza • Apoptóza

Úvod

Akútnaobličkyporanenie (AKI) je charakterizované náhlym zníženímobličkyfunkcie na základe zvýšenej hladiny sérového kreatinínu, zníženého množstva moču, potreby renálnej substitučnej terapie alebo kombinácie týchto faktorov [1].

TheObličkyUsmernenie pre klinickú prax AKI zlepšujúce globálne výsledky (KDIGO) definuje AKI buď ako zvýšenie sérového kreatinínu o viac alebo rovné 0,3 mg/dl (vyššie alebo rovné 26,5 µmol/l) v rámci 48 hodín; alebo zvýšenie sérového kreatinínu na viac alebo rovné 1,5-násobku základnej hodnoty, o ktorom je známe alebo sa predpokladá, že k nemu došlo počas predchádzajúcich 7 dní; alebo objem moču<0.5 ml/kg/h="" for="" 6="" hours="">

Akútna tubulárna nekróza (ATN) je častou príčinou AKI [3]. Ischemické a nefrotoxické delikty sú hlavnou príčinou ATN [3]. Napriek rozsiahlym štúdiám o ATN, ktoré zahŕňajú poškodenie buniek, bunkovú smrť a regeneráciu, základné mechanizmy nie sú jasne definované.

Apoptóza je forma programovanej bunkovej smrti sprostredkovanej kaspázami. Významné správy ukázali, že apoptóza hrá dôležitú úlohu v ATN [3, 4]. Na druhej strane, nekróza je forma bunkovej smrti charakterizovaná včasnou permeabilizáciou plazmatickej membrány, opuchom organel a rozpadom bunkového obsahu [5]. Nekróza sa často vyskytuje, keď sú bunky vystavené nadmernému vonkajšiemu stresu. Nekróza bola tradične považovaná za pasívnu a neprogramovanú; preto bolo vynaložené len veľmi málo úsilia na preskúmanie mechanizmu nekrózy, napriek jej prevalencii u ľudských chorôb [5]. Dobre známym typom nekrózy je nekroptóza [5]. Nekroptóza je programovaná neapoptotická bunková smrť vyvolaná množstvom extracelulárnych stimulov, ako je tumor nekrotizujúci faktor (TNF) [5]. Pôvodne bola definovaná ako bunková smrť charakterizovaná morfológiou nekrotickej bunkovej smrti so súčasnou aktiváciou receptor-interagujúcej serín/treonín-proteínkinázy 1 (RIPK1). RIPK1 aktivuje receptor-interagujúcu serín/treonín-proteínkinázu 3 (RIPK3) za vzniku komplexu, ktorý sa nazýva nekrozóm [6]. Neskôr aktivovaný RIPK3 získa schopnosť fosforylovať a aktivovať kinázovú doménu podobnú zmiešanej línii (MLKL) [6]. Fosforylované molekuly MLKL sú schopné vytvárať oligoméry na uľahčenie ich translokácie do bunkovej membrány prostredníctvom väzby na fosfatidylinozitolové lipidy a kardiolipín. Translokované oligoméry MLKL pôsobia ako kanály v bunkovej membráne na vyvolanie buď prítoku sodíka a odtoku draselných iónov [7] alebo alternatívne prílevu vápnikových iónov [8]. V oboch smeroch to povedie k nekrotickej bunkovej smrti prostredníctvom permeabilizácie plazmatickej membrány a jej prasknutia, čo vedie k rozliatiu intracelulárneho obsahu do orgánu.

V tomto projekte sme použili cisplatinu (Cis) na vyvolanie akútnej tubulárnej nekrózy. Cis má široké spektrum protinádorových účinkov a používa sa na liečbu rôznych malígnych nádorov [9]. Napriek tomu je nefrotoxicita hlavným vedľajším účinkom a je charakterizovaná nekrózou renálnych tubulárnych buniek, poškodením tkaniva, renálnou dysfunkciou a akútnymobličkyzlyhanie [10]. Napriek rôznym opatreniam, ktoré boli prijaté na prekonanie poškodenia obličiek, takmer 4–23 percent pacientov je postihnutých AKI [11]. Známe mechanizmy poškodenia obličiek vyvolaného cisplatinou zahŕňajú apoptózu, oxidačný stres a zápalovú odpoveď v dôsledku priameho poškodenia renálnych tubulárnych epiteliálnych buniek a obličkových ciev [12].

Galektín-3 (GAL{1}}), 35 kDa proteín, je jedinečná chiméra podobná, ktorá má jednu C-koncovú doménu rozpoznávania sacharidov (CRD) spojenú s dlhou N-koncovou doménou (ND) [13 ].GAL-3 sa nachádza na bunkovom povrchu, cytoplazme a jadre buniek, ako aj v extracelulárnej matrici [13].

Intracelulárna GAL-3 sa podieľa na bunkovej proliferácii a antiapoptotických mechanizmoch [14, 15]. Ovplyvňuje proteíny K-Ras a Akt, a tak reguluje aj prežívanie diferenciácie a smrť [14, 15]. Zatiaľ čo extracelulárna GAL-3 sprostredkuje bunkovú adhéziu, interakciu a signalizáciu bunka-matrica, zápal a apoptózu [16].

Ukázalo sa, že GAL-3 sa po expozícii apoptotickým stimulom translokuje buď z cytosólu alebo z jadra do mitochondrií a blokuje zmeny v potenciáli mitochondriálnej membrány, čím zabraňuje apoptóze [17]. Štúdie tiež ukázali, že GAL-3 môže inhibovať apoptózu indukovanú TNF prostredníctvom aktivácie AKT [18]. Iné štúdie ukázali, že GAL-3 a Beclin1 sa podieľajú na dvoch koordinovaných dráhach programovanej bunkovej smrti, apoptózy a autofágie [18]. V tomto projekte predpokladáme, že GAL-3 má ochrannú úlohu na renálnom tubulárnom epiteli pri akútnom tubulárnom poškodení. Použili sme myšací model akútneho tubulárneho poškodenia na skúmanie ochrannej úlohy GAL-3 pri akútnom tubulárnom poškodení vyvolanom cisplatinou prostredníctvom merania renálnych funkcií (plazmatická močovina a kreatinín),obličkyproteíny nekroptózy (RIP-1, RIP{1}} a MLKL), proteíny nekrózy (katepsín D a katepsín B), proteíny apoptózy (štiepená kaspáza-3, štiepená PARP, TRAIL a FAS) a markery prežitia buniek (p-NF-KB, beta-katenín a Wnt), použitím štandardného enzýmového imunosorbentového testu, biochemického analyzátora, histologických a imunohistochemických postupov.

Materiály a metódy

Použili sme myšací experimentálny model akútnejobličkyporanenie, ktoré bolo rozsiahle opísané v literatúre a používané na štúdium akútobličkyporanenia v laboratóriách na celom svete [19].

Myší model akútnej tubulárnej nekrózy

Použili sa myši C57BL/6 a C57BL/6 –GAL-3 knock-out (KO) s hmotnosťou 25-30 g. Myši boli udržiavané na štandardnej strave. Myši boli umiestnené po päť v klietke v režime 12-h svetla a tmy aspoň 1 týždeň pred podaním cisplatiny.

Cisplatina (EBEWE Pharma GmbH Nfg. KG, Unterach, RAKÚSKO) bola čerstvo použitá v deň podania v koncentrácii 0,5 mg/ml. Myšiam sa intraperitoneálne (IP) podávalo buď 30 mg/kg telesnej hmotnosti cisplatiny [11] alebo vehikulum (normálny fyziologický roztok), potom mali myši opäť voľný prístup k potrave a vode. Metóda eutanázie sa začala intraperitoneálnou injekciou anestetických liekov, ktoré zahŕňali kombináciu ketamínu (100 mg/kg) a xylazínu (10 mg/kg), následne sa odobrali obličky a 96 hodín po podaní cisplatiny sa odobrali vzorky krvi. Krv sa odoberala do EDTA vákuovačov.Obličkypotom boli resekované, premyté v ľadovo chladnom fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS), jedna polovica každej obličky bola okamžite zmrazená v tekutom dusíku a neskôr uložená v -80 stupňovej mrazničke. Druhá polovica bola okamžite fixovaná v 10 percentnom pufrovanom formálnom fyziologickom roztoku počas 24 hodín. Odobratá krv bola centrifugovaná pri 3000 ot./min. počas 15 minút. Plazma sa odobrala, rozdelila na alikvóty a skladovala pri -80 stupňoch až do ďalšej analýzy.

Spracovanie vzorky na extrakciu bielkovín

Celkový proteín bol extrahovaný zobličkyvzorky homogenizáciou s lyzačným pufrom a odberom supernatantu po centrifugácii. Pre celkový bunkový lyzát boli vzorky obličiek rozmrazené, odvážené a vložené do studeného lyzačného pufra obsahujúceho 5{{20}} mM Tris, 300 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 3 mM EDTA, 20 mM -glycerofosfát, 25 mM NaF, 1 percento Triton X-100, 10 percento w/v glycerol a tableta inhibítora proteázy (úplný inhibítor proteázy Roche koktailové tablety). Obličky sa homogenizovali na ľade pomocou homogenizátora (IKA T25 Ultra Turrax). Vzorky sa potom centrifugovali pri 14000 RPM počas 15 minút pri 4 stupňoch, supernatant sa zhromaždil, rozdelil na alikvóty a skladoval pri -80 stupňoch až do ďalšej analýzy. Extrakcia jadrového a cytoplazmatického proteínu sa uskutočnila podľa protokolu opísaného inde [19]. V stručnosti, vzorky obličiek boli rozmrazené na ľade, odvážené a homogenizované na ľade s pufrom obsahujúcim Tris HCl 10 mmol/l, CaCl2 3 mmol/l, MgCl2 2 mmol/l, EDTA 0,1 mmol/l , fenylmetánsulfonylfluorid (PMSF) 0,5 mmol/l, sacharóza 0,32 mmol/l, ditiotreitol (DTT) 1 mmol/l, Nonidet P-40 (NP-40) 0,5 percenta a kokteil inhibítorov proteázy 1 percento. Homogenáty sa centrifugovali pri 800 ot./min. počas 10 minút. Supernatant bol odstránený a uchovávaný ako cytoplazmatické frakcie. Peleta sa dvakrát premyla homogenizačným tlmivým roztokom bez NP-40 a resuspendovala sa v tlmivom roztoku s nízkym obsahom soli s obsahom HEPES 20 mmol/l, MgCl2 1,5 mmol/l, KCl 20 mmol/l, EDTA 0,2 mmol /l. Glycerol 25 percent, PMSF 0,5 mmol/l a DTT 0,5 mmol/l. Po inkubácii na ľade počas 5 minút sa pridal rovnaký objem tlmivého roztoku s vysokým obsahom soli obsahujúceho HEPES 20 mmol/l, MgCl2 1,5 mmol/l, KCl 800 mmol/l, EDTA 0,2 mmol/l. Pridal sa glycerol 25 percent, PMSF 0,5 mmol/l, DTT 0,5 mmol/l, NP-40 1 percent a koktail inhibítora proteázy 1 percento, zmes sa inkubovala na ľade 30 minút, centrifugovala sa pri 14 000 ot./min počas 15 minút pri 4 stupňoch a supernatanty boli uložené ako jadrová frakcia. Celková koncentrácia proteínu bola stanovená metódou BCA proteínového testu (Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit).

Spracovanie vzoriek pre histológiu

Obličky boli vyrezané, premyté ľadovo studeným PBS a odvážené. Každýobličkybola rozdelená na dve polovice a každá polovica bola kazeta a fixovaná priamo v 10 percentnom pufrovanom formalíne. Rezy boli dehydratované vo zvyšujúcich sa koncentráciách etanolu, vyčistené xylénom a zaliate parafínom. Tri µm rezy boli pripravené z parafínových blokov a zafarbené hematoxylínom a eozínom a farbivami kyseliny jodistej Schiff (PAS) s použitím štandardných postupov [20]. Zafarbené rezy vyhodnotil histopatológ, ktorý sa podieľal na tomto projekte.

Imunohistochémia

5-um rezy boli zbavené parafínu xylénom a rehydratované odstupňovaným alkoholom. Rezy sa potom umiestnili do vyhľadávacieho roztoku s vysokým pH (pH 9) vo vodnom kúpeli pri 95 °C na 20 minút. Rezy sa potom premývali destilovanou vodou počas 5 minút a potom TBST pufrom počas 5 minút. Rezy sa potom ošetrili peroxidázovým blokom počas 10 minút, po ktorom nasledoval proteínový blok počas 10 minút. Rezy sa potom inkubovali jednu hodinu pri teplote miestnosti s protilátkou proti štiepeniu kaspázy-3 (Rabbit Polyclonal, 1:300, Cell signaling technology, Danvers, MA USA), protilátkou proti štiepeniu PARP (Rabbit Polyclonal, 1: 100, technológia bunkovej signalizácie, Danvers, MA, USA), protilátka proti beta-katenínu (Rabbit Polyclonal, 1:100, Abcam, Cambridge, MA, USA), protilátka proti fosfo-NF-κB (Rabbit Polyclonal, 1: 100, Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-Wnt{25}} (Rabbit Polyclonal, 1:100, Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-RIPK1 (Rabbit polyclonal, 1:100, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), anti-RIPK3 (polyklonálny králik, 1:100, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) a anti-MLKL 1 (monoklonálny králik, 1:100, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) . Po konjugácii s primárnymi protilátkami boli rezy inkubované so sekundárnou protilátkou (EnVisionTM Detection System, DAKO, Agilent, USA) počas 20 minút pri teplote miestnosti, po čom nasledovalo pridanie DAB chromogénu (EnVisionTM Detection System, DAKO, Agilent, Santa Clara, CA, USA) a kontrastné farbenie sa uskutočnilo hematoxylínom. Boli použité vhodné pozitívne kontroly. Pre negatívnu kontrolu nebola primárna protilátka pridaná do rezov. Pozitívne a negatívne kontroly boli použité v každej dávke zafarbených sklíčok (nie je znázornené na obrázkoch).

Imunofluorescenčné značenie

5 μm rezy boli zbavené parafínu xylénom a rehydratované odstupňovaným alkoholom. Rezy sa umiestnili do vyhľadávacieho roztoku s vysokým pH (pH 9) vo vodnom kúpeli pri 95 stupňoch na 20 minút. Rezy sa potom premývali destilovanou vodou počas 5 minút a potom TBST pufrom počas 5 minút. Rezy sa potom inkubovali s anti-GAL-3 protilátkou (Rabbit Polyclonal, 1:50, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA), anti-RIPK1 (Rabbit polyclonal, 1:50, Thermo Scientific, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), anti-RIPK3 1 (králičí polyklonálny, 1:50, Thermo Scientific, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) a anti-MLKL 1 (králičí monoklonálny, 1:50, termo Scientific, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) cez noc pri izbovej teplote. Rezy sa následne inkubovali s oslím anti-králičím Alexa Fluor 488 (Jackson Immune Research Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA, 1:100) protilátkou. Nakoniec boli rezy namontované v DAPI-vo vode rozpustnom montážnom médiu (Abcam, Cambridge, MA, USA) a prezerané fluorescenčným mikroskopom Olympus. Boli použité príslušné pozitívne kontrolné rezy. Pre negatívnu kontrolu sa primárna protilátka nepridala k rezom a celý postup sa uskutočnil rovnakým spôsobom, ako je uvedené vyššie. Pozitívne a negatívne kontroly boli použité v každej dávke zafarbených sklíčok (nie je znázornené na obrázkoch).

Morfometrická analýza

Morfometrická analýza akútnej tubulárnej nekrózy bola vykonaná dvoma výskumníkmi, ktorí sa zúčastnili tejto štúdie. Morfometrická analýza expresie štiepenej kaspázy-3, štiepenej PARP, RIPK1, RIPK3, MLKL, fosfo-NFK-B, Wnt-3, beta-katenínu v obličkových tubulárnych bunkách sa vykonala pomocou softvéru ImageJ (http: //rsbweb.nih.gov/ij/). Štiepená kaspáza-3, štiepená PARP, RIPK1, RIPK3, MLKL, fosfo-NFK-B, Wnt-3, Beta-katenín, značenie sa určilo spočítaním počtu pozitívnych buniek v náhodne vybraných vysokovýkonných bunkách polia (HPF) v obličkách. Priemerný počet pozitívnych buniek sa prevedie z na HPF na mm2 (každý mm2= 4HPF). Pre štiepenú kaspázu-3, štiepenú PARP, RIPK1, RIPK3 a Wnt-3, značenie, boli bunky

pozitívny, keď bol vzor cytoplazmatického farbenia. Na značenie MLKL sa bunky považovali za pozitívne, keď existoval vzor membránového a cytoplazmatického farbenia. Pokiaľ ide o fosfo-NFK-B a beta-katenín, značenie sa bunky považovali za pozitívne, keď existoval vzor jadrového farbenia.

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

Obličkykoncentrácie GAL-3, katepsínu D, katepsínu B, štiepenej kaspázy-3, TRAIL a FAS sa stanovili pomocou vývojovej súpravy DuoSet ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA ) pre sendvičovú ELISA, použitím štandardného postupu podľa pokynov výrobcu. Koncentrácie PARP štiepenej v obličkách sa stanovili pomocou súpravy Cell signaling technology Elisa kit (Danvers, MA, USA) pre sendvič Elisa, použitím štandardného postupu podľa pokynov výrobcu. Koncentrácie RIPK1, RIPK3 a MLKL v obličkách sa stanovili pomocou súprav Elisa MyBioSource (San Diego, CA, USA) pre sendvičovú Elisu, použitím štandardného postupu podľa pokynov výrobcu. Hodnoty absorbancie sa uskutočňovali pri 450 nm s použitím 96-jamkového doštičkového spektrofotometra (BioTek ELx800 microplate Elisa reader, Winooski, VT, USA). Koncentrácie GAL-3, katepsínu D, katepsínu B, štiepenej kaspázy-3, TRAIL, RIPK1, RIPK3, MLKL, štiepenej PARP a FAS vo vzorkách obličiek boli stanovené interpoláciou zo štandardnej krivky. Hladiny boli normalizované na celkové koncentrácie proteínov.

Štatistická analýza

Všetky štatistické analýzy sa uskutočnili s použitím softvéru Graph Pad Prism Software verzie 5. Viacnásobné porovnania medzi rôznymi skupinami sa dosiahli jednosmernou analýzou rozptylu (ANOVA), po ktorej nasledovali Newman Keuls post hoc testy s viacerými rozsahmi. Porovnania medzi dvoma skupinami boli dosiahnuté Studentovým t-testom. Údaje sú uvedené ako priemer ± štandardná chyba (SE). Hodnoty P < 0,05="" sa="" považujú="" za="">

Výsledky

Akútna tubulárna nekróza vyvolaná cisplatinou

Divoká skupina GAL -3 liečená cisplatinou vykazuje ATN zahŕňajúcu (67,29 percent ± 2,392) renálneho parenchýmu (obr. 1) so stratou kefových lemov, opuchom tubulárnych buniek, intratubulárnymi padajúcimi bunkami, intratubulárnymi sekrétmi a mitózou ( Obr. 2B a 3B).

Skupina GAL-3 KO liečená cisplatinou vykazuje ATN zahŕňajúcu (78,54 percent ± 0.8120) renálneho parenchýmu (obr. 1) so stratou kefových lemov, opuchom tubulárnych buniek, intratubulárnymi padajúcimi bunkami, intratubulárne sekréty a mitóza (obr. 2D a 3D).

Výrazne vyššie percento ATN je vobličkyu myší GAL-3 KO liečených cisplatinou ako u divokých myší GAL-3 liečených cisplatinou (P<0.002) (fig.="">

GAL-3 sa prejavuje pri akútnej tubulárnej nekróze

Došlo k významnému zvýšeniu koncentrácie cytoplazmatickej frakcie GAL-3 vobličkyv divokej skupine GAL-3 liečenej cisplatinou (6084 ± 587,3 pg/mg) v porovnaní s divokou kontrolnou skupinou GAL-3 (1620 ± 62,3 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 4e).="" there="" is="" a="" significant="" increase="" in="" the="" nuclear="" fraction="" concentration="" of="" gal-3="" in="">obličkyvo voľnej prírode GAL-3 liečenej cisplatinou

skupina (841,8 ± 41,11 pg/mg) v porovnaní s GAL-3 divokou kontrolnou skupinou (429,2 ± 39,56 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 4e).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Imunofluorescenčné farbenie reprezentobličkysekcie ukázal významne vyššiu expresiu GAL-3 v obličkových tubuloch postihnutých akútnou tubulárnou nekrózou (obr. 4B-D) v porovnaní s GAL-3 divokými kontrolnými myšami (obr. 4A).

GAL-3 je antinekroptický mediátor

Serín/treonín-proteínkináza 1 interagujúca s receptorom (RIPK1). Došlo k významnému zvýšeniu koncentrácie RIPK-1 (55,33 ± 3,766 pg/mg) vobličkydivých myší GAL-3 liečených cisplatinou v porovnaní s divými kontrolnými myšami GAL-3 (14,22 ± 1,687 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 5a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" ripk-1="" concentration="" (159.7="" ±="" 4.183="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (39.59="" ±="" 1.808="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" ripk-1="" (159.7="" ±="" 4.183="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (55.33="" ±="" 3.766="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

Viacnásobné porovnania medzi štyrmi experimentálnymi skupinami s použitím jednosmernej ANOVA, po ktorej nasledoval Newman-Keuls post hoc test, boli štatisticky významné (P<>

Imunohistochemické farbenie na RIPK-1 ukázalo výrazne vyšší počet buniek exprimujúcich RIPK-1 vobličkyGAL-3 KO myší liečených cisplatinou ako divokých myší GAL-3 liečených cisplatinou (P<0.001), (fig.="">

Serín/treonín-proteínkináza 3 interagujúca s receptorom (RIPK3). Došlo k významnému zvýšeniu koncentrácie RIPK{4}} (616,4 ± 27,07 pg/mg) v obličkách divokých myší GAL{10}} liečených cisplatinou v porovnaní s divokými kontrolnými myšami GAL{11}} (17,46 ± 7,002 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 5b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" ripk-3="" concentration="" (2165="" ±="" 73.29="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (203.1="" ±="" 6.443="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" ripk-3="" (2165="" ±="" 73.29="" pg/mg)="" in="">obličkycisplatinou liečených GAL-3 KO myší ako u cisplatinou liečených GAL-3 divokých myší (616,4 ± 27,07 pg/mg), (P<0.001), (fig.="">

Imunohistochemické farbenie na RIPK-3 ukázalo signifikantne vyšší počet buniek exprimujúcich RIPK-3 v obličkách GAL-3 KO myší liečených cisplatinou ako divokých myší GAL-3 liečených cisplatinou ( P<0.001), (fig.="" 7).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Zmiešaná línia podobná kinázovej doméne (MLKL). Došlo k významnému zvýšeniu koncentrácie MLKL (71,46 ± 1,757 pg/mg) v r.obličkydivokých myší GAL-3 liečených cisplatinou v porovnaní s divokými kontrolnými myšami GAL-3 (23,30 ± 0,5897 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 5c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" mlkl="" concentration="" (160.3="" ±="" 6.648="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (40.30="" ±="" 1.090="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" mlkl="" (160.3="" ±="" 6.648="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (71.46="" ±="" 1.757="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5c).="" immunohistochemical="" staining="" for="" mlkl="" showed="" a="" significantly="" higher="" number="" of="" cells="" expressing="" mlkl="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice=""><0.001), (fig.="" 8).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Katepsín B. Došlo k významnému zvýšeniu koncentrácie katepsínu-B vobličkydivých myší GAL-3 liečených cisplatinou (55,79 ± 4,141 pg/mg) v porovnaní s divokými kontrolnými myšami GAL-3 (37,99 ± 1,206 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 9a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cathepsin-b="" concentration="" in="">obličkyGAL-3 KO myší liečených cisplatinou (85,87 ± 9,220 pg/mg v porovnaní s GAL-3 divokými kontrolnými myšami (32,81 ± 1,570 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 9a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cathepsin-b="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" (85.87="" ±="" 9.220="" pg/mg="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (55.79="" ±="" 4.141="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

Viacnásobné porovnania medzi štyrmi experimentálnymi skupinami s použitím jednosmernej ANOVA, po ktorej nasledoval Newman-Keuls post hoc test, boli štatisticky významné (P<>

Cathepsin-D. Došlo k významnému zvýšeniu koncentrácie katepsínu-D vobličkydivokých myší GAL-3 liečených cisplatinou (5145 ± 286,1 pg/mg) v porovnaní s divokými kontrolnými myšami GAL-3 (4066 ± 107,7 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 9b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cathepsin-d="" concentration="" in="">obličkyGAL-3 KO myší liečených cisplatinou (6695 ± 587,7 pg/mg) v porovnaní s GAL-3 divokými kontrolnými myšami (3914 ± 87,51 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 9b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cathepsin-d="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" (6695="" ±="" 587.7="" pg/mg)="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (4066="" ±="" 107.7="" pg/mg),=""><0.01), (fig.="">

Viacnásobné porovnania medzi štyrmi experimentálnymi skupinami s použitím jednosmernej ANOVA, po ktorej nasledoval Newman-Keuls post hoc test, boli štatisticky významné (P<>

GAL-3 je antiapoptotický mediátor

Rozštiepená kaspáza-3. Došlo k významnému zvýšeniu koncentrácie štiepenej kaspázy-3 (4665 ± 330,9 pg/mg) vobličkydivých myší GAL-3 liečených cisplatinou v porovnaní s divými kontrolnými myšami GAL-3 (3193 ± 75,30 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 10a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" caspase-3="" concentration="" (6319="" ±="" 686="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (3022="" ±="" 78.57="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" caspase-3="" (6319="" ±="" 686="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (4665="" ±="" 330.9="" pg/mg),=""><0.01), (fig.="" 10a).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Imunohistochemické farbenie na štiepenú kaspázu-3 ukázalo signifikantne vyšší počet apoptotických buniek v obličkách GAL-3 KO myší liečených cisplatinou ako divokých myší GAL-3 liečených cisplatinou (P<0.001), (fig.="" 11="" a,="" c,="" i).cleaved="">

Štiepaná PARP. Došlo k významnému zvýšeniu koncentrácie štiepenej PARP (1446 ± 56,97 pg/mg) vobličkydivých myší GAL-3 liečených cisplatinou v porovnaní s divými kontrolnými myšami GAL-3 (171,5 ± 3,926 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" parp="" concentration="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (236.1="" ±="" 11.86="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" parp="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (1446="" ±="" 56.97="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Imunohistochemické farbenie na štiepenú PARP ukázalo signifikantne vyšší počet pozitívnych buniek v obličkách GAL-3 KO myší liečených cisplatinou ako divokých myší GAL{3}} liečených cisplatinou (P<0.001), (fig.="" 11="" e,="" g,="">

Ligand indukujúci apoptózu súvisiaci s TNF (TRAIL). Došlo k významnému zvýšeniu koncentrácie TRAIL (120,9 ± 4,748 pg/mg) v r.obličkydivých myší GAL-3 liečených cisplatinou v porovnaní s divými kontrolnými myšami GAL-3 (86,14 ± 2,879 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" trail="" concentration="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (82.77="" ±="" 3.881="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" trail="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (120.9="" ±="" 4.748="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Imunohistochemické farbenie na štiepenú kaspázu-3 ukázalo výrazne vyšší počet apoptotických buniek vobličkyGAL-3 KO myší liečených cisplatinou ako divokých myší GAL-3 liečených cisplatinou (P<0.001), (fig.="" 11="" a,="" c,="">

Štiepaná PARP. Došlo k významnému zvýšeniu koncentrácie štiepenej PARP (1446 ± 56,97 pg/mg) v obličkách divokých myší GAL-3 liečených cisplatinou v porovnaní s divokými kontrolnými myšami GAL-3 (171,5 ± 3,926 pg/ mg), (P<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" parp="" concentration="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="">obličkyGAL-3 KO myší liečených cisplatinou v porovnaní s GAL-3 KO kontrolnými myšami (236,1 ± 11.86 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" parp="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (1446="" ±="" 56.97="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Imunohistochemické farbenie na štiepenú PARP ukázalo signifikantne vyšší počet pozitívnych buniek vobličkyGAL-3 KO myší liečených cisplatinou ako divokých myší GAL-3 liečených cisplatinou (P<0.001), (fig.="" 11="" e,="" g,="">

Ligand indukujúci apoptózu súvisiaci s TNF (TRAIL). Došlo k významnému zvýšeniu koncentrácie TRAIL (120,9 ± 4,748 pg/mg) v obličkách divokých myší GAL-3 liečených cisplatinou v porovnaní s divokými kontrolnými myšami GAL-3 (86.14 ± 2,879 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" trail="" concentration="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (82.77="" ±="" 3.881="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" trail="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="">obličkycisplatinou liečených GAL-3 KO myší ako u cisplatinou liečených GAL-3 divokých myší (120,9 ± 4,748 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10c).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Legenda FAS.Došlo k významnému zvýšeniu koncentrácie FAS (332,5 ± 6,395 pg/mg) vobličkydivých myší GAL-3 liečených cisplatinou v porovnaní s divými kontrolnými myšami GAL-3 (77,72 ± 2,805 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10d).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" fas="" concentration="" (387.9="" ±="" 8.520="" pg/mg)="" in="" the="">obličkyGAL-3 KO myší liečených cisplatinou v porovnaní s GAL-3 KO kontrolnými myšami (134,1 ± 3,597 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10d).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" fas="" (387.9="" ±="" 8.520="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (332.5="" ±="" 6.395="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

Viacnásobné porovnania medzi štyrmi experimentálnymi skupinami s použitím jednosmernej ANOVA, po ktorej nasledoval Newman-Keuls post hoc test, boli štatisticky významné (P<>

GAL-3 a signály o prežití

NF-KB.Imunohistochemické farbenie na fosfor-NF-KB ukázalo výrazne vyšší počet buniek zafarbených fosforom-NF-KB vobličkycisplatinou liečených GAL-3 divokých myší ako GAL-3 KO myší liečených cisplatinou (P<0.001), (fig.="" 12="">

Beta Catenin.Imunohistochemické farbenie na Beta-katenín ukázalo signifikantne vyšší počet buniek zafarbených Beta-katenínom v r.obličkycisplatinou liečených GAL-3 divokých myší ako GAL-3 KO myší liečených cisplatinou (P<0.001), (fig.="" 12="">

Wnt-3a.Imunohistochemické farbenie na Wnt-3a ukázalo výrazne vyšší počet buniek zafarbených pomocou Wnt{1}}a v obličkách divokých myší GAL liečených cisplatinou-3 ako GAL liečených cisplatinou-3 KO myši (P<0.001), (fig.="" 12="">

Plazmová močovinaDošlo k významnému zvýšeniu koncentrácie močoviny v plazme (23,88 ± 6,715 mmol/l) u divokých myší GAL-3 liečených cisplatinou v porovnaní s divokými kontrolnými myšami GAL-3 (6,688 ± 0). 6066 mmol/l), (P<0.001), (fig.="" 13a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" plasma="" urea="" concentration="" (36.10="" ±="" 2.878="" mmol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (8.331="" ±="" 0.5194="" mmol/l),=""><0.001), (fig.="" 13a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" plasma="" urea="" concentration="" (36.10="" ±="" 2.878="" mmol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (23.88="" ±="" 6.715mmol/l),=""><0.001), (fig.="">

Viacnásobné porovnania medzi štyrmi experimentálnymi skupinami s použitím jednosmernej ANOVA, po ktorej nasledoval Newman-Keuls post hoc test, boli štatisticky významné (P<>

Kreatinín v plazme

Došlo k významnému zvýšeniu koncentrácie kreatinínu v plazme (48,42 ± 3,992 umol/l) u divokých myší GAL-3 liečených cisplatinou v porovnaní s divokými kontrolnými myšami GAL-3 (13,27 ± 0). 3106 umol/l), (P<0.001), (fig.="" 13b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" plasma="" creatinine="" concentration="" (62.36="" ±="" 3.605="" umol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (13.88="" ±="" 0.4183="" umol/l),=""><0.001), (fig.="" 13b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" plasma="" creatinine="" concentration="" (62.36="" ±="" 3.605="" umol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (48.42="" ±="" 3.992="" umol/l),=""><0.01), (fig.="" 13b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Diskusia

Akútnaobličkyúraz je celosvetovo bežným zdravotným problémom. Každoročne ide o približne 13,3 milióna akútnych prípadovobličkyzranenia (AKI). Záťaž, ktorá je obzvlášť vysoká v rozvíjajúcich sa krajinách [21]. Globálne je 1,7 milióna úmrtí ročne spôsobených AKI. Z toho približne 1,4 milióna sa vyskytuje v krajinách s nízkymi a strednými príjmami [21]. AKI sa často dá predísť a dá sa liečiť len s niekoľkými, ak vôbec nejakými, dlhodobými zdravotnými následkami. Identifikácia hlavných mechanizmov a aktérov, ktorí sa podieľajú na rozvoji AKI, sa odrazí v zlepšení starostlivosti o pacientov a minimalizácii mortality a morbidity.

Preukázali sme významný nárast koncentrácie GAL-3 vobličkypodrobený AKI. Preukázali sme tiež výrazne vyššiu expresiu GAL-3 v obličkových tubuloch postihnutých akútnou tubulárnou nekrózou u divých myší liečených cisplatinou GAL-3 ako v obličkových tubuloch v kontrolnej skupine liečenej fyziologickým roztokom. Cytoplazmatické aj jadrové koncentrácie GAL-3 sú významne zvýšené v renálnych tubuloch po ATN v porovnaní s myšami liečenými fyziologickým roztokom. Zvýšená hladina GAL-3 v poranených renálnych tubuloch naznačuje, že GAL-3 je dôležitým hráčom v ATN.

Použili sme tiež myši GAL-3 KO na preskúmanie mechanistickej úlohy GAL-3 v ATN. To nám pomáha bližšie sa pozrieť na modulácie proapoptotických, pronekroptotických a prosurvival proteínov v prítomnosti a neprítomnosti GAL-3 a určuje, či GAL-3 má alebo nemá nejaký vplyv na tieto zmeny .

Ukázali sme signifikantne vyššie percento tubulov ovplyvnených ATN u GAL-3 KO myší liečených cisplatinou ako u divokých myší GAL-3 liečených cisplatinou. Naše výsledky tiež ukázali významné zvýšenie katepsínu B a katepsínu D v obličkách postihnutých ATN. Okrem toho existujú výrazne vyššie hladiny katepsínu B a katepsínu DobličkyGAL-3 KO myší liečených cisplatinou ako u divokých myší GAL-3 liečených cisplatinou. Katepsíny hrajú dôležitú úlohu v signálnych dráhach riadiacich apoptotickú a nekrotickú bunkovú smrť degradáciou rôznych substrátov a/alebo prispievaním k mitochondriálnej destabilizácii [22]. Lysozomálne proteázy, katepsín B a katepsín D sú hojne exprimované v obličkách [23].

Katepsín B, cysteínová proteináza, ktorá má optimálnu aktivitu v kyslom prostredí, sa zúčastňuje mnohých fyziologických a patologických procesov. Trávi štrukturálne proteíny a enzýmy v bunke, degraduje hlavné prvky bazálnej membrány a aktivuje proenzýmy, hormóny a rastové faktory [24]. Zvýšené hladiny expresie a aktivácia katepsínu B boli pozorované v ľudskej proximálnej tubulárnej epiteliálnej bunkovej línii HK-2 podstupujúcej apoptózu [25].

Katepsín D je významne exprimovaný v proximálnych tubulárnych bunkách. Katepsín D je kľúčová lyzozomálna asparágová proteáza, ktorá je zodpovedná za degradáciu proteínov a organel autofagiou-lyzozomálne, ako aj počas bunkovej nekrózy a prasknutia lyzozomálnej membrány [26]. Katepsín D je významne zvýšený v poranených tubuloch po renálnom ischémii/reperfúznom poškodení, čo podporuje naše zistenie významného zvýšenia katepsínu D vobličkys akútnou tubulárnou nekrózou [27].

Vyššie hladiny katepsínu B a D s vyšším percentom ATN vobličkyGAL-3 KO myší liečených cisplatinou ako divoké GAL-3 myši liečené cisplatinou naznačujú GAL-3 ako antinekrotický mediátor.

Preukázali sme tiež výrazne vyššie hladiny proteínov nekroptózy; RIPK1, RIPK3 a MLKL vobličkymyší liečených cisplatinou. Okrem toho sme identifikovali významne vyššie koncentrácie RIPK1, RIPK3 a MLKL v obličkách myší GAL-3 KO liečených cisplatinou ako divých myší liečených cisplatinou GAL-3.

Štúdie ukázali, že cisplatina je spojená so zvýšeným oxidačným stresom [28]. Tvorba reaktívnych foriem kyslíka (ROS), akumulácia produktov peroxidácie lipidov vobličkya potlačené antioxidačné systémy sa považujú za hlavné mechanizmy AKI indukovanej cisplatinou [29]. V bunke sa cisplatina premieňa na vysoko reaktívnu formu, ktorá rýchlo reaguje s antioxidačnými molekulami obsahujúcimi tiol, ako je glutatión [30]. Cisplatina môže tiež spôsobiť mitochondriálnu dysfunkciu a zvýšenú produkciu ROS prostredníctvom narušeného dýchacieho reťazca [31]. ROS uľahčuje autofosforyláciu RIPK1 a podporuje nábor RIPK-3 a tvorbu nekrozómov [32]. Okrem toho je ROS kritickým induktorom permeability lyzozomálnej membrány (LMP) [33].

Cai a kol. [34] ukázali, že LMP sprostredkovaná ROS sa podieľa na indukcii nekroptózy v bunkách medzistavcových platničiek králikov. Podobne po produkcii mitochondriálnej-ROS indukovanej RIPK{2}} nasleduje LMP a mitochondriálna dysfunkcia v dôsledku pozitívnej spätnej väzby medzi Ca2 plus a JNK, čo vedie k nekroptóze buniek A549 a H1299 [35, 36].

Okrem toho sa ukázalo, že upregulovaný RIPK3 pri nekroptóze indukuje stres endoplazmatického retikula, ktorý zvyšuje bunkovú koncentráciu Ca2 plus a expresiu xantínoxidázy, čo vedie k zosilnenej tvorbe ROS [37].

Katepsíny B a D sú hlavným funkčným obsahom uvoľňovaným z lyzozómov so zvýšenou LMP počas procesu bunkovej smrti [34]. Aktivácia katepsínu B a D môže rozšíriť nekroptickú dráhu [38]. Takže nekroptóza môže byť indukovaná spôsobom nezávislým od receptora [39]. Okrem toho správy ukázali, že existujú ďalšie stimuly, iné ako ROS, katepsín B a D, na vyvolanie nekroptózy a medzi ne patrí up-regulácia TRAIL a legendárnych proteínov FAS [40]. Takže zvýšená ROS, či už v dôsledku cisplatiny alebo indukcie RIPK1 alebo RIPK3, môže viesť k zvýšeniu LMP a uvoľňovaniu katepsínu B a D, čo zase zvyšuje nekroptózu. Podobne zvýšená ROS môže aktivovať RIPK1, nábor RIPK3, zvýšenie tvorby nekrozómov, fosforyláciu MLKL, translokáciu fosforylovaného MLKL na bunkovú membránu, čo vedie k smrti nekrotických buniek prostredníctvom permeabilizácie a prasknutia plazmatickej membrány.

V tejto štúdii sa domnievame, že zvýšené ROS, katepsín B, katepsín D, TRAIL a FAS sa podieľajú na indukcii nekroptózy v ATN.

Na určenie úlohy GAL-3 pri nekroptóze sme zmerali koncentrácie RIPK1, RIPk3 a MLKL v prítomnosti a neprítomnosti GAL-3 pomocou GAL-3 divokého a GAL{{5 }} KO myši.

Výrazne vyššie koncentrácie RIPK1, RIPK3 a MLKL u GAL-3 KO myší liečených cisplatinou ako u GAL{5}} myší liečených cisplatinou naznačujú, že vyradenie GAL-3 je spojené s významné zvýšenie proteínov nekroptózy, čo naznačuje antinekroptotickú úlohu GAL-3.

Okrem toho sme preukázali výrazne vyššie hladiny proapoptotických proteínov; štiepená kaspáza-3, štiepená PARP, TRAIL, FAS a apoptotické telá vobličkypodľa ATN.

Počas ATN umožňuje permeabilizácia lyzozomálnej membrány translokáciu katepsínu D a katepsínu B z lyzozómu do cytosólu, kde môže vykonávať svoju proapoptickú funkciu. Cytosolický katepsín D štiepi proteín Bid na tBid, čím spúšťa inzerciu proteínu Bax do mitochondriálnej membrány. To vedie k uvoľneniu cytochrómu c z mitochondrií do cytosolu a aktivácii pro-kaspáz 9 a 3 [41]. V tejto štúdii imunofluorescenčné farbenie a koncentrácia proteínu ukázali významne vyššiu expresiu intracelulárneho GAL-3, cytoplazmatických aj jadrových frakcií, v ATN vobličkyGAL-3 divých myší v porovnaní s kontrolnými myšami.

Takže vyššie hladiny proapoptotických proteínov; štiepená kaspáza-3, TRAIL, FAS a apoptotické telá vobličkycisplatinou liečených GAL-3 KO myší ako u cisplatinou liečených GAL-3 divokých myší naznačuje antiapoptotickú úlohu GAL-3. Zistilo sa, že GAL-3 sa kriticky podieľa na apoptóze v závislosti od jej subcelulárnej lokalizácie. Štúdie ukázali, že intracelulárny GAL-3 môže inhibovať apoptózu [42-44]. Na podporu antiapoptickej úlohy GAL-3 sme identifikovali výrazne vyšší počet buniek exprimujúcich fosfo-NF-κB, beta-katenín a Wnt proteíny v obličkách GAL liečených cisplatinou{{15} } divoké myši ako myši GAL{16}} KO. NF-KB je transkripčný faktor, ktorý hrá dôležitú úlohu pri regulácii zápalu, bunkovej proliferácie a prežívania buniek. Fosforylácia hrá rozhodujúcu úlohu pri aktivácii NF-κB po prúde všetkých týchto stimulov [45]. NF-κB je teraz uznávaný ako dôležitý prispievateľ k prežitiu buniek a ochrane pred apoptózou [46]. Ukázalo sa, že proteíny Wnt majú ochranné účinky na poškodené bunky prostredníctvom ich antiapoptickej funkcie prostredníctvom aktivácie -katenínu a c-Myc [47].

Wu a kol. tiež ukázali významné zvýšenie p-NF-KB vobličkys ATN [48]. Wang a kol. preukázali aj up-reguláciu signálnej dráhy Wnt/-katenínu pri akútnom poškodení obličiek [49]. Štúdie ukázali, že NF-κB sa podieľa na indukcii GAL-3 [50], ako aj GAL-3 sa podieľa na aktivácii NF-κB [51]. Je zaujímavé, že sa zistilo, že GAL{10}} je novým väzbovým partnerom -katenínu [52].

Tieto zistenia naznačujú, že antiapoptotická úloha GAL-3 môže byť sprostredkovaná aj prostredníctvom aktivácie dráh NF-κB a Wnt/-katenínu. Zdá sa, že GAL-3 spája tieto dráhy prenosu signálu na prežitie skúmané v našej štúdii. Tieto cesty majú medzi sebou aj krížovú komunikáciu na rôznych úrovniach. Hráči Wnt/-katenínovej dráhy modulujú mnohé zo svojich účinkov prostredníctvom interakcie s NF-κB a recipročne NF-KB tiež ovplyvňuje Wnt/-katenínovú signálnu dráhu [53]. Preto je pochopiteľné, že GAL{12}} hrá ústrednú spojovaciu úlohu v dráhach prenosu signálu pre prežitie.

Naša štúdia demonštruje, že prítomnosť alebo neprítomnosť intracelulárneho GAL-3 je spojená s významnými zmenami v proapoptotických, pronekroptotických a prosurvival proteínoch v ATN indukovaných cisplatinou a že vysoké hladiny GAL-3 v obličkových tubuloch sú sprostredkovanie antiapoptotického, antinekroptotického a prosurvivalového prostredia, ktoré môže formovať budúci priebeh ochorenia. To naznačuje ochrannú úlohu GAL-3 pri akútnej ATN indukovanej cisplatinou, ktorá je podporovaná výrazne nižšími plazmatickými hladinami močoviny a kreatinínu u myší liečených divokou cisplatinou GAL-3 ako GAL-3 KO myši liečené cisplatinou (obr. 13).

Záver

GAL-3 môže ovplyvniť prežitie a smrť buniek prostredníctvom interakcie s nekroptotickými, apoptotickými a pro-prežitkovými proteínmi v obličkových tubuloch počas akútnej tubulárnej nekrózy vyvolanej cisplatinou.

Poďakovanie

Autorské príspevky

Všetci autori skontrolovali a schválili predloženú verziu rukopisu. SA predstavil koncept, navrhol štúdiu, analyzoval a interpretoval údaje, navrhol čísla a napísal dokument. GJ vykonal pokusy na zvieratách a techniku ​​ELISA, MS vykonal imunohistochemické a imunofluorescenčné farbenie a súvisiace spracovanie tkaniva. HT vykonala pokusy na zvieratách a techniku ​​ELISA. JY vykonal biochemickú analýzu funkcie obličiek a predložil výsledné údaje.

Vyhlásenie o zverejnení

Autori vyhlasujú, že nemajú žiadne konkurenčné záujmy.

Referencie

1 Lameire NH, Bagga A, Cruz D, De Maeseneer J, Endre Z, Kellum JA, Liu KD, Mehta RL, Pannu N, Van Biesen W, Vanholder R: Akútne poškodenie obličiek: rastúci globálny problém. Lancet 2013; 382:170-179.

2 KDIGO: Pokyny pre klinickú prax pre akútne poškodenie obličiek. Kidney Int 2012;2:1–138.

3 Schumer M, Colombel MC, Sawczuk IS, Globe G, Connor J, O'Toole KM, Olsson CA, Wise GJ, Buttyan R: Morfologické, biochemické a molekulárne dôkazy apoptózy počas reperfúznej fázy po krátkych periódach renálnej ischémie Am J Pathol 1992; 140:831-838.

4 Schumer AT, Davies DR, McLaren AJ, Cerundolo L, Morris PJ, Fuggle SV: Apoptóza pri ischemickom/reperfúznom poškodení ľudských renálnych aloimplantátov. Transplantácia 1998; 66:872-876.

5 Degterev A, Huang Z, Boyce M, Li Y, Jagtap P, Mizushima N, Cuny GD, Mitchison TJ, Moskowitz MA, Yuan J: Chemický inhibítor neapoptickej bunkovej smrti s terapeutickým potenciálom pre ischemické poškodenie mozgu. Nat Chem Biol 2005;1:112–119.

6 Vandenabeele P, Galluzzi L, Vanden Berghe T, Kroemer G: Molekulárne mechanizmy nekroptózy: usporiadaná bunková explózia. Nat Rev Mol Cell Biol 2010;11:700-714.

7 Chen X, Li W, Ren J, Huang D, He WT, Song Y, Yang C, Li W, Zheng X, Chen P, Han J: Translokácia proteínu podobného kinázovej doméne zmiešanej línie na plazmatickú membránu vedie k nekrotickej bunke smrť. Cell Res 2014;24:105–121.

8 Cai Z, Jitkaew S, Zhao J, Chiang HC, Choksi S, Liu J, Ward Y, Wu LG, Liu ZG: Pre nekroptózu indukovanú TNF je potrebná translokácia trimerizovaného proteínu MLKL cez plazmatickú membránu. Nat Cell Biol 2014;16:55–65.

9 Wang Y, Liu Y, Liu Y, Zhou W, Wang H, Wan G, Sun D, ​​Zhang N, Wang Y: Polymérny prekurzor cisplatiny na báze pululanu na cielenú terapiu proti hepatocelulárnemu karcinómu. Int J Pharm 2015;483:89–100.

10 Pablo N, Dong Z: Nefrotoxicita cisplatiny: mechanizmy a renoprotektívne stratégie. Kidney Int 2008;73:994–1007.

11 Mi XJ, Hou JG, Wang Z, Han Y, Ren S, Hu JN, Chen C, Li W: Ochranné účinky maltolu na nefrotoxicitu vyvolanú cisplatinou prostredníctvom signálnych dráh PI3K/Akt a p53 sprostredkovaných AMPK. Sci Rep 2018;8:15922.

12 Ozkok A, Edelstein CL: Patofyziológia akútneho poškodenia obličiek vyvolaného cisplatinou. Biomed Res Int 2014;2014: 1–17.

13 Hughes RC: Sekrécia galektínovej rodiny cicavčích proteínov viažucich sacharidy. Biochim Biophys Acta 1999; 1473:172-185.

14 Liu FT, Patterson RJ, Wang JL: Intracelulárne funkcie galektínov. Biochim Biophys Acta 2002;1572:263- 273.

15 van den Brûle FA, Waltregny D, Liu FT, Castronovo V: Zmena vzoru cytoplazmatickej/jadrovej expresie galektínu-3 koreluje s progresiou karcinómu prostaty. Int J Cancer 2000;89:361-367.

16 Xue J, Gao X, Fu C, Cong Z, Jiang H, Wang W, Chen T, Wei Q, Qin C: Regulácia galektínom-3-indukovanej apoptózy buniek Jurkat O-glykánmi aj N-glykánmi na CD45. FEBS Lett 2013; 587:3986-3994.

17 Matarrese P, Fusco O, Tinari N, Natoli C, Liu FT, Semeraro ML, Malorni W, Iacobelli S: Nadmerná expresia galektínu-3 chráni pred apoptózou zlepšením vlastností bunkovej adhézie. Int J Cancer 2000;85:545- 554.

18 Oka N, Nakahara S, Takenaka Y, Fukumori T, Hogan V, Kanayama HO, Yanagawa T, Raz A: Galektín-3 inhibuje apoptózu indukujúcu ligandom indukovanú apoptózu súvisiacu s faktorom nekrózy nádorov aktiváciou Akt v ľudskom močovom mechúre rakovinové bunky. Cancer Res 2005;65:7546-7553.

19 Hashmi S, Al-Salam S: Galektín-3 je exprimovaný v myokarde veľmi skoro po infarkte myokardu. Cardiovasc Pathol 2015;24:213-223.

20 Zhang S, Li R, Dong W, Yang H, Zhang L, Chen Y, Wang W, Li C, Wu Y, Ye Z, Zhao X, Li Z, Zhang M, Liu S, Liang X: RIPK3 sprostredkováva renálne tubulárne apoptóza epitelových buniek pri akútnom poškodení obličiek vyvolanom endotoxínom. Mol Med Rep 2019;20:1613-1620.

21 Liyanage T, Ninomiya T, Jha V, Neal B, Patrice HM, Okpechi I, Zhao MH, Lv J, Garg AX, Knight J, Rodgers A, Gallagher M, Kotwal S, Cass A, Perkovic V: Celosvetový prístup k liečbe pre konečné štádium ochorenia obličiek: systematický prehľad. Lancet 2015; 385:1975-1982.

22 Turk B, Stoka V: Proteázová signalizácia pri bunkovej smrti: kaspázy verzus cysteínové katepsíny. FEBS Lett 2007;581:2761–2767.

23 Pavlock GS, Southard JH, Starling JR, Belzer FO: Uvoľňovanie lyzozomálnych enzýmov v hypodermálne perfundovaných obličkách psov. Cryobiology 1984;21:521-528.

24 Werle B, Jülke B, Lah T, Spiess E, Ebert W: Frakcia katepsínu B aktívna pri fyziologickom pH 7,5 má prognostický význam pri skvamocelulárnom karcinóme ľudských pľúc. Br J Cancer 1997;75:1137-1143.

25 Wang C, Jiang Z, Yao J, Wu X, Sun L, Liu C, Duan W, Yan M, Sun L, Liu J, Zhang L: Účasť katepsínu B na emodínom indukovanej apoptóze v HK-2 Bunky. Toxicol Lett 2008;181:196–204.

26 Suzuki C, Tanida I, Ohmuraya M, Oliva Trejo JA, Kakuta S, Sunabori T, Uchiyama Y: Nedostatok katepsínu D v proximálnych tubulárnych bunkách obličiek má za následok zvýšenú citlivosť proti ischémii obličiek/reperfúznemu poškodeniu. Int J Mol Sci 2019;20:1711.

27 Lameire N, Van Biesen W, Vanholder R. Akútne zlyhanie obličiek. Lancet 2005;365:417-430.

28 Yu W, Chen Y, Dubrulle J, Stassi F, Putluri V, Sreekumar A, Putluri N, Baluya D, Lai SY, Sandulache VC: Cisplatina vytvára oxidačný stres, ktorý je sprevádzaný rýchlymi zmenami v centrálnom metabolizme uhlíka. Sci Rep 2018;8:4306.

29 Aydinoz S, Uzun H, Cermiketal G: Účinky rôznych dávok hyperbarického kyslíka na nefrotoxicitu vyvolanú cisplatinou. Renálne zlyhanie 2007;29:257–263.

30 Siddik ZH: Cisplatina: spôsob cytotoxického účinku a molekulárny základ rezistencie. Oncogene 2003;22:7265–7279.